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薄层层析法检测残杀威
残杀威为氨基甲酸酯类杀虫剂.氨基甲酸酯类型很多,其中部分类型毒性较大,常引起中毒的是N-甲基氨基甲酸酯类,残杀威就是其中之一.由于氨基甲酸酯类杀虫剂近年来较广泛地使用,其所引起的食物中毒、误服以及投毒事件时有发生.在临床上抢救中毒患者时,能否快速准确地确定毒物种类对拯救患者生命至关重要.由于残杀威为非常规理化检验项目,目前尚无标准检验方法.经查阅文献,目前国内外常用的检测残杀威的方法包括气相色谱法,气相色谱-质谱法,液相色谱法,液相色谱-质谱法及薄层层析法等[1～4].其中薄层层析法(TLC)无需特殊设备,简便易行,可同时分析多个样品,非常适用于在基层单位应用,尤其适用于食物中毒现场样品的快速分析工作.本文对薄层层析检测残杀威的方法进行了实验,并加以优化改进;同时提供了样品前处理方法.
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尿素酶预处理-气相色谱-质谱法选择性筛查遗传代谢病高危患儿327例初步研究
目的通过对遗传代谢病高危患儿尿液成分进行生化分析,筛查遗传代谢病,为临床诊断和治疗提供实验依据.方法收集遗传代谢病高危患儿尿液标本,经去尿素、加内标、除蛋白、真空干燥、三甲基硅烷基衍生等处理后,应用气相色谱-质谱联用仪分析尿液中有机酸、氨基酸、糖类、多醇、嘌呤、嘧啶等成分.这一流程在国际上被称为尿素酶预处理-气相色谱-质谱法.结果对来自中国大陆6省、区和直辖市的327例遗传代谢病高危患儿的尿液标本进行检测,共筛查出遗传代谢病16种27例,阳性率为8.26%,其中高苯丙氨酸血症、甘油尿症和Leigh综合征各3例,丙酸血症、甲基丙二酸尿症、von Gierke病、果糖-1,6-二磷酸酶缺陷病、果糖尿症各2例,多种羧化酶缺陷病、戊二酸血症Ⅰ型、枫糖尿病、高甘氨酸血症、3-氨基异丁酸尿症、半乳糖血症、瓜氨酸血症Ⅱ型及Fanconi综合征各1例.经临床干预虽然仍有部分患儿预后不良,但多种羧化酶缺陷病、甲基丙二酸尿症、半乳糖血症等患儿获得较好的治疗效果.其余患儿的病情有待追踪观察.结论应用尿素酶预处理-气相色谱-质谱法分析尿液成分,是筛查某些遗传代谢病的有效方法,检测结果可为患儿的诊断和治疗提供有效指导.
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应用二维电泳及质谱法筛选胰腺癌血清标志物
在中国,胰腺癌发病率逐渐增加,目前其肿瘤相关致死率已跃居第6位[1].早期发现是胰腺癌得以及时治疗的前提之一.目前缺乏理想的胰腺癌血清学标志物.蛋白质组学为肿瘤研究提供了新的思维和技术平台[2].在本研究中,我们初步探讨了二维电泳及质谱法筛选胰腺癌血清标志物中的应用,并希望发现一些与胰腺癌相关的标志物,为胰腺癌的早期诊断提供线索.
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质谱分析食管癌组织磷脂酰胆碱快速判定肿瘤边界的应用
目的 探讨内部萃取电喷雾电离质谱(iEESI-MS)分析技术在快速区分食管癌组织与癌旁正常组织边界中的应用价值,研究磷脂酰胆碱(POPC)等磷脂类物质差异性表达的生物学意义.方法 采用自主设计的取样器和自主开发的iEESI-MS技术,在不进行样本预处理的前提下,对我院26例食管癌患者配对的食管癌组织及癌旁正常组织进行质谱分析;iEESI-MS参数:正离子模式,质谱扫描范围质荷比(m/z)为50～2 000 Da;电离电压为+4.5 kV;离子传输管温度为150℃;离子传输管电压为35 V;透镜电压为100 V;其他质谱参数均由LTQ-MS系统自动优化,获得其iEESIMS指纹谱图;用Matlab软件对样本iEESI-MS指纹谱图数据进行分析,得到主成分分析(PCA)结果;相对丰度数据用SPSS 19.0软件进行分析.结果 本方法能在1min完成精确取样、质谱检测和数据分析;食管癌组织与癌旁正常组织在m/z 567、611、655、699、743、771、783、787、799、882等处的相对丰度差异有统计学意义(P＜0.05),其中食管癌组织中m/z 783、799比较于癌旁正常组织显著增加,多级碰撞诱导解离实验(CID)证实m/z 783为磷脂酰胆碱钠盐(POPC+ Na+),m/z 799为磷脂酰胆碱钾盐(POPC+ K+),食管癌组织中POPC+ Na+及POPC+K+在质谱指纹谱中相对丰度高于癌旁正常组织(m/z 783:7.45±1.65比0.82±0.21,P＜0.05;m/z 799:8.86±1.37比1.23±1.46),差异有统计学意义(P＜0.05);PCA区分两组样本的准确率达96.15％ (25/26).结论 结合组织精密取样器和iEESI-MS技术,可快速得到稳定的食管癌及癌旁正常食管组织质谱信号,基于POPC等磷脂类物质差异表达可区分食管癌组织边界.
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早期黏膜下浸润与非黏膜下浸润结直肠癌的差异蛋白鉴定
目的 构建大鼠早期黏膜下浸润结直肠癌( SICRC)与非黏膜下浸润结直肠癌(SNICRC)模型并鉴定两者的差异蛋白,以筛选早期SICRC的生物学标记.方法 应用N-甲基-N-亚硝基脲( MNU)诱导建立大鼠SICRC与SNICRC模型.二维荧光差异定量双向电泳技术(2D-DIGE)和基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱鉴定出SICRC与SNICRC的差异蛋白.荧光定量Real-time PCR和Westem blot实验验证所选蛋白的鉴定结果.结果 成功建立大鼠SICRC与SNICRC模型.2D-DIGE发现SICRC和SNICRC之间有5个差异表达蛋白(P值均＜0.01).质谱分析鉴定这5个蛋白发现,与SNICRC和正常对照(NC)比较,转凝蛋白(Transgelin)、肽基脯氨酰异构酶A和原肌球蛋白1在SICRC表达上调,而碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)与一种未命名蛋白表达下调.Real-time PCR和Westemblot验证结果显示,Transgelin mRNA和蛋白水平在SICRC组(33.05±0.75、86.63±1.83)高于SNICRC( 22.68±0.89、67.93±2.39)和NC组(18.07 ±0.55、44.25±1.55)(P值均＜0.05),而CAⅡmRNA和蛋白水平在SICRC组(18.01±0.53、41.55±1.89)低于SNICRC组(26.28±1.08、61.11±1.57)和NC组(33.08±0.76、83.43 ±1.61)(P值均＜0.05),变化趋势与蛋白质组学一致.结论 2D-DIGE是筛选早期SICRC与SNICRC差异表达蛋白的有效手段,鉴定的差异蛋白有可能成为临床早期黏膜下浸润结直肠癌筛选和诊断的生物学标记.
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利用二维胶内差示凝胶电泳技术检测胃癌的血清学肿瘤标记物
目的 分离胃癌、胃溃疡、正常人之间的差异蛋白质,检测胃癌的血清学肿瘤标记物.方法 从定量比较蛋白质组分析入手,利用二维胶内差示凝胶电泳技术(2D-DIGE)分离包括胃癌、胃溃疡和正常人共27例血清样本,以基质辅助激光解吸附电离串联质谱对差异蛋白点进行检测,检索Mascot数据库.结果 共检测出14个差异表达蛋白.正常人和胃溃疡比较有3种差异蛋白质,2种被鉴定出;胃溃疡和胃癌比较发现1个下调的蛋白质;胃癌与正常人中发现10个差异表达蛋白质,6个点在胃癌患者血清中上调.结论 2D-DIGE技术是一项有效的筛选胃癌患者血清中差异蛋白的技术手段,检测出的蛋白质有可能成为胃癌诊断的分子标记物.
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梅克尔憩室患儿差异性蛋白的筛选
目的 采用双向电泳质谱分析筛选梅克尔憩室患儿和无肠道畸形儿童尸检小肠的差异蛋白.方法 取无痛性便血梅克尔憩室患儿憩室顶端全层组织和无肠道畸形儿童尸检小肠组织.分别提取组织总蛋白、双向电泳分离、MALDI-TOF质谱分析、PubMed蛋白质序列检索,筛选得到黏膜差异蛋白.采用免疫组织化学法对憩室组38例患儿及对照组16例组织筛选出来的差异蛋白进行验证.结果 筛选出11项表达差异大于3倍的蛋白,质谱分析及PubMed检索出5项蛋白得分高.其中,膜联蛋白A2(Anx-A2)、表皮生长因子受体(Egfr)低表达,细胞角蛋白9(Cyk9)和人类组织相关抗原Ⅰ(MHC-Ⅰ)在憩室异位黏膜高表达,血红蛋白被认为是憩室血管内残留.免疫组织化学显示Anx-A2在憩室基底层弱表达,对照组阳性表达;Cyk9在憩室壁黏膜层高表达,对照组阴性表达;MHC-Ⅰ在憩室壁黏膜层阳性表达,对照组为弱阳性表达.结论 Anx-A2低表达及Cyk9、MHC-Ⅰ高表达可能与梅克尔憩室发病有关.
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肾母细胞瘤血清蛋白质标记物检测与分期模型构建研究
目的 筛选出肾母细胞瘤患儿特异性血清蛋白质标记物,建立肾母细胞瘤临床分期模型与CT分期进行对照分析,并评价其临床应用价值.方法 应用SELDI-TOF-MS技术检测80例血清标本(术前肾母细胞瘤30例,其他恶性肿瘤30例,正常儿童20例),用ZUCI-Protein Chip Data Analyze System分析软件进行数据处理,结合支持向量机(support vector machine,SVM)建立肾母细胞瘤临床分期模型.结果 筛选出2个m/z位于4153.9和3257.6的蛋白质标记物,区分肾母细胞瘤Ⅲ和Ⅳ期与肾母细胞瘤Ⅰ和Ⅱ期蛋白质谱差异表达模型的敏感性为100%,特异性为93.8%;区分肾母细胞瘤与正常儿童、腹腔实体肿瘤及肾脏其他恶性肿瘤的特异性是100%,敏感性是100%、80.0%、100%;临床分期模型可以特异性地将各期区分开来,其特异性及敏感性均为100%;通过肾母细胞瘤早期诊断模型中的2个m/z(6984.4,6455.5)血清标记物进行分析得出肾母细胞瘤各期情况如下:Ⅳ期相对于Ⅲ期低表达;Ⅲ期相对于Ⅱ期低表达;Ⅱ期相对于工期低表达;Ⅰ期相对于正常儿童低表达;后者相对高表达;临床分期越晚,m/z强度就越低表达.蛋白芯片分期准确性与病理一致,达到100%,在分期定性问题上优于CT(Ⅰ期100%,Ⅱ期85.0%,Ⅲ期85.0%,Ⅳ期75.0%).结论 用SELDI-TOF-MS结合SVM建立的肾母细胞瘤临床分期模型可弥补CT在肾母细胞瘤分期定性问题上的不足.
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高效液相色谱串联质谱法测定人血浆硝苯地平浓度
目的 建立测定人血浆硝苯地平浓度的高效液相色谱-质谱串联(HPLC-MS/MS)分离法.方法 以咪达唑仑为内标,血浆样品经乙腈沉淀,HPLC-MS/MS分离-分析.Diamonsil C18柱(2.1 mm×150 mm,5 μm),流动相:甲醇:水(77.7:23.3)；流速:0.3 mL·min-1.采用电喷雾离子源(ESI),以多离子反应监测方式(MRM)进行正离子监测,硝苯地平和内标咪达唑仑定量分析离子对分别为m/z 369.1/224.2和m/z325.9/291.0.结果 硝苯地平血浆浓度测定方法线性范围为1.205 ～241.000ng·mL-1,r=0.996 9.定量下限为1.205 ng·mL-1,方法回收率85％ ～ 115％.批内和批间RSD＜9％.结论 该方法灵敏、准确、可靠,适用于硝苯地平的人体药动学研究.
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复方罗红霉素片多剂量给药在健康志愿者体内的药动学
目的 研究复方罗红霉素片多剂量给药在健康志愿者体内的药动学.方法 24例健康成年志愿者,男女各半,采用随机分组平行设计,分别多剂量口服复方罗红霉素片、罗红霉素片150 mg+盐酸氨溴索片30 mg,采用串联质谱法测定血浆中罗红霉素和氨溴索的浓度,采用DAS2.1程序分别计算各受试者的药动学参数,并用配对t检验对罗红霉素或氨溴索进行分析.结果 复方罗红霉素片组与两单药合用组相比,罗红霉素和氨溴索的人体药动学参数均差异无统计学意义,复方罗红霉素片中罗红霉素和氨溴索的主要药动学参数Cmax分别为(6 261.67±2 111.12)和(51.42±19.83) ng·mL-1,t1/2分别为(14.70±8.91)和(10.19±1.94) h,AUC0→t分别为(96 055.25±38 428.39)和(679.86±183.90) μg·L-1·h,AUCss分别为(47 767.15±16 097.92)和(372.53±119.18) μg·L-1·h.结论 多剂量给予复方罗红霉素片后,与两单药合用的对照药的药动学特征差异无统计学意义.
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电感耦合等离子体质谱法测定三种贝壳类药材中稀土元素含量
目的 建立测定珍珠母、石决明和牡蛎中15种稀土元素含量的方法.方法 供试品经微波消解后,以铟和铑为内标,用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定.结果 各元素在相应范围内线性良好(r＞0.999),精密度好(RSD＜4%,n＝6),各元素加样回收率为97.0%～105.0%.结论 ICP-MS法检出限低,简便快捷,准确可靠,是贝壳类药材中稀土元素含量测定的可行方法.
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高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法分析克拉屈滨注射液中主要杂质及其来源
目的：利用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ HPLC-Q-TOF-MS）法对克拉屈滨注射液的主要杂质进行结构鉴定，并分析其来源。方法色谱柱Grace C18（250 mm ×4.6 mm，5μm），流动相为10 mmol·L-1乙酸铵溶液-甲醇（80：20），柱温35℃，检测波长为265 nm。以ESI为离子源，在正离子模式下获得克拉屈滨及其主要杂质的质谱图，并推测杂质结构式。分别考察克拉屈滨注射液在pH为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0溶液及光强为4500 lx，5％过氧化氢（ H2 O2），60℃环境中的稳定性。结果通过比较克拉屈滨和主要杂质的裂解途径及其高分辨质量数，结合合成工艺，推断出该杂质为2-氯腺嘌呤，由降解试验推测该杂质可能是克拉屈滨在pH偏低和有氧条件下降解产生。结论HPLC-Q-TOF-MS可快速鉴定克拉屈滨注射液的主要杂质，通过分析杂质的来源，为药品质量控制和工艺优化提供支持。
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电感耦合等离子体质谱法测定枸杞子中铜含量及不确定度分析?
目的：应用电感耦合等离子体质谱法(ICP￣MS)测定枸杞子中铜含量并进行不确定度评定,为评价该方法提供科学依据。方法采用微波消解￣ICP￣MS 法测定中药枸杞子中铜的含量,选取同位素63 Cu 进行测定,分析测定流程中不确定度分量并计算合成不确定度。结果枸杞子供试液中铜含量扩展不确定度为17.367μg.mL－1,含量为(186.740±17.367)μg.mL－1,即原药材中铜含量为(46.685±4.342)μg.kg－1。样品消解、检测设备、标准溶液配制等均为不确定度来源。结论应规范实验操作和仪器使用以保证测量结果准确、可靠。同时,建立中药中重金属及有害元素检测的不确定分析,完善测定方法学考察,减少实验误差,建立标准化实验操作规范。
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HPLC和MS法研究头孢噻吩钠有关物质的种类与含量
目的：：采用高效液相色谱法和质谱法研究头孢噻吩钠有关物质的种类和含量。方法：采用自身对照法对杂质谱进行定量测定，并采用UPLC-MS初步鉴定杂质种类。结果：通过对有关物质的归属和含量的分析研究，确定了可能存在6种物质，根据结构推断6种物质可能有抗菌性和毒性。结论：该方法简便、稳定性和重复性好，可用于头孢噻吩钠有关物质和含量的检查。
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高效液相色谱-质谱联用法测定人血浆中氯吡格雷的浓度
目的:建立人血浆中氯吡格雷浓度测定的高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)法.利于进行新药研究.方法:采用Teknokroma C18色谱柱(100 mm× 2.1 mm,5μm);流动相为甲醇-0.1%甲酸水(80:20);流速0.2 mLmin-1;柱温25℃;选择性离子检测(SRM):氯吡格雷[M+H]+,m/z 322.1/212.1;内标:那格列奈[M+H]+,318.3/166.2;有机溶剂乙醚-正己烷(4:1)液-液提取法进行血浆样品的处理.结果:氯吡格雷和内标那格列萘的保留时间分别在4.4 min和3.7 min,氯吡格雷的线性范围为5～5 000 ngL-1;提取回收率大于75%,方法回收率大于90%,日内、日间RSD小于10%(n=5).结论:本试验方法适用于氯吡格雷制剂的新药临床研究和血药浓度的常规监测.
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尿中苯巯基尿酸的液质联用检测方法研究
目的 建立和完善高效液相色谱-离子阱质谱联用检测尿苯中巯基尿酸(S-PMA)的方法.方法 样品通过液液萃取技术提取后进入Agilent Extend C18色谱柱,流动相为乙酸铵和甲醇的混合物,采用梯度洗脱的方式实现样品的分离.以ESI模式进行质谱数据采集,对所得谱图进行分析.结果 本方法线性回归方程为A=90.2488c+3896.3869,回归系数r=0.9995,线性范围为10～5 000μg/L,检出限为10 μg/L,灵敏度为0.0011μg/L,样品回收率77.8%～81.4%,相对标准偏差RSD为0.9%～1.2%,精密度日内误差为0.9%～1.2%,日间误差为0.9%～1.7%.结论 本研究建立的尿S-PMA高效液相色谱-离子阱质谱联用方法,简捷快速、结果准确,为职业卫生工作中尿S-PMA的日常常规检测奠定了基础.
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无高危因素的脑瘫儿童先天性代谢异常的筛查
先天性代谢异常(inbom errors of metabolism)包括氨基酸、有机酸、糖、脂肪、激素等多种代谢缺陷,系由于遗传性代谢途径缺陷,导致异常代谢物的蓄积或生理必需物质的缺乏.一些先天性代谢异常临床表现缺乏特异性,早期诊断存在一定困难.近几年,随着尿气相色谱-质谱法(CC/MS法)的临床应用,使既往许多易漏诊的先天性代谢异常得到了早期诊断.本研究对我院康复科住院的34例无脑瘫的三大主要致病高危因素(窒息、早产、黄疸)的脑瘫儿童进行了先天性代谢异常的筛查,现将结果报道如下.
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头孢尼西钠杂质谱与市售品杂质谱的相似度研究
目的 采用反相高效液相色谱法研究自制头孢尼西钠(CFNS)杂质谱和市售CFNS杂质谱的相似性.方法 采用自身对照法对杂质谱进行定量测定,用相似度法比较自制CFNS杂质谱和市售CFNS杂质谱的相似性,并用UPLC-MS初步鉴定杂质种类.结果 自制CFNS和市售CFNS的杂质谱均为9个共有杂质,两者杂质谱相似度均>0.99,自制CFNS杂质总含量略低于市售CFNS.结论 自制CFNS杂质谱中杂质种类和总含量与市售CFNS杂质谱中杂质种类和总含量相当,中药指纹图谱相似度评价方法完全适合评价CFNS的杂质谱.
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现代分析仪器在中药新药分析中的应用
随着国内外现代分析技术的发展,越来越多的新技术、新方法被应用到天然药物的研究中.在我国,对中药及其复方的分析仍然是现代仪器分析基本应用领域.此外,随着国家对药品监管力度的加强,药物毒副作用和不良反应也越来越受到人们的关注.因此,对各种检测方法、分析手段的操作简便性、分析速度快慢、应用范围等方而也提出了更高要求,其中包括分光光度法、色谱法、毛细管电泳法及其他联用分析方法等,如色谱-质谱联用技术(GC MS/LC-MS),质谱-质谱联用技术(MS-MS)[1].本文将针对这些分析方法做简要综述.
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应用血清蛋白质指纹谱鉴别结直肠癌与其他恶性肿瘤
目的 建立结直肠癌与其他恶性肿瘤的血清蛋白质指纹谱鉴别诊断模型.方法 收集血清标本235份,其中结直肠癌58例,乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌及肾癌各15例,结直肠良性病30例及正常人57例组成建模组,应用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱检测其蛋白质指纹谱.用Biomarker Patterns软件分析结直肠癌与其他恶性肿瘤患者血清中的差异蛋白后,建立结直肠癌鉴别诊断优分类树模型.再从同期住院或健康体检人群中随机抽取以上诸病种及正常人血清标本各10例组成测试组,盲法验证该模型对结直肠癌的鉴别诊断效能.结果 成功建立了由16种蛋白组成的结直肠癌鉴别诊断优分类树模型.测试模式下对结直肠癌的鉴别诊断准确率83.8%.灵敏度和总特异性分别为86.2%和83.1%.盲法验证显示,预测总准确率为74.4%.结论 应用血清蛋白质指纹谱技术建立的结直肠癌与其他恶性肿瘤的鉴别诊断模型具有较高的敏感性与特异性,值得进一步研究.
