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环磷酰胺及其代谢产物作用于卵巢癌细胞SKOV3后对PTEN基因的影响
目的 探讨环磷酰胺(CP)及其代谢产物丙烯醛(ACR)作用卵巢癌细胞SKOV3后对人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的影响.方法 选择不同浓度CP及其代谢产物ACR作用重组PTEN蛋白,采用硝基苯磷酸二钠(PNPP)检测PTEN的磷酸化活性,Western blot技术检测蛋白表达,通过生物素与蛋白结合检测药物与蛋白的结合方式;同时分析PTEN基因通路P53/TP53的表达改变;不同药物浓度作用细胞后通过免疫沉淀(IP)方法得到目的蛋白,通过离效液相色谱(HPLC)检测其蛋白磷酸化活性.结果 药物代谢产物作用重组PTEN蛋白后其磷酸化活性随着药物浓度的增高而降低,ACR抗体作用表达随着药物浓度增高表达增多,不同实验组蛋白与生物素表达随药物浓度增高而增多,在细胞中随着药物浓度增高PTEN磷酸化活性降低,TP53蛋白表达随着药物浓度增加而减少.结论 CP代谢产物ACR可通过抑制PTEN蛋白磷酸化活性引起细胞毒性.
关键词： 第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因 环磷酰胺 丙烯醛 磷酸化 活性 -
p120与恶性肿瘤
p120是位于细胞连接处和细胞核内armadillo家族中的亚家族成员.在细胞连接处,它具有正负调控cadherin介导的细胞黏附作用;在核内,与转录因子Kaiso等结合发挥信号转导功能.p120表达的改变会影响细胞增殖、分化和生物学行为,从而诱发肿瘤浸润、转移.本文就p120磷酸化及其细胞黏附、信号转导中的作用综述如下.
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乙型肝炎病毒YMDD的检测与分析
乙型肝炎(简称乙肝)乙肝病毒是一种DNA病毒,主要用拉米夫定治疗,其主要机制是拉米夫定在细胞内经磷酸化后生成三磷酸拉米夫定,与脱氧胞嘧啶核苷(dCTP)竞争,进入合成中的脱氧核糖核酸链,使乙肝病毒不能继续延伸而终止复制.乙肝病毒YMDD变异主要与拉米夫定治疗有关,其产生机制是乙肝病毒在拉米夫定药物诱导下发生DNA聚合酶基因变异,使氨基酸空间结构发生改变,拉米夫定无法与之结合,丧失了抗病毒活性,从而在治疗过程中产生耐药性.
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参苓白术散对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝组织超微结构及AMPKα磷酸化的影响
目的:观察参苓白术散对高脂饮食建立的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝组织超微结构和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPKα)磷酸化的影响.方法:选用SPF级SD大鼠32只,随机分为4组:正常组、模型组、参苓白术散30g/kg剂量组、参苓白术散10g/kg剂量组,每组8只.采用高脂饲料喂养大鼠16周建立NAFLD大鼠模型,各药物干预组大鼠分别灌服30g/kg和10g/kg参苓白术散进行干预,16周后取血和肝组织样本,全自动生化仪检测血清和肝匀浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量;HE染色观察肝组织病理学变化;透射电镜观察肝细胞的超微结构改变;实时荧光定量RT-PCR法检测肝组织AMPKαmRNA表达水平;Westernblot法检测肝组织AMPKα蛋白及其磷酸化AMPKα蛋白(pAMPKα)的表达水平.结果:与正常组比较,模型组大鼠病理证实肝组织脂质蓄积严重,肝组织匀浆和血清TG、TC含量显著升高,肝组织AMPKα mRNA和pAMPKα蛋白水平显著降低,与模型组比较,参苓白术散30g/kg和10g/kg剂量组大鼠肝组织脂质蓄积明显改善,肝组织匀浆和血清TG、TC含量显著降低,肝组织AMPKαmRNA及pAMPKα蛋白水平显著上调,其中参苓白术散30g/kg剂量组疗效更好;但各组大鼠总AMPKα蛋白水平差异无统计学意义.结论:参苓白术散能够改善16周高脂饮食诱导的NAFLD大鼠脂肪代谢紊乱、减轻肝脏脂质蓄积,其作用机制可能与其激活AMPKαmRNA及其蛋白磷酸化水平有关.
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转录因子FOXO1对胰岛β细胞致炎因子产生的影响
目的:观察转录冈子FOXO1(forkhead box O1)对胰岛β细胞炎症因子产生的影响,探讨转录冈子FOXO1在糖尿病发病机制中的作用.方法:运用脂质体转染方法,将pcDNA-FOXO1真核表达载体瞬时转染至NIT-1细胞,通过Western blot检测细胞中FOXO1的过表达情况;以LPS分别处理重组质粒(pcDNA-FOXO1)、空质粒(pcDNA3.1)转染以及未转染的NIT-1细胞24h后,应用ELISA法检测3组细胞致炎因子IL-1β、TNF-α表达情况.以LPS和PBS分别处理NIT-1细胞24h后,ELISA测定两组细胞致炎因子IL-1β、TNF-α表达情况,Western blot比较两组细胞FOXO1蛋白表达及磷酸化水平的差异.结果:FOXO1在瞬时转染48h的NIT-1细胞中实现了过表达;经LPS刺激后,重组质粒转染的NIT-1细胞产生的IL-1β和TNF-α显著高于空质粒转染和未转染组(P<0.01);经LPS处理24h后的NIT-1细胞产生了致炎因子IL-1β和TNF-α,而PBS处理组未见表达.LPS处理组中FOXO1蛋白表达高于PBS处理组.但磷酸化水平显著低于PBS处理组(P<0.01).结论:炎症状态下,过表达转录因子FOXO1可增加胰岛β细胞致炎因子的产生,这主要与非磷酸化FOXO1的相对增多有关,它有望成为糖尿病抗炎治疗的新靶点.
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呼吸道合胞病毒M蛋白核转运
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是有包膜单股负链RNA病毒,是世界范围内婴幼儿主要呼吸道病原体,也是重度免疫抑制者或老年人发病致死的主要原因.RSV M蛋白是RSV非糖基化内膜结构蛋白,其核转运及调节在感染细胞的病毒组装方面起重要作用.M蛋白由IMP识别NLS序列介导核转入,通过与细胞核成分结合而存留在细胞核中,由Crm-1识别NES序列介导核转出,可能通过磷酸化调节其核转运.关于M蛋白核转运的研究,国内尚无相关文献,国外已基本研究出M蛋白核转运所需的介导因素.M蛋白核转运的研究对于利用此机理开发抗RSV复制的药物有利,此过程的机理仍需进一步研究.本文对M蛋白的核转运及其调节进行综述.
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细胞因子受体的信号传导
细胞因子受体信号传导是当前细胞因子研究领域的热点.由于多种细胞因子受体存在共同的信号传导链.使得细胞因子在功能上具有多效性和重复性.细胞因子通过与其受体结合后诱导受体聚化成多肽复合物,其中包含了信号传导链,聚化的受体复合物使受体本身和细胞浆内的酩氨酸激酶磷酸化而活化,激发一股下传的信号流,活化相应的转录因子,从而启动基因的转录,表达细胞因子的特定功能.目前细胞因子受体信号传导的研究已取得了很大进展.本文就细胞因子受体及其聚化,转录因子的活化研究进展综述如下.
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铁离子对神经母细胞瘤细胞tau蛋白磷酸化的影响
目的 研究细胞外铁离子对SH-SY5Y细胞增殖及tau蛋白磷酸化状态的影响.方法 SH-SY5Y细胞于铁离子环境中培养5～30 min后,检测其细胞形态、细胞周期以及胞内tau-1表达的变化.结果 MTT检测细胞OD值随铁离子浓度与作用时间的增加而减少.流式细胞术未发现细胞出现凋亡.低浓度铁离子作用后tau-1免疫荧光强度明显增强,高浓度铁离子或长时间作用后,荧光强度则降低.结论 铁离子对SH-SY5Y细胞有增殖抑制作用,与浓度和时间相关;低浓度铁离子可导致胞内去磷酸化tau蛋白表达增多,但不会诱导细胞凋亡.高浓度铁离子作用后胞内去磷酸化tau蛋白表达未见增多.
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c-Cbl相关蛋白CAP的研究进展
原癌基因c-Cbl相关收是白CAP(c-Cbl associated protein)是有多个结合位点的新信号分子家族成员,Vered Ribon 1998年发现,并分离纯化.CAP与胰岛素刺激、c-Cbl磷酸化以及GLUT4转位密切相关,且是在胰岛素增敏剂作用下PPARγ启动转录的首位信号蛋白,因而成为人们争相研究的热点.以下就CAP研究进展作一综述.
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双岐杆菌胞壁蛋白诱导人肠上皮细胞β-防御素-2基因的表达及NF-κB的活化
本研究应用超声破碎和离心法分离获得双岐杆菌胞壁,2%SDS提取其胞壁蛋白,superdex-200柱层析获得多个蛋白组分.RT-PCR和Northern杂交检测到双岐杆菌全菌、胞壁、胞蛋白均可诱导人肠上皮细胞株HT-29 and Caco-2细胞表达人β-防御素-2(HBD-2)mRNA的显著表达.为了在蛋白质水平上检测其基因的增强表达,构建了HBD-2基因原核表达载体,并制备获得其重组制品的多克隆抗体,ELISA、Western blot和免疫细胞化学等技术均检测到双岐杆菌胞壁组分可刺激肠上皮细胞高效表达HBD-2.P65免疫细胞化学染色检测到在双岐杆菌胞壁蛋白刺激下NF-κB向细胞核移位,IκB和磷酸化IκBwestern blot检测到IκB发生磷酸化和降解,表明基因转录因子NF-κB的活化,提示双岐杆菌胞壁蛋白信号可能通过NF-κB信号转导通路诱导肠上皮细胞β-防御素-2基因的表达.
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利用分子动力学模拟探究力学信号对CD44/FERM复合物结构的影响
在肿瘤细胞的黏附、迁移和增殖中,分化抗原44(CD44)与埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)的FERM结构域结合并招募脾酪氨酸激酶(Syk)至关重要.本文首先观察分析静态及平衡过程中CD44/FERM复合物的构象和接触面残基的相互作用,发现该复合物结构稳定,同时ERM蛋白上非传统的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM-like)以及磷酸化位点Y191和Y205都被包埋在了结构里面,不利于ERM蛋白的磷酸化以及对Syk的招募,影响后续的信号传导.接着采用拉伸分子动力学模拟的方法,模拟力学环境中CD44/FERM复合物的相互作用,比较分析复合物构象的变化以及溶剂可及表面积,发现力学信号可以调控ITAM-like序列以及磷酸化位点Y205的暴露.本研究首次在原子层面揭示力如何经由CD44胞内域调控下游信号的激活,为深入理解肿瘤细胞的黏附迁移路径和抗肿瘤药物的设计提供参考.
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生物材料对血小板黏着斑激酶影响的半体内研究
研究生物材料对血小板信号转导关键成分--黏着斑激酶(FAK)磷酸化的影响.采用PVC、PU50、PU60、PU70和PTFE管与比格犬股动静脉建立半体内循环,循环时间为5 min,运用免疫沉淀和蛋白印迹方法检测管内壁黏附血小板的磷酸化FAK含量和FAK含量.结果表明:PVC和PTFE的FAK含量明显高于三种聚氨酯材料,三种聚氨酯材料中以PU70高,PU60次之,PU50低.五种材料的磷酸化FAK含量以PVC高;PTFE次之;PU70、PU60和PU50低,三种聚氨酯材料之间无明显的差异.由此提示:生物材料与血小板接触后,可能会引起血小板信号转导系统的关键酶FAK发生磷酸化,材料的血液相容性越差,FAK磷酸化越明显;磷酸化FAK含量可考虑作为在分子水平上评价材料血液相容性优劣的有效指标;FAK含量可为材料相容性评价提供参考作用.
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烧伤早期肝组织JNK1及其磷酸化的变化
目的:观察烧伤小鼠早期肝组织JNK1及其磷酸化的时相变化特点,初步探讨烧伤后应激的分子机制.方法:将36只BALB/C小鼠随机分为正常对照组和实验组,实验组给予背部Ⅲ° 15%-20%烧伤.分别于伤后2h、4h、6h、12h、24h用western blot测定肝组织JNK1的蛋白表达及其磷酸化水平.结果:烧伤后各时相点肝组织JNK1在蛋白水平与正常对照相比没有统计学意义的变化;而烧伤后早期(2h)JNK1磷酸化程度显著增加,4h达到高峰,6h时仍显著高于正常对照组水平(P＜0.01),以后逐渐恢复至正常.结论:烧伤早期引起小鼠肝组织JNK1的磷酸化程度显著增强,而蛋白表达无明显变化.
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血红素上调STAT3磷酸化放大脂多糖诱导的小鼠炎症反应
目的 探讨血红素(Hemin)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞及小鼠炎症反应的影响及其机制.方法 RT-PCR检测Hemin对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞促炎症细胞因子TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响,以及Stattic抑制信号转导和转录活化因子3(STAT3)磷酸化后mRNA表达的变化;Western blot检测STAT3磷酸化水平的变化,并在LPS诱导的脓毒症小鼠模型中用ELISA方法进一步验证Hemin对小鼠外周血中TNF-α、IL-6水平的影响.结果 与单独LPS或Hemin处理组相比,LPS+Hemin处理组RAW264.7细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达水平明显升高(P＜0.05),且STAT3磷酸化水平明显上调(P＜0.05);使用Stattic有效抑制了STAT3的磷酸化,并降低RAW264.7细胞TNF-α、IL-6 mRNA表达(P＜0.05);与单独LPS或Hemin腹腔注射组相比,LPS+Hemin组小鼠外周血TNF-α、IL-6水平明显升高(P＜0.05),并可被Stattic所抑制(P＜0.05).结论 Hemin可放大LPS诱导的RAW264.7细胞及小鼠炎症反应,这与STAT3磷酸化水平增加有关.
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SHP-2在造血细胞发育及血液系统肿瘤中的作用研究进展
SHP-2作为1种蛋白酪氨酸磷酸酶,由PTPN11基因编码,参与多种细胞信号转导通路.在造血细胞发育过程中,功能性SHP-2是正常造血细胞生长与发育必需的.同时,在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液系统肿瘤的发生,病理发展过程中,SHP-2的激活突变以及磷酸化都起到了重要的调控作用.SHP-2可能是1个新的潜在的抗血液肿瘤药物靶分子.
关键词： 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2 突变 磷酸化 血液系统肿瘤 -
肌球蛋白调节性轻链磷酸化在心脏疾病中的研究进展
肌球蛋白调节性轻链可通过磷酸化调节心肌收缩、肥大、程序性细胞死亡、纤维化和扭转，从而影响心脏功能。虽然肌球蛋白调节性轻链磷酸化的功能和作用机制并不完全清楚，但磷酸化的异常与心脏疾病具有明显相关性。现就肌球蛋白调节性轻链磷酸化的主要功能、作用机制及其在心脏疾病中的研究进展进行综述，为心脏疾病的研究、治疗奠定基础和提供理论依据。
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心脏型肌球蛋白结合蛋白与射血分数保留的心力衰竭
心脏型肌球蛋白结合蛋白C不仅是心肌粗肌丝的主要组成部分，还是参与调节心肌细胞收缩舒张功能的重要物质之一。过去几十年的研究主要集中在心脏型肌球蛋白结合蛋白基因突变致肥厚型心肌病，以及血清心脏型肌球蛋白结合蛋白水平在急性心肌梗死患者的诊断、判断预后作用。近年来对心脏型肌球蛋白结合蛋白C通过磷酸化来调节心肌舒张功能方面有了新进展，而且，多个研究又发现难治性终末期心力衰竭患者的心脏型肌球蛋白结合蛋白磷酸化水平显著降低。这表明心脏型肌球蛋白结合蛋白可能对于舒张功能不全为特征的射血分数保留心力衰竭的发生发展很重要。在这个情况下，现综述总结心脏型肌球蛋白结合蛋白结构和功能的新研究进展，并对心脏型肌球蛋白结合蛋白与射血分数保留心力衰竭的关系进行简要综述。
关键词： 心脏型肌球蛋白结合蛋白C 射血分数保留的心力衰竭 磷酸化 舒张功能不全 -
心肌肌钙蛋白Ⅰ与心力衰竭
心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌兴奋收缩耦联的主要调节蛋白,是肌肉舒缩的分子开关.因其具有高度的组织特异性及检测的敏感性,自二十世纪九十年代以来,已被作为诊断心肌损伤首选的血清标志物,并且在疾病的预后评估中具有重要价值.研究显示收缩蛋白的降解及磷酸化修饰可能在心肌细胞的损伤及功能下降中起重要作用,而到目前为止,对无症状性心功能不全,临床上还没有敏感的诊断方法,即使对于明显的心力衰竭患者,也缺乏一个判断其心肌损伤程度的指标,血清心肌肌钙蛋白I可能会成为一个比较理想的评价心力衰竭患者的指标.同时对肌纤维蛋白结构和功能的研究也为心脏疾病的诊治提供了新的信息,其中针对肌纤维设计新药就是一个值得开拓和有应用前景的领域.
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细胞外信号调节激酶及应激活化蛋白激酶通路蛋白在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达
目的 通过比较瘢痕疙瘩及正常皮肤中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、应激活化蛋白激酶(c-Jun amino-terminal kinase,JNK)信号通路的表达,探讨其在瘢痕疙瘩形成中的作用.方法 取四川大学华西医院烧伤整形科收治的26例患者皮肤组织,其中行瘢痕疙瘩切除患者(实验组)16例,瘢痕疙瘩形成时间8个月～10年；胸部6例,耳垂4例,会阴部2例,肩部3例,腹部1例；均经病理检查确诊为瘢痕疙瘩.10例整形手术患者自愿捐赠的正常皮肤作为对照组,腹部4例,大腿3例,肩部2例,背部1例.取标本采用Envision二步法行免疫组织化学染色,观察磷酸化及非磷酸化JNK和ERK表达情况,并采用Image Pro Plus 4.5图像分析系统测定积分吸光度(IA)值,观察阳性染色强度.结果 免疫组织化学染色观察显示,对照组正常皮肤成纤维细胞中未见明显的磷酸化及非磷酸化ERK、JNK阳性表达；而实验组主要在成纤维细胞中表达,阳性颗粒主要位于细胞质和细胞核内.实验组磷酸化ERK及JNK的IA值明显高于对照组(P＜0.05),非磷酸化ERK及JNK两组间差异无统计学意义(P＞ 0.05).结论 磷酸化JNK、ERK信号通路蛋白在瘢痕疙瘩中异常高表达,提示该通路可能与瘢痕疙瘩形成密切相关.
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吉非替尼致急性肺损伤——附1例报道
吉非替尼是一种口服的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI),能与三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)竞争酪氨酸激酶结构域中的ATP结合位点,抑制其磷酸化,从而阻断肿瘤细胞信号传导通路,抑制肿瘤细胞的生长、转移.
