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幽门螺杆菌交叉免疫印迹反应研究
研究背景和目的幽门螺杆菌(Hp)是一种能产生较多分泌蛋白或毒素的细菌,在人胃内可长期定植.感染者早期患者有症状但组织学或内镜下病变轻微.长期慢性感染者常与胃黏膜糜烂、胃十二指肠溃疡、萎缩性胃炎和胃肿瘤相关.人群中约半数有Hp感染,并有聚集性,一旦感染不经治疗多终生带菌.本研究目的是从宿主与Hp之间体液免疫角度研究Hp的长期带菌和致病的机理.
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胃癌相关分泌蛋白CA11与胃癌关系的研究
目的确定 CA11编码蛋白的性质,细胞水平、动物体内的功能,并探索其发挥作用的可能机制,以及与其它已知抑癌基因、癌基因的调控关系.方法将 CA11克隆至 pcDNA3.1/Myc-His(- )A载体. CA11与空载稳定转染胃癌细胞株 7901,细胞爬片后行抗 Myc标签及 8种抑癌基因、癌基因的细胞免疫组织化学分析. CA11与空载稳定转染胃癌细胞株 7901,分别行生长曲线及裸鼠荷瘤实验,流式细胞仪分析细胞周期.结果含有 Myc标签 CA11编码蛋白存在于 CA11转染的胃癌细胞浆、细胞膜上及膜外. CA11稳定转染胃癌细胞株 7901及裸鼠荷瘤实验表明, CA11能显著抑制其生长 [21 d,(292. 29± 28. 76)mm3与 (1 330. 50± 110. 07)mm3比较, P< 0. 01],转染 CA11的胃癌 7901细胞 G1 65. 5、 S 24. 7, 与对照组空载转染 7901细胞 G1 50. 5、 S 37. 1相比, G1期增多而 S期减少. 8种已知抑癌基因、癌基因在 CA11与空载稳定转染胃癌细胞株 7901均无表达.结论证实 CA11编码蛋白为一分泌蛋白 ,在细胞水平及动物体内均能明显抑制胃癌细胞的生长,它与多种已知抑癌基因、癌基因并无相互调节的关系.
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非小细胞肺癌分泌蛋白的蛋白质组学研究
背景与目的:癌细胞分泌蛋白是潜在的血清标志物,而且对肿瘤的早期筛选也具有重要意义.因此,系统、全面地研究肿瘤细胞分泌蛋白对于肿瘤血清标志物的筛选具有重要意义.本研究旨在鉴定肺癌细胞分泌蛋白,为肺癌血清标志物筛选提供实验依据.方法:用含胎牛血清的RPMI-1640培养液培养非小细胞肺癌细胞系A549细胞,收集A549细胞培养液中的蛋白及胎牛血清培养液中的蛋白(对照)进行蛋白双向电泳,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)及生物信息学鉴定A549凝胶上特有的蛋白质点.筛选出人属的蛋白质点后,应用RT-PCR方法检测其在肺癌组织及配对远处肺组织中的表达差异;并检测培养液及血清中锰-超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)水平.结果:鉴定出人属的蛋白质点14个,包括肌动蛋白、α烯醇酶(alpha enolase,ENO1)、Mn-SOD、谷胱苷肽S转移酶P(glutathione S-transferase P,GSTP1-1)、二氢二醇脱氢酶(dihydrodiol dehydrogenase,DDH)、磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1,PGAM1)、葡萄糖依赖性胰岛素释放肽受体(glucose-dependent insulinotropic protein receptor,GIPR)、肽基脯氨基顺反异构酶(peptidyl-prolyl cistrans isomerase A,PPIA)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)、蛋白基因产物9.5(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1,PGP9.5)、peroxiredoxin 1(PDX1)、galectin-1及专利蛋白WO0222660等.RT-PCR检测示ENO1、DDH、PEBP、PGP9.5、PDX1、PGAM1、PPIA在肺癌组织中高表达.酶活性检测发现A549培养液中存在Mn-SOD,且发现非小细胞肺癌患者血清中有高水平的Mn-SOD.结论:本研究首次对非小细胞肺癌细胞的分泌蛋白进行了鉴定;发现多种高表达的非小细胞肺癌分泌蛋白基因,其中首次发现ENO1及PEBP基因在非小细胞肺癌中高表达;Mn-SOD是非小细胞肺癌的分泌型血清标志物.该研究为非小细胞肺癌血清标志物的筛选提供了新的方法和候选分子.
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新基因AY358935的生物信息学分析及功能预测
目的 对新基因AY358935的功能性质进行生物信息分析,为深入研究该基因功能奠定基础.方法 利用生物信息学分析软件,分析新基因AY358935及其编码蛋白的性质、定位、结构、表达谱等特征,并根据相关信息预测其生物学功能.利用Western blotting检测病毒感染早期AY358935的表达变化.结果 AY358935基因进化保守,与马、小鼠、斑马鱼、非洲爪蟾的相似性分别为74%、60%、38%、33%.亚细胞定位于线粒体的可能性大.含有一个N末端信号肽序列和单次跨膜结构,多个磷酸化位点,二级结构主要是α螺旋和无规则卷曲.在正常组织和癌组织表达广泛,并受双链RNA依赖蛋白激酶的表达调控.AY358935蛋白表达在水泡性口炎病毒感染2h后即明显上调.结论初步预测AY358935为具有重要功能的小分子分泌蛋白,可能参与细胞增殖和抗病毒天然免疫调控.
关键词： AY358935 生物信息学 分泌蛋白 双链RNA依赖蛋白激酶 水泡性口炎病毒 -
脂肪细胞因子与胰岛素抵抗
肥胖已成为全球广为存在的公共健康问题,约有11亿成年人处于超重或肥胖状态[1].有研究表明肥胖与胰岛素抵抗(IR)密切相关,脂肪组织是IR的起始部位.而胰岛素抵抗引起的一系列不良代谢和生理变化(胰岛素抵抗综合征)是2型糖尿病和冠心病(CHD)等形成的重要原因.脂肪组织除了作为体内大的能量提供者,它和巨噬细胞也是多种分泌蛋白的来源.这些分泌蛋白统称为脂肪细胞因子,它们在能量代谢的动态控制、机体的营养状况与负责能量摄取和消耗的组织之间的信息交流、胰岛素敏感性的调节方面起着至关重要的作用[2].
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骨唾液酸蛋白检测的临床意义
骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)是骨骼和其他矿化组织中一种重要的非胶原蛋白,其分子量为70～80 kDa,由成骨细胞、破骨细胞以及与骨骼相关细胞合成的磷酸化糖蛋白.它约占骨中非胶原蛋白量的5%～10%,与骨桥蛋白、牙基质蛋白-1、牙质唾液酸蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白同属于SIBLINGs分泌蛋白家族[1].BSP在1964年首次从牛骨中提取得到,至今已从人、兔和猪等的骨中相继分离出该蛋白.BSP是由317个氨基酸组成的分泌蛋白,包含一个16个氨基酸组成的疏水信号序列,引导蛋白进入内质网并分泌到胞外[2].BSP具有4个N-糖基化位点和数个0-糖基化位点,含磷酸化和酪氨酸硫酸化位点[2].
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子宫内膜癌肿瘤标志物研究进展
肿瘤标志物（ tumor marker ）是指由肿瘤细胞分泌的，或是宿主对肿瘤反应而产生的并进入组织或体液中的物质。因肿瘤发生发展的原因尚未明确，肿瘤标志物的定义也还有待进一步完善。肿瘤标志物在肿瘤普查、高危人群的监测、诊断及个体化治疗、预后评判和病情观察等方面具有较大的意义，已成为肿瘤患者的一项重要检查指标，在临床中的应用日益广泛。目前为止，用于子宫内膜癌的肿瘤标志物已有多种，大致可分为：（1）激素受体标志物，如雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、胰岛素受体（IR）等；（2）血清肿瘤标志物，如CA125（carcinoma antigen 125）、CA199、癌胚抗原、人附睾分泌蛋白4（HE4）、甲壳质酶蛋白40（YKL-40）等；（3）肿瘤基因标志物，如癌基因K-ras、cerbB-2，抑癌基因PTEN、p53、nm23等。但这些肿瘤标志物多数灵敏性或特异性不高，联合使用可提高诊断的阳性率。本文就近年来子宫内膜癌主要相关肿瘤标志物的研究进展作一综述。
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应用MPB64单克隆抗体检测液体培养基中结核分枝杆菌的初步研究
目的 探讨应用MPB64单克隆抗体检测液体培养基中结核分枝杆菌的临床应用价值.方法 应用抗酸染色涂片阳性样本进行分枝杆菌培养前处理,接种于BacT/A1ert 3D全自动分枝杆菌培养系统培养基中.在培养监测的同时,每天定时测定培养液中的结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64,比较它们可指示有结核分枝杆菌生长在时间上的差异.结果 在12例涂片阳性样本中,仪器系统对12例样本都指示培养阳性结果,其中10例样本MPB64检测阳性;对12例样本进行分枝杆菌菌鉴定,培养指示阳性、MPB64指示阴性的2例样本为非结核分枝杆菌,培养与MPB64均指示阳性的10例样本为结核分枝杆菌;仪器系统指示培养阳性的平均时间为11.5天,MPB64检测指示有结核分枝杆菌生长的平均时间为6.5天.结论 应用MPB64单克隆抗体检测液体培养基中结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64来指示有无结核分枝杆菌生长具有操作简便、报告结果快速的特点,值得更进一步研究.
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CA19-9、s-ULBP2、Dkk1联合诊断胰腺癌的价值
目的 研究CA19-9、s-ULBP2、Dkk1联合诊断胰腺癌的价值及相关性.方法 选择2016年1月至2017年5月住院胰腺癌患者56例,同期健康体检健康者45例和良性胰腺病患者33例作为研究对象,比较3组血清CA19-9、Dkk1与s-ULBP2表达及与临床病理参数的关系.分析CA19-9、s-ULBP2、Dkk1及联合检测诊断胰腺癌的诊断效能.结果 胰腺癌患者血清CA19-9、s-ULBP2及Dkk1含量明显高于良性胰腺病组及健康对照组(P<0.05).CA19-9、s-ULBP2与TNM分期、组织分化程度有关,且CA19-9与肿瘤部位也有关.联合检测诊断值高于任意指标单独检测.结论 CA19-9、s-ULBP2、Dkk1与胰腺癌关系密切,三者联合检测可提高胰腺癌诊断准确率.
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加强对不稳定型心绞痛诊治重要性的认识
1引言不稳定型心绞痛(unstable angina,UA)是指介于稳定型心绞痛和急性心肌梗死之间的一组临床心绞痛综合征,是由于粥样斑块破裂伴血栓形成和血管收缩使心肌供血减少所致.常因斑块结构不稳定、增大和斑块内巨噬细胞吞噬或分泌蛋白分解酶(如纤溶酶原激活物及基质金属蛋白酶),使斑块纤维帽变薄易损,在躯体用力和血流冲击下产生斑块破裂.此外,T细胞激活、血小板激活、血栓素A,等缩血管物质及血管内皮扩血管功能障碍,致血管收缩或痉挛,在UA发生发展中也起重要作用.
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结核分枝杆菌MPT64蛋白多克隆抗体的制备
目的 利用原核表达系统获取结核分枝杆菌MPT64蛋白,制备并鉴定MPT64蛋白多克隆抗体.方法 提取结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA并以其为模板,PCR扩增获取目的基因MPT64,并插入蛋白表达载体PET-26b(+).将纯化得到的MPT64蛋白免疫新西兰兔,终制备得到MPT64多克隆抗体,通过免疫印迹法鉴定该抗体的特异性.结果 成功获取结核分枝杆菌MPT64基因及其重组蛋白,分子量约为27 kD左右.免疫印迹实验证实,以该重组蛋白为免疫原制备得到的多克隆抗体可特异性识别来自于结核分枝杆菌MPT64基因重组腺病毒疫苗所表达的MPT64蛋白.结论 获得高特异性的结核分枝杆菌MPT64蛋白多克隆抗体,有助于结核分枝杆菌疫苗的研发.
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结核分枝杆菌Mtb8.4 DNA疫苗构建及免疫保护研究
目的评价构建结核菌DNA疫苗pVS84免疫小鼠体外产生细胞因子的能力和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的效果.方法利用基因技术将结核菌Mtb8.4插入pVAXl载体,构建表达结核菌Mtb8.4蛋白(分泌型)的DNA疫苗pVS84.将雌性C57BL/6小鼠分成5组,每组20只,分别用pVS84、pVAXl、plL2S和PBS分别各免疫3次,每次均间隔2周,以等剂量加强免疫2次.另一组用BCG(105CFU)皮内注射免疫1次.每组10只鼠在后一次加强免疫后,无菌取脾培养,检测上清细胞因子.另10只鼠则用结核菌H37Rv经静脉攻击,2周后取脾、肝和肺培养结核菌并进行菌落计数. 结果pVS84免疫组鼠脾淋巴细胞培养上清的mIL-2和mlFN-Y平均含量分别为(290.0±112.9)pg/ml和(501.7±79.4)pg/ml,显著高于3个阴性对照组(P＜0.001),与BCG免疫组无显著性差异(P＞0.05).5个组的平均mIL-6和mIL-10无显著性差异.pVS84免疫组小鼠的脾、肝和肺的平均结核菌载量分别为(39176.9±3702.6)、(18780.1±2535.8)和(24410.3±1846.8)CFU/g,分别低于pVAXl、plL2S和PBS三个阴性对照组的相应器官的结核菌载量(P＜0.001),仅脾结核菌载量显著高于BCG免疫对照组. 结论构建的DNA疫苗pVS84能够刺激机体产生抗结核菌所需的Thl型免疫应答,免疫鼠抵抗H37Rv攻击的能力与BCG接近.
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质粒蛋白pORF5在沙眼衣原体感染细胞中的定位及免疫原性研究
目的 分析沙眼衣原体隐蔽性质粒编码的质粒蛋白pORF5在感染细胞中的定位并初步探讨免疫原性特征.方法 PCR扩增pORF5质粒蛋白编码基因,构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体转化大肠杆菌XL1-blue中诱导表达融合蛋白;融合蛋白经G1utathione Sephamse亲和层析纯化后免疫小鼠,制备单克隆抗体和多克隆抗体,间接免疫荧光技术及免疫印迹鉴定抗体的特异性,并分析pORF5质粒蛋白在感染细胞中的分布特征.采用ELISA方法分析pORF5质粒蛋白的免疫原性.结果 pORF5原核表达重组体成功构建,融合蛋白在大肠杆菌中可溶性表达;pORF5主要分布于宿主细胞胞浆,但也少量分布在EB、RB上;pORF5能与衣原体患者血清及鼠免疫血清发生强烈地免疫反应.结论 pORF5为衣原体分泌蛋白,并具有很强的免疫原性.
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2-型猪链球菌分泌性保护性抗原RfeA的确认
确认RTX家族胞外蛋白A(RTX family exoprotein A,RfeA)为2-型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的分泌蛋白.通过生物信息学软件分析RfeA的氨基酸序列,预测RfeA在SS2中的分布；以纯化的RfeA重组蛋白为免疫原免疫小鼠,制备RfeA鼠多抗血清,间接ELISA检测抗血清效价；以制备的RfeA抗血清为一抗,利用ELISA方法分析RfeA在05ZYH33株培养上清中的分布,通过实验证实生物信息学预测的结果.生物信息学软件分析RfeA氨基酸序列,预测RfeA为SS2分泌性蛋白；ELISA方法分析发现RfeA存在于05ZYH33株培养上清中,是SS2分泌性蛋白.结论实验研究结果与生物信息学预测一致,RfeA为SS2分泌性蛋白的确定为进一步研究RfeA的功能以及在SS2致病过程中扮演的角色奠定了基础.
关键词： 2-型猪链球菌 RTX家族胞外蛋白A 分泌蛋白 -
紫杉醇耐药细胞与敏感细胞分泌蛋白差异凝胶电泳分析
背景与目的 紫杉醇是用于肺癌临床一线治疗的作用于微管蛋白的化疗药物,而耐药是影响其疗效的关键因素.本研究应用蛋白组学技术整体比较紫杉醇耐药细胞与敏感细胞分泌蛋白表达谱,以期发现肺癌紫杉醇耐药相关分泌蛋白标志物,为临床选择有针对性的化疗药物提供依据.方法 收集A549亲代及耐药细胞培养液中的蛋白,应用差异凝胶电泳(DIGE)进行分离,Decyder 6.5软件分析后获得的差异蛋白点通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定.结果 应用DIGE进行分离后,成功获得了蛋白质组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱,Decyder 6.5软件分析获得差异>2倍以上的蛋白质点共有76个,经质谱鉴定了19种蛋白,鉴定的蛋白涉及代谢酶类、细胞外基质降解酶类、粘附分子、细胞因子和信号转导相关蛋白质.结论 本研究首次应用双向电泳技术整体展示了紫杉醇耐药细胞株及敏感细胞株的分泌蛋白表达谱,并分析、鉴定、筛选出与紫杉醇耐药相关的差异分泌蛋白.该研究为非小细胞肺癌血清耐药标志物的筛选提供了新的方法和候选分子.
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脂肪分泌物对脂肪间充质干细胞的诱导研究
目的 研究脂肪分泌物对脂肪间充质干细胞(ADSCs)的诱导作用,探讨脂肪再生机制.方法 利用组织块贴壁法和细胞流式技术分离、鉴定ADSCs,收集含有脂肪分泌物的培养基(CM)作为条件培养基并用来诱导ADSCs(CM诱导组),化学培养基诱导组作为阳性对照组.用普通培养基组作为空白对照组,通过细胞形态学观察脂滴的形成和Real-time PCR技术在基凶水平上对其可靠性进行体外验证.用可溶性明胶海绵作为ADSCs的支架来研究脂肪分泌物在体内对ADSCs的诱导作用,并作HE切片观察.结果 流式细胞术证实所培养的细胞为ADSCs.在体外实验中,CM诱导4d时,CM诱导组中的ADSCs胞浆内出现了明显的脂滴,Real-time PCR显示,与空白对照组比较,相关的成脂基因mRNA表达量也明显增加(P＜0.05);体内实验HE染色结果可以观察到CM诱导组中有明显的血管化生成.结论 脂肪组织分泌物中可能含有能诱导ADSCs分化形成成熟脂肪细胞以及血管化的目标因子.
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基质金属蛋白酶组织抑制物-1与肾脏疾病
基质金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metallo-proteinases,TIMPs)是一组内源性分泌蛋白,一方面可特异性地与相应基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)催化活性中心的锌离子结合封闭其催化活性,抑制正常细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)改建和降解,在各种病理过程,如肿瘤的侵袭、转移、组织纤维化中发挥重要作用;另一方面TIMPs在细胞的生长、增殖和分化及凋亡中亦发挥作用,这种作用与其对MMPs的抑制作用无关.TIMPs共有4种,其中TIMP-1广泛分布于组织和体液中.在肾脏,TIMP-1由系膜细胞、结缔组织细胞、巨噬细胞等产生,其表达异常可能参与了多种肾脏疾病的发生发展过程.本文就TIMP-1及TIMP-1与肾脏疾病的关系作文献综述.
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结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的免疫学特性
目的:研究结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白MPT64的免疫学特性. 方法:用原核表达的MPT64蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果. 分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激,MTT方法检测IFN-γ产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖,并对脾脏细菌负荷计数. 结果:MPT64免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激,淋巴细胞的增殖较显着. MTT方法检测小鼠的IFN-γ量为1024 ng/L,而生理盐水对照组低于80 ng/L. 结论:MPT64蛋白有可能作为新型结核疫苗的组分.
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结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达与鉴定
目的: 构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64重组质粒,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白. 方法: 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出MPT64基因片段,插入pGEM-T-easy载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProEX HTb中,在大肠杆菌DH5α中表达. 结果: 获得结核分枝杆菌MPT64成熟蛋白基因,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致;表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量与文献报道一致;重组蛋白经蛋白印迹实验,在Mr 2.6×104位置有特异条带. MPT64蛋白在宿主菌中表达量约占菌体总蛋白的13.5%. 结论: 基因重组表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于结核病的预防疫苗的研制和皮肤免疫诊断试剂的制备.
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MGr1-Ag维持耐药表型与蛋白激酶C有关
［韩英，时永全，郑永悦，聂永战，张宏博，张淼莉，潘伯荣，樊代明. 世界华人消华杂志，2001;9(5):517-521］ 目的探讨MGr1-Ag维持耐药表型与蛋白激酶C的关系. 方法用免疫细胞化学方法检查MGr1-Ag在胃癌SGC7901细胞系及耐药亚系的表达；ELISA及点印迹方法检测胃癌SGC7901细胞系及其耐药亚系细胞培养上清中MGr1-Ag的表达；免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技术观察MGr1-Ag与PKCα的相关表达；竞争蛋白结合法检测单克隆抗体MGr1-1对PKC活性的影响. 结果 MGr1-Ag在胃癌SGC7901细胞系及耐药亚系均有表达，以耐药细胞表达明显增多；ELISA及点印迹实验证实在表达MGr1-Ag的细胞培养上清中均可检测到MGr1-Ag；耐药细胞PKCα与MGr1-Ag的相关表达较药敏细胞明显增强；单克隆抗体MGr1-1与耐药细胞共同孵育后，耐药细胞PKC的活性减低，以细胞质的PKC降低较明显. 结论 MGr1-Ag可能是一种分泌蛋白，MGr1-Ag维持SGC7901/VCR耐药细胞系的耐药表型可受PKC信号转导通路的调节.(何扬举
