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福司氟康唑合成新工艺
目的 优化福司氟康唑合成工艺.方法 以廉价易得氟康唑为起始原料,使用三氯氧磷进行氯磷酸酯化,之后与苄醇进行缩合,得到中间体c,将中间体c用Pd/C催化,以甲酸铵为氢供体,进行脱苄基,经过酸化,析晶,得福司氟康唑.结果 总收率达70.7％,纯度为98.8％,产品结构经1H NMR确证.结论 本文设计了一条新的合成路线,该合成过程操作简单,起始原料便宜易得,反应条件温和,收率高,易于工业化.
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黄芩素对阿霉素致乳鼠心肌细胞损伤的保护作用机制研究
目的:观察黄芩素对阿霉素所致心肌细胞损伤的保护作用及其NF-κB及JNK信号通路的关系.方法:采用乳鼠心肌细胞培养法,实验分为空白对照组、阿霉素处理组、阿霉素合并黄芩素高中低剂量组.MTT法检测心肌细胞存活率,Western blot法检测NF-κB p65和JNK磷酸化水平.结果:高剂量组黄芩素能够显著对抗阿霉素所致心肌细胞损伤(P＜0.05),并显著抑制炎症通路NF-κB和细胞凋亡通路JNK的磷酸化水平.结论:黄芩素能抑制NF-κB和JNK的磷酸化水平,以对抗阿霉素所引起的心肌细胞损伤.
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脑脊液tau蛋白和磷酸化tau蛋白测定在阿尔茨海默病诊断中的应用价值
目的 探讨脑脊液tau蛋白和磷酸化tau(p-tau)蛋白检测在阿尔茨海默病(AD)诊断中的应用价值.方法 选取2012年4月～2014年4月在中国人民解放军第309医院和佳木斯大学附属医院接受治疗的AD患者(AD组)、血管性痴呆患者(VD组)及非神经系统疾病患者各50例为研究对象,检测并分析患者脑脊液tau蛋白和p tau蛋白的含量.结果 AD组患者脑脊液p-tau蛋白含量为(190.3±83.1)pg/mL,显著高于VD组患者的(73.4±36.2)pg/mL和非神经系统疾病组的(55.4±35.2)pg/mL(P＜0.05);VD组患者脑脊液中p-tau蛋白含量与非神经系统疾病组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).以tau蛋白含量≥370 pg/mL为AD诊断标准时,灵敏度、特异度、检验可靠性和与VD患者鉴别率分别为89.6％、78.8％、82.4％和66.8％;以p tau蛋白含量≥120 pg/mL为AD诊断标准时,灵敏度、特异度、检验可靠性和与VD患者鉴别率分别为93.5％、89.9％、91.7％和82.6％.结论 脑脊液p tau蛋白可作为临床鉴别诊断AD患者的辅助指标.
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内毒素对Akt蛋白表达与磷酸化水平的影响
目的 探讨内毒素脂多糖(lipopolysaecharide LPS)在体内外对Akt蛋白表达和磷酸化水平的影响.方法 不同剂量LPS攻击RAW 264.7细胞,检测不同时相点细胞Akt蛋白表达和磷酸化水平.小鼠腹腔注射LPS 6h后检测肺组织Akt蛋白表达和磷酸化水平.结果 不同剂量LPS攻击RAW264.7细胞,细胞Akt蛋白表达没有显著差异,磷酸化水平增加.内毒素血症小鼠肺组织Akt蛋白表达无显著变化,磷酸化水平降低.结论 LPS在体内外对Akt蛋白磷酸化作用不同,体外Akt蛋白磷酸化水平增高,但内毒素血症小鼠体内出现Akt蛋白磷酸化水平异常降低.
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激酶抑制剂WP1066对前列腺基质细胞JAK2/STAT3影响的研究
目的 研究JAK2信号通路在前列腺基质细胞中的作用及激酶抑制剂WP1066对其表达的影响.方法 采用Western blot检测单纯良性前列腺增生(BPH)者(n=4)和合并重度组织炎症BPH患者(n=4)前列腺组织中的JAK2和STAT3的磷酸化程度来验证其所介导的信号通路的活化情况,并检测其抑制剂WP1066在前列腺基质细胞上抑制JAK2和STAT3由白介素-6(IL-6)带来的活化作用.结果 在BPH合并重度组织炎症的前列腺组织中,JAK2的磷酸化水平(pJAK2)升高,使用WP1066处理细胞并不会降低JAK2或STAT3的表达.但在抑制剂WP1066所处理的细胞上,无论是JAK2还是STAT3都无法检测到磷酸化,表明JAK2-STAT3的信号通路被抑制.使用IL-6可增加pJAK2和pSTAT3的表达,此结果可被WP1066阻断.结论 JAK/STAT信号通路在BPH合并重度组织学炎症前列腺组织中呈现活化状态,激酶抑制剂WP1066可抑制STAT3的活化.
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多囊卵巢综合征患者红细胞胰岛素受体体内自身磷酸化研究
PIR/TIR无差异(P>0.05).结论 伴高胰岛素血症PCOS患者存在胰岛素受体体内自磷酸化异常,这可能是PCOS患者发生IR的分子机制之一.
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JAKs-STATs信号传导途径的研究现状
细胞因子的生物学功能主要是通过"JAKs-STATs"或"Ras-MAPK"信号传导途径实现.自从在干扰素对培养细胞基因转录诱导研究中发现JAKs-STATs细胞因子信号传导途径以来,它一致成为当前细胞因子研究领域的热点.细胞因子受体信号传导的JAKs-STATs途径大致如下:细胞因子与其受体结合诱导受体聚集,引起与之相联系的一个或多个胞浆酪氨酸激酶的JAK家族成员活化,激活的JAKs进一步使通过SH2区域与受体相联系的STAT家族的一个或多个成员的酪氨酸残基磷酸化,后者同源或异源集聚,核转位,与特异的DNA序列结合,改变相应基因的表达,表达细胞因子的特定功能[1～3].
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镁对心血管系统调控作用的研究进展
镁是机体中一种非常重要的二价阳离子,作为一种生理因子在各器官系统的代谢功能调节方面扮演至关重要的角色[1].所有涉及ATP的酶学反应都要求镁的存在,镁与ATP以非共价键结合形成各种激酶的真正底物,镁与ATP结合导致ATP的高能磷酸键不稳定而有利于其转运、磷酸化其他分子[2].临床上涉及镁缺乏的疾病明显多于镁超载所致疾病.特别是在心血管系统方面,镁的缺乏与各类疾病的发病机理存在密切关系[3].机体镁大部分存在于细胞内,而且功能也在细胞内实现,在胞浆内,肌浆网,线粒体以及细胞膜上实现其调节功能.而大量的这些功能已通过动物实验阐明并借以解释人体疾病发病机制.现将镁离子对心血管系统调控作用的研究进展综述如下.
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稳定表达stathmin Ser25磷酸化位点突变的肝癌细胞株的建立
目的:建立稳定表达stathmin Ser25磷酸化位点点突变(stathmin S25A)的肝癌细胞株.方法:采用PCR定点突变的方法构建stathmin S25A的重组质粒,并用酶切和测序技术鉴定突变结果；采用脂质体转染的方法,筛选建立stathmin野生型（wt）和突变型(S25A)的肝癌细胞HCCLM6,用Western blotting进行鉴定.结果:定点突变构建stathmin S25A的重组质粒,测序证实stathmin 25位丝氨酸突变为丙氨酸.将stathmin wt和S25A转染HCCLM6,筛选建立稳定表达的肝癌细胞株,Western blotting检测发现stathmin pS25在stathmin S25A细胞中的表达较stathmin wt和对照组细胞明显下降(P＜0.05).结论:建立了稳定表达stathmin S25A的肝癌细胞株,为研究stathmin位点磷酸化在肝癌发病中的分子机制提供实验模型.
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P38MAPK信号传导通路与炎症性肠病
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)介导了细胞的生长、发育、分裂、死亡、以及细胞间的功能同步等多种细胞生理过程.目前在哺乳动物中已发现和成功克隆了ERK、JNK/SAPK、P38MAPK、BRK5四个MAFK亚族,这些MAPK介导了炎性细胞子、细菌产物、物理、化学应激等多种刺激引起的细胞反应.在生物进化过程中,MAPK信导传导的三级激酶级联反应高度保守,即MAPKKK(MAP kinase kinase kinase)→MAPKK(MAP kinase kinase)→MAPK.细胞受到刺激后,MAPKKK首先被磷酸化而激活,然后转而磷酸化激活MAPKK,激活后的MAPKK通过对苏氨酸和酪氨酸双位点的磷酸化激活MAPK.不同的MAPK被不同的细胞外刺激所调节,并具有不同的底物作用特异性.细胞对特定的刺激起反应,引起特定的细胞生理反应,说明细胞内每条MAPK信号传导通路具有相对独立的功能.其中,P38MAPK在介导炎症、应激等细胞反应中为引人注,是目前信号传导领域研究的热点.本文结合国内外文献综述了P38MAPK的结构特征、组成成员、激活与生物学效应,及其在炎症性肠病发病机制中的作用与治疗前景,旨在为炎症性肠病的诊治研究提供一条新的途径[2].
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蛋白组学中非2D-PAGE的一些新技术
1 引言人类细胞中的全部基因称为基因组,由这些基因编码和调控的蛋白质则称为蛋白质组.人类基因组中有30,000个基因,而人类蛋白组却有100,000多个蛋白质,产生这么多的蛋白质与蛋白质有着复杂的翻译后修饰有关,如磷酸化,乙酰化,糖基化等等.面对如此几倍于基因数量的蛋白质,蛋白组的研究急需高分辨率、高通量和全自动化的蛋白质在线分析和鉴定技术.目前,双相聚丙稀酰氨凝胶电泳(2D-PAGE)与质谱(MS)是分辨和鉴定蛋白质常用的方法,同时也存在许多缺点,人们正在不断改进和发展新技术,加速蛋白组的研究进展.
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高湿环境致大鼠肾功能损害与水通道蛋白-2的表达
目的 观察高湿环境对SD大鼠肾功能的影响,探讨水通道蛋白-2(AQP2)和加压素受体-2(V2R)在高湿环境大鼠肾脏中的表达及其意义.方法 20只SD大鼠随机分为对照组和高湿组,每组10只.高湿组大鼠每日放入人工气候箱10 h[温度25 ℃,相对湿度(RH)为(90±2)%],对照组置常温常湿环境[温度(25±2)℃,RH(55±5)%].处理20 d后,荧光定量PCR检测肾髓质AQP2和V2R mRNA表达水平,Western blot法检测肾髓质AQP2、磷酸化AQP2(p-AQP2)以及V2R的蛋白表达水平.结果 与对照组相比,高湿组大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)显著升高(P＜0.05);肾髓质AQP2和V2R mRNA表达较对照组显著降低(P＜0.01),AQP2、V2R的蛋白表达水平和AQP2的磷酸化水平较对照组显著降低(P＜0.05).结论 高湿环境可对大鼠肾功能造成一定损害,且使V2R和AQP2的表达水平降低,AQP2磷酸化水平也降低,提示V2R和AQP2可能参与了高湿环境引起的肾功能损害的发生发展.
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孕激素受体磷酸化调控的研究进展
孕激素受体属于类固醇激素受体超家族的核转录因子.孕激素与胞质中的PR结合后进入细胞核,能识别绑定到特定基因上游的顺式作用元件上并对特定基因的转录和翻译的速率进行调控[1].孕激素受体可发生磷酸化修饰.
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尖锐湿疣组织p53Ser15蛋白磷酸化的研究
目的 研究临床收集的尖锐湿疣样本中p53Ser15蛋白的磷酸化状态,初步探讨其磷酸化对尖锐湿疣组织不发生癌变的意义.方法 收集了30例临床尖锐湿疣患者的病变组织标本和健康对照,采用石蜡包埋、切片,采用免疫组化的方法进行p53Ser15蛋白的检测.结果 p53Ser15蛋白的检测显示:30份尖锐湿疣皮损组织中25份阳性,阳性率为83.33％,其中强阳性19份,强阳性率为63.33％,阳性表达程度积分为(5.663±0.201)分,p53Ser15在尖锐湿疣皮损中的表达显著高于正常组织(f=39.337,P＜0.01).p53Ser15蛋白主要定位于基底细胞和棘层细胞的细胞浆和细胞核.结论 尖锐湿疣组织中p53Ser15磷酸化呈高表达,保护了抗肿瘤蛋白p53不会被降解,可能是尖锐湿疣不发生癌变的原因之一.
关键词： 尖锐湿疣 p53Ser15蛋白 磷酸化 良性增生病变 -
保肝宁对HSC中NF-kB影响的实验研究
目的:研究中药复方保肝宁对肝星状细胞内NF-kB活性的影响.方法:给正常wistar大鼠灌胃保肝宁煎剂7d,制备含药血清,将10%的药物血清培养基加入体外培养的活化的肝星状细胞作用不同的时间,细胞增殖检测采用SRB法,细胞培养液中细胞因子的检测采用ELISA法,NF-kB、IkB含量采用Western Blot法检测.结果:复方保肝宁可显著抑制HSC的增值、降低IkB的磷酸化及NF-kB的表达,明显降低HSC分泌IL-6的水平(P＜0.01).结论:中药复方保肝宁对体外培养HSC内NF-kB、IkB表达有抑制作用,可能是其抗肝纤维化的机制之一.
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角蛋白18磷酸化增加结肠癌HCT116细胞自噬并提高其对奥沙利铂的敏感性
目的 研究奥沙利铂(OXA)作用下角蛋白18(K18)磷酸化与结肠癌HCT116细胞自噬和凋亡的关系并分析其可能机制.方法 HCT116细胞分别转染空载质粒、野生型K18和33、52磷酸化位点突变的K18质粒(Ser33/52A),用60 μmol/L的OXA处理细胞,加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或细胞自噬诱导剂雷帕霉素处理细胞.异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexinV-F1TC/PI)双标记结合流式细胞术以及钙黄绿素乙酰甲酯/碘化丙啶(calcein-AM/PI)染色法分析K18及其突变体对细胞凋亡的影响;Western blot法检测K18的磷酸化水平、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、beclin-1的表达.结果 Ser33/52A质粒的转染可以明显降低K18的磷酸化水平,经过OXA处理后,转染K18质粒组的HCT116细胞的凋亡率显著高于空载质粒转染对照组,而Ser33/52A质粒转染的HCT116细胞的凋亡率明显低于空载体和K18质粒转染的细胞凋亡率,K18质粒转染组细胞自噬明显高于空载转染对照组,而Ser33/52A质粒转染组自噬水平明显降低.结论 K18过表达促进HCT116细胞自噬及其对OXA的敏感性,而K18 Ser33和Ser52磷酸化水平的降低则抑制自噬并降低HCT116细胞的凋亡率.
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重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的构建及应用
目的 构建人盘状结构域受体2(DDR2)与IgG Fc段嵌合受体的重组质粒(pFLAG-CMV2-FcDDR2),检测其自主磷酸化水平.方法 设计FcDDR2克隆引物,以质粒pSecTag2B-FcDDR2为模板,PCR扩增IgG Fc段与DDR2跨膜区和胞内区的cDNA序列(FcDDR2),将其插入pFLAG-CMV2真核表达载体中.PCR扩增鉴定并测序验证重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2后,将其转染人胚肾HEK293T细胞,Western blot法验证HEK293T细胞中目标蛋白FcDDR2的表达效率.将pcDNA3.1-DDR2转染HEK293T细胞,给予2型胶原蛋白刺激后作为阳性对照,用小鼠来源抗DDR2抗体免疫沉淀pFLAG-CMV2-FcDDR2阳性的HEK293T细胞及胶原刺激的pcDNA3.1-DDR2阳性的HEK293T细胞,4G10抗体分析DDR2的磷酸化水平,评价FcDDR2的自主磷酸化能力.结果 重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的PCR扩增产物为大小约2800 bp左右的片段,与预期相符,测序验证正确.Western blot结果提示pFLAG-CMV2-FcDDR2转染后的HEK293T细胞,FLAG-FcDDR2表达水平显著上调.免疫沉淀结合Western blot分析提示FcDDR2的磷酸化水平与胶原刺激后的DDR2水平相当.结论 成功构建了pFLAG-CMV2-FcDDR2真核表达载体,FcDDR2的自主磷酸化与胶原蛋白刺激后DDR2的活化水平相当,可以用作DDR2经胶原蛋白刺激后的活化替代形式.
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Kinase-Glo激酶发光法体外测定蛋白激酶A活性
目的:建立一种简便、无害的体外测定PKA激酶活性的非放射性核素方法.方法:采用RT-PCR方法从HEK293细胞的总RNA中扩增PKAα的cDNA,并将PKAα的cDNA克隆至pGEX-6p-1载体中.经纯化后的体外表达蛋白用免疫印迹(Western blot)法进行鉴定.后采用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定表达蛋白GST-PKAα的活性.结果:经过优化诱导条件,我们成功地纯化得到了GST-PKAα的融合蛋白.用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定纯化蛋白GST-PKAα活性.我们还用PKA特异性抑制剂H-89进一步确定了表达蛋白GST-PKAα的活性,并且测定了其IC50值为(35.2±3.97) nmol/L,与报道值一致.结论:Kinase-Glo激酶发光检测法测定PKA激酶活性,操作简便、对人体无害.此方法能有效应用于临床前PKA激酶抑制剂的高通量筛选、PKA激酶新作用靶点的发现以及靶向蛋白PKA磷酸化位点的研究.
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Plk1 330/597位丝氨酸磷酸化突变体对胞质分裂的影响
目的:研究Plk的330/597位丝氨酸的模拟磷酸化突变体Plk1 S330/597D和不能磷酸化突变体Plk1 S330/597A的绿色荧光融合蛋白在HeLa细胞中的定位以及对有丝分裂的影响.方法:将野生型Plk1-GFP质粒、模拟磷酸化型突变体Plk1 S330/597D-GFP质粒和不能磷酸化突变体Plk1 S330/597A-GFP质粒分别转染HeLa细胞株,免疫荧光法检测突变体融合蛋白Plk1 S330/597D-GFP和Plk1 S330/597A-GFP的细胞定位的定位,Western blot法检测上述突变体融合蛋白的表达.通过有丝分裂期的细胞计数,流式细胞仪检测细胞周期,观察转染突变体后HeLa细胞的有丝分裂进程.结果:模拟磷酸化突变体Plk1 S330/597D和不能磷酸化突变体Plk1 S330/597A的融合蛋白能正确表达.突变体在细胞有丝分裂过程中均能正确定位于动点和中体,但不能磷酸化突变体Plk1 S330/597A融合蛋白对HeLa细胞的有丝分裂有明显的抑制作用,使胞质分裂期的细胞数量较对照组明显增多,产生G2/M期阻滞(P＜0.01),并造成染色体分离滞后的现象.结论:Plk1激酶自身的磷酸化状态对其有丝分裂期功能具有重要作用,其330和597位丝氨酸去磷酸化能抑制细胞的有丝分裂,使细胞周期发生G2/M期阻滞.
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MAPK信号通路相关信号转导分子在人乳腺癌细胞系中的表达及活化水平
目的: 检测化疗药物环磷酰胺及表阿霉素对4种乳腺癌细胞增殖的抑制作用, 以及对细胞外信号调节激酶(ERK1/2)及其上游激酶(MEK1/2)蛋白表达及活化水平的影响.方法: 按常规方法培养细胞及制备蛋白电泳样品.应用Western blot检测培养的正常乳腺上皮细胞系MCF-10及MCF-7、 T47D、 Bcap-37、 SK-BR-3乳腺癌细胞系中, ERK1/2和MEK1/2的表达及活化(磷酸化)水平, 以及这两种药物对ERK1/2和MEK1/2的表达及活化的影响.用MTT比色法检测这两种化疗药物对乳腺癌细胞增殖的抑制作用.结果: 与对照MCF-10细胞相比较, 4种乳腺癌细胞系中, MEK1/2、 ERK1/2蛋白的表达及活化水平均明显增高; 两种化疗药物均可抑制乳腺癌细胞的增殖.这两种药物处理的乳腺癌细胞中, MEK1/2、 ERK1/2蛋白的表达及其活化水平明显低于未处理组. 结论: MEK、 ERK蛋白的过度表达及活化, 可能在人乳腺癌的发生、发展中起重要作用. 这两种化疗药物可能是通过抑制MEK、 ERK蛋白的过度表达及活化来抑制乳腺癌细胞的增殖.
