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无雄激素条件下表皮生长因子诱导前列腺癌细胞系增殖及雄激素受体磷酸化
目的 探讨在无雄激素的条件下,表皮生长因子对前列腺癌细胞增殖及雄激素受体磷酸化的影响.方法 以LNCaP及LAPC4 AR为研究对象,在无雄激素的条件下,EGF处理后,Western blot方法测定LNCaP及LAPC4 AR磷酸化状态;siRNA转染方法敲除Src基因或Ack1基因,观察对AR磷酸化的影响;CCK-8检测细胞增殖;定时定量RT-PCR检测前列腺特异抗原及人体激肽释放酶2 mRNA表达.结果 EGF通过Src激酶和另一未知激酶导致ARTyr-534及AR Tyr-267特异位点磷酸化;相比未用 EGF对照组,EGF能够促进前列腺癌细胞增殖(P＜0.05),增加前列腺特异抗原(P＜0.05)及人体激肽释放酶2 mRNA表达(P＜0.05).结论 EGF通过细胞内非受体酪氨酸激酶使AR特异位点磷酸化,诱导前列腺癌细胞增殖.
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低氧预适应升高小鼠脑内JNK磷酸化水平和蛋白表达
目的探讨C-JUN氨基末端激酶或应激激活蛋白激酶(JNKs/SAPKs)在脑低氧预适应发生、发展过程中的作用.方法将小鼠整体低氧预适应模型中BALB/C小鼠随机分为正常对照(H0)、早期(H1～H4组)和延迟性(H5～H6组)低氧预适应等7组.应用SDS-PAGE和Western bolt方法,并结合Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测大脑皮层和海马组织内JNK1和JNK2/3的磷酸化水平及其蛋白表达量的变化.结果在早期低氧预适应形成过程中,随低氧次数的增加,小鼠大脑皮层和海马组织内JNK1的磷酸化水平(未检测到磷酸化的JNK2/3)逐渐升高,且以皮层内(H1和H2组)和海马组织内(H1～H4组)的增高明显(P＜0.05,n=6);而JNK1和JNK2/3只在延迟性低氧预适应(H5～H6组)发展过程中明显上调(P＜0.05,n=6).结论JNK1的激活以及JNK1和JNK2/3蛋白表达量的增高可能分别参与了脑早期低氧预适应和晚期延迟性低氧预适应的发生和发展.
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表皮生长因子促进子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa增殖
目的研究表皮生长因子(EGF)对子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa增殖的影响,并探讨雌激素受体α(ERα)和Ack1在其调控机制中的作用.方法无雌激素环境下,EGF作用于Ishikawa细胞,CCK-8法检测子宫内膜腺癌细胞增殖;Western blot检测细胞ERα及Ack1磷酸化;用酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼处理细胞后,检测Ishikawa细胞增殖和ERα及Ack1磷酸化状态.结果EGF可增强Ishikawa细胞增殖(P<0.05),并促进ERα Tyr-537特异位点磷酸化和Ack1磷酸化;用达沙替尼后,细胞增殖能力下降(P<0.05),ERα Tyr-537特异位点磷酸化和Ack1磷酸化水平下调.结论EGF促进Ishikawa细胞增殖,其机制可能与诱导ERα Tyr-537特异位点磷酸化和激活Ack1激酶通路有关.
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三氧化二砷抑制人肝癌细胞P27kip1 187位苏氨酸磷酸化
目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制与P27kipl第187位苏氨酸(P27Thr187)磷酸化的关系.方法 体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721,2 μmol/L As2O3处理72 h,细胞计数法检测SMMC-7721生长,流式细胞仪检测细胞周期,核质分离、Western Blot及细胞免疫荧光技术检测P27、Thr187磷酸化的P27(p-P27T187)在SMMC-7721细胞中的表达及亚细胞定位.结果 2 ttmoVL As2O3明显抑制SMMC-7721的增殖,细胞周期阻滞在G2/M期.As2O3作用后P27蛋白总量增加,p-P27T187蛋白总量减少,并伴有Cdk2及cyclinE表达下降,同时P27发生从胞质向胞核的易位,p-P27T187核内表达减少.结论 As2O3可抑制P27T187的磷酸化,诱导P27在SMMCa721细胞核中的积聚.
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电针胃经穴的大鼠血清上调胃黏膜细胞ERK磷酸化
目的 探讨电针胃经穴的大鼠血清对胃黏膜细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化的影响.方法 72只大鼠随机分为正常组、模型组、胃经组、胆经组、胃经+PD153035组和胆经+PD153035组,链霉蛋白酶消化法分离胃黏膜细胞,分别用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂PD153035和100 mL/L血清孵育胃黏膜细胞,Western blot检测ERK的磷酸化.结果 胃经组和胆经组胃黏膜细胞ERK磷酸化明显高于正常组和模型组(P<0.01);胃经组胃黏膜细胞ERK磷酸化明显高于胆经组(P<0.01);当用PD153035阻断EGFR后,胃经+PD153035组胃黏膜细胞ERK磷酸化明显低于胃经组(P<0.01).结论 电针胃经穴的大鼠血清能上调胃黏膜细胞ERK的磷酸化水平,并且存在经脉-脏腑的特异性联系.
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RCAN1/CaNA在颞叶癫痫患者及戊四氮动物模型中的表达变化
目的 观察钙调神经磷酸酶调节因子1(RCAN1)及钙调神经磷酸酶A(CaNA)在颞叶癫痫患者及戊四氮(PTZ)致癫动物模型中的表达变化.方法 收集颞叶癫痫患者手术切除的皮质,并纳入癫痫组(n=18);收集脑外伤患者手术切除的皮质,并纳入对照组(n=11).30只SD大鼠随机分为模型对照组(MC)和PTZ组.分别应用Western blot和免疫组织化学染色检测RCAN1和CaNA的表达情况;应用免疫荧光染色对RCAN1进行定位;应用免疫共沉淀分析RCAN1与CaNA的相互作用.结果 RCAN1定位于神经元的细胞膜;在颞叶癫痫患者及癫痫模型中,RCAN1的表达水平较对照组明显下降(P<0.01),CaNA的表达水平较对照组明显增高(P<0.01);RCAN1与CaNA具有相互作用.结论 在颞叶癫痫患者及癫痫模型中,RCAN1低表达,而CaNA高表达,提示RCAN1可能通过调控CaNA参与癫痫的形成.
关键词： 钙调神经磷酸酶调节因子1 钙调神经磷酸酶A 颞叶癫痫 磷酸化 -
α-Synuclein磷酸化修饰提高MN9D细胞内TH的活性
目的 观察突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)第129位丝氨酸(Ser129)磷酸化修饰对酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)活性的影响.方法 应用重叠延伸PCR定点突变法将129位丝氨酸编码碱基TCT突变为天冬氨酸(Asp,D)编码碱基GAT,获得编码模拟磷酸化α-Syn(S129D α-SYN)的DNA序列,插入逆转录病毒真核表达载体(pLNCX2).包装逆转录病毒颗粒并感染多巴胺能神经细胞MN9D.通过实时定量RT-PCR鉴定α-SYN基因表达,Western blot检测TH磷酸化水平.结果 pLNCX2-α-SYN(wild type/S129D)质粒测序结果正确,并在MN9D细胞中均过表达.野生型α-SYN过表达组同正常对照组相比TH磷酸化水平降低(P＜0.01),而S129D α-SYN组TH的磷酸化水平同正常对照组相比明显升高(P＜0.05).结论 在MN9D细胞中,野生型α-SYN抑制TH的活性,而α-SYN Ser129磷酸化后TH活性明显升高.
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蛋白激酶C对高迁移率蛋白I的磷酸化及其位点分析
纯化的重组人HMGI可被蛋白激酶C(PKC)迅速磷酸化,其化学计量达到2.0～2.5mol/mol,经过蛋白酶水解得到3个磷酸化肽段.磷酸氨基酸分析和氨基酸测序结果表明,该蛋白分子的44和64位的丝氨酸(Ser)是PKC主要的磷酸化位点,其中Ser-64在其第二个DNA结合结构域的C端近旁,而Ser-44则位于第一和第二个DNA结合结构域之间.另外,在75～78位的4个苏氨酸中存在低水平的磷酸化.该结果提示HMGI上PKC的磷酸化位点和CDC2激酶的位点显著不同.后者的位点主要为53和78位的苏氨酸.
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脑衰反应调节蛋白2及其与神经系统疾病关系的研究进展
脑衰反应调节蛋白2 (CRMP2)在神经元发育过程中发挥着重要作用.CRMP2具有多种翻译后修饰方式和生物学功能,其中磷酸化修饰与神经系统疾病相关,但其具体机制及生物学作用尚不清楚,有待进一步研究.CRMP2的研究为防治相关神经系统疾病提供了新的方向.
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糖尿病大鼠动脉血管内皮型一氧化氮合酶丝氨酸磷酸化水平降低
由内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)催化产生的一氧化氮(nitric oxide,NO)在维持血管内皮功能稳态上起着重要作用.糖尿病时血管内皮功能障碍是其血管并发症发生的病理生理学基础,但其机制尚未完全阐明.本研究观察了糖尿病早期动脉血管eNOS蛋白表达及其磷酸化以及NO含量的变化,为进一步探讨糖尿病血管并发症的发生机制提供实验依据.
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不同脂肪酸饮食对大鼠肝脏磷酸化eIF2α的影响
内质网应激(ERS)是指细胞内质网生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理状态.近年来众多证据表明,ERS与胰岛素抵抗(IR)密切相关.本研究通过观察不同类型的脂肪酸对p-eIF2α有无影响,进一步阐明ERS是否参与了脂肪酸饮食对胰岛素敏感性的影响机制.
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哮喘大鼠肺内JNK磷酸化水平的动态变化
气道重塑在哮喘病程中的重要性已被逐渐认识.丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号传导途径是参与哮喘发病机制的一条重要信号通路,我们前期研究发现,细胞外信号调节激酶(external signal regulatedkinase,ERK)磷酸化是哮喘气道炎症和重塑的重要因素[1],C-JUN氨基末端激酶(C-JUNN-terminal kinase,JNK)是MAPK家族的另一重要成员.
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线粒体与阿尔茨海默病
随着人类社会老龄化步伐的加快,老年人口所占比例逐渐增加,老年性痴呆的发病人数随年龄的增高而增多.阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)作为老年性痴呆的一种重要类型,是中枢神经系统的一种渐进性退行性疾病,临床上以认知能力下降、记忆损害和痴呆为主要特征,神经病理上以脑细胞内神经纤维缠结(NFTs)和细胞外老年斑(SPs)为主要特征,其中NFT的主要成分为高度磷酸化的tau蛋白,SPs的主要成分为淀粉样蛋白前体(APP)产生的β淀粉样肽(Aβ).目前,AD的病因研究较多,其中线粒体因在能量代谢、自由基产生、衰老和神经退行性变等方面的特殊作用而倍受关注[1].下面就这方面的研究作一综述.
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一氧化氮激活应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶及p38MAP激酶诱导脑缺血再灌注后神经元凋亡
目的 研究脑缺血区周边组织一氧化氮合酶(NOS)的表达与应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(SAPK/JNK)及p38MAP激酶(p38MAPK)激活的关系;探讨一氧化氮(NO)诱导脑缺血再灌注后神经元凋亡的可能机制.方法 采用TUNEL染色法观察脑缺血再灌注不同时段模型鼠缺血区周边组织凋亡的阳性神经元数量;免疫组织化学、蛋白免疫印迹方法检测活化型Caspase-3、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和SAPK/JnK,p38MAPK及其磷酸化组分的表达.结果 再灌注后1h、2h缺血区周边组织nNOS表达明显增强;自1h起iNOS开始表达,12 h达到高峰.1h p-SAPK/JNK表达较强,以后逐渐减弱;p38MAPK各时段表达均明显增强,以6h为著,p-p38MAPK表达高峰亦在6h.6h活化型Caspase-3开始表达,12 h达到高峰;12 h开始出现TUNEL阳性神经元,24 h达到高峰.结论 缺血区周边组织NOS表达的增强可能通过激活SAPK/JNK及p38MAPK诱导脑缺血再灌注后神经元凋亡.
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人参皂苷Rg1通过调节GSK-3β/PP2A活性减轻皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化
目的 探讨人参皂苷Rg1是否通过调节GSK-3β/PP2A活性而减轻凝聚态Aβ25～35诱导的胎鼠皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化.方法 选用孕期(18±2)d的SD大鼠,分离纯化胎鼠皮层神经元.实验分为阴性对照组、模型组、LiCl处理组、Rg1预处理组.阴性对照组不加任何处理因素;模型组用20μmol/L Aβ25～35作用于皮层神经元12h;LiCl处理组用10mmol/L LiCl和20μmol/L Aβ25～35共同作用于皮层神经元12h;Rg1预处理组分别用5、10、20、40、80μmol/L Rg1预处理皮层神经元24h,再加入20μmol/L Aβ25～35作用12h.通过免疫印迹法和免疫细胞化学染色法检测皮层神经元Tau蛋白磷酸化水平、总Tau蛋白水平和糖原合成酶3β(GSK-3β)表达水平,通过非放射性免疫法检测皮层神经元蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性.结果 模型组Tau蛋白在Ser396、Ser199/202和Thr231位点的磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的蛋白表达水平均增加,但PP2A的活性不受影响;LiCl处理组和Rg1预处理组,Tau蛋白在Ser396、Ser199/202和Thr231位点的磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的蛋白表达水平均降低(P＜0.05).在Rg1预处理组中,以20μmol/L Rg1预处理后Tau蛋白磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的表达水平下降为明显,而且PP2A的活性明显增强(P＜0.01).结论 人参皂苷Rg1可通过上调PP2A活性和下调GSK-3β活性从而减轻凝聚态Aβ25～35所诱导的皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化.
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冈田酸诱导大鼠海马神经元Tau 蛋白过度磷酸化
目的研究蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(OA)对海马神经元微管相关蛋白(Tau)磷酸化的影响,建立Tau过度磷酸化的大鼠模型.方法实验随机分为正常组、二甲基亚砜(DMSO)对照组、OA模型组.模型组又分为OA 12 h、24 h、48 h和2周组.OA模型组大鼠海马CA1区背侧定向注射1.5μl溶于10%DMSO的OA,DMSO对照组注射1.5 μl 10%DMSO溶液.通过Bielschowski染色、免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹分别观察海马神经元形态的改变和磷酸化Tau的表达水平;检测蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性,了解其动态变化与Tau磷酸化的关系.结果OA模型各组与正常组和DMSO对照组比较,Bielschowski染色示海马神经元胞体和突起着色较深,欠均匀,部分神经元轴丘处浓染成斑块状,但各模型组均未见到老年斑和神经元纤维缠结样改变;免疫组织化学染色示模型组海马神经元Thr231和Ser199/202磷酸化Tau蛋白表达增加,与DMSO对照组相比具有显著意义(P＜0.05);蛋白免疫印迹提示OA可引起Tau蛋白Thr231、Ser396和Ser199/202位点发生磷酸化,且不同位点磷酸化的稳定性不同,注射OA 48h后PP2A的活性明显降低,其变化与Tau蛋白Thr231和Ser396位点的磷酸化改变相一致.结论海马CA1区背侧单次注射OA可诱导建立神经元Tau蛋白过度磷酸化的大鼠模型.
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间歇性饥饿对亚硝酸钠所致大鼠海马神经细丝过度磷酸化及空间学习记忆损伤的改善作用
目的 探讨间歇性饥饿对亚硝酸钠诱导的大鼠海马神经细丝(NF)过度磷酸化及空间学习记忆的影响.方法 36只大鼠随机分为对照组、亚硝酸钠组、饥饿+亚硝酸钠组,每组12只.亚硝酸钠组大鼠饮亚硝酸钠水[水中溶入亚硝酸钠粉剂100 mg/(kg·d)],正常喂食;饥饿+亚硝酸钠组大鼠饮亚硝酸钠水,采取饥饿2d,恢复喂食3d的喂食方法,喂养60 d后通过Morris水迷宫实验检测各组大鼠的空间学习记忆能力,免疫印迹和免疫组织化学方法检测大鼠海马NF磷酸化水平与分布.结果 与对照组相比,亚硝酸钠组大鼠第2天至第7天的潜伏期[(53.34±5.28)s,(35.15±10.29)s,(23.52±9.50)s,(14.49±8.70)s,(16.87±8.77)s,(12.31 ±7.12)s]明显大于对照组[(31.24±8.53)s,(12.41±6.54)s,(10.49±6.43)s,(8.61±2.56)s,(7.25±2.12)s,(6.03±1.92)s](P＜0.01或P＜0.05),跨越平台的次数(1.18±0.82)明显小于对照组(3.96±0.54,P＜0.05);饥饿+亚硝酸钠组只有大鼠第2天至第3天的潜伏期[(43.61±1.76)s,(25.25±7.49)s]大于对照组(P＜0.05),第4天至第7天的潜伏期[(19.47±8.30)s,(10.77±6.28)s,(12.05±7.49)s,(10.29±7.52)s]与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).免疫印迹和免疫组织化学结果显示,亚硝酸钠导致海马NF的磷酸化水平升高,而饥饿+亚硝酸钠组与对照组相比无明显变化.结论 饥饿处理可改善亚硝酸钠导致的大鼠海马神经细丝过度磷酸化及空间学习记忆损伤.
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细胞外信号调节激酶/miR-133b在甲基苯丙胺致PC12细胞神经毒性的作用及机制
目的 探讨甲基苯丙胺(MA)致神经细胞毒性过程中细胞外信号调节激酶(ERK)和miR-133b的表达变化及调控机制.方法 用MA建立PC12神经细胞损伤模型,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞活性及镜下形态观察确定MA佳损伤浓度;应用流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平;通过Western blotting技术测定总ERK1/2和磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)的表达变化;并应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)测定miR-133b的表达变化.为进一步分析ERK/miR133b分子通路的作用关系,经U0126特异阻断ERK通路,检测miR-133b的表达变化.结果 给予不同浓度的MA,均可导致PC12细胞损伤,其中800μmol/L MA处理后,大部分胞体变圆,神经突起退缩,神经网络消失.MTT结果显示细胞活性明显下降.进一步的细胞毒性机制分析显示,MA处理后,细胞内ROS水平升高,p-ERK表达增高,miR-133b表达降低;并且给予ERK通路抑制剂U0126(10μmol/L)后,miR-133b表达升高,细胞活性增强,胞内ROS水平降低,镜下细胞损伤改善.结论 MA可通过上调ERK磷酸化抑制miR-133b表达,介导神经元毒性损伤.
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蛋白激酶A RⅡβ结构及功能的研究进展
蛋白激酶A(PKA)是由1个调节亚基(R亚基)二聚体和两个催化亚基(C亚基)组成的四聚体,全酶无活性.R亚基有RⅠα、R Ⅰ β、RⅡα和RⅡβ 4种亚型,分别具有不同的理化性质.RⅡβ亚基氨基端包含1个二聚化/对接结构域,PKA通过此结构域与腺苷酸激酶锚定蛋白结合锚定于细胞的特定位点.羧基端是两个串联的高度保守的环核苷酸结构域,与PKA全酶解聚以及激活有关.两个RC异二聚体通过RⅡβ亚基中的β4 ～β5环相锚定.细胞质中存在足够的MgATP时将导致RⅡβ亚基自身磷酸化.RⅡβ在特定组织表达,主要表达于内分泌腺、脑和脂肪组织.生物信息学分析表明,RⅡβ与其他R亚基的序列有很大差别,只有大约50％的序列相同,提示RⅡβ可能具有不同的生物学功能.因此,目前对PKA RⅡβ的功能及其作用机制的研究已逐渐成为热点.
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p53-Ser392的磷酸化在肿瘤治疗中的作用
磷酸化是p53转录后修饰常见的方式，但对p53-Ser392的磷酸化在肿瘤治疗中的作用及具体机制知之甚少。我们就p53-Ser392的磷酸化状态对野生型及突变型p53功能的影响、放疗化疗因素及蛋白激酶对p53-Ser392的磷酸化水平的调节和p53-Ser392的磷酸化研究意义进行了阐述。
