首页 > 文献资料
-
雷帕霉素在慢性肾脏病治疗中的应用研究
雷帕霉素( rapamycin),又名西罗莫司,初是由复活岛土壤菌落中分离出来的一种抗真菌药物.此后相继发现了雷帕霉素特异性抑制蛋白——哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其下游的磷酸化核糖体S6蛋白激酶( pS6K)[1].雷帕霉素与其细胞内受体FK506 -结合蛋白(FKBP-12)结合后形成mTOR蛋白抑制复合物,从而发挥特异性抑制mTOR信号通路的生物学作用[2].
-
糖尿病肾病发病过程中肾小球蛋白激酶C活性变化的研究
随着分子生物学及其相关技术的应用,人们发现众多血管活性物质和细胞因子在糖尿病肾病的发生与发展中起着关键性的作用:这些物质的共同信号传导途径或作用往往通过蛋白激酶C(protem kinase C,PKC)介导.我们利用λ-32PATP底物磷酸化的方法,探讨糖尿病肾病发病过程的不同阶段肾小球PKC活性变化规律.
-
骨调素反义RNA在培养的肾小管上皮细胞的表达
骨调素(osteopontin,OPN)是含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)三肽序列(黏附分子结构)的高度酸性的磷酸化分泌性糖蛋白,是很强的巨噬细胞化学趋化和黏附分子.在许多与肾小管间质炎症损伤和纤维化有关的实验动物模型中,肾小管上皮细胞均有OPN的过度表达,巨噬细胞浸润均发生在肾小管上皮细胞过度表达OPN的区域,肾小管上皮细胞OPN的过度表达与巨噬细胞局部浸润的密切相关性,表明OPN是介导巨噬细胞在肾小管浸润并导致炎症损伤和纤维化发生和发展的关键细胞因子.因此,如能阻断肾小管上皮细胞OPN的过度表达,就有可能减少巨噬细胞的局部浸润,延缓肾小管间质炎症损伤和纤维化的发生和发展.反义RNA是与mRNA互补的核苷酸片段,能通过配对碱基间氢键的作用在基因水平上抑制目的基因的表达.
-
EB病毒潜伏膜蛋白1通过蛋白激酶C调节Annexin Ⅰ的丝氨酸磷酸化
背景与目的:在利用磷酸化蛋白质富集结合蛋白质组学技术分析EB病毒潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)调节的磷酸化蛋白质分子时,我们发现了包括Annexin Ⅰ在内的25个新的受EB病毒LMP1调节的磷酸化蛋白质分子.本实验探讨LMPl调节Annexin Ⅰ磷酸化的信号通路.方法:采用鼻咽癌细胞系CNE1和LMP1稳定表达的细胞系CNE1-LMP1,Western blot检测Annexi Ⅰ的蛋白表达水平;免疫沉淀结合Western blot检测Annexin Ⅰ的丝氨酸和酪氨酸磷酸化;激酶分析实验检测蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的活性.结果:LMP1对Annexin Ⅰ的蛋白表达水平没有影响,LMP1上调Annexin Ⅰ的丝氨酸磷酸化水平,而对酪氨酸磷酸化水平没有影响.在CNE1细胞中PKC的相对活性为0.97±0.05,CNE1-LMP1细胞中的PKC相对活性为1.22±0.10,CNE1与CNE1-LMP1细胞之间PKC的活性差异有统计学意义(P＜0.01,n=6),表明LMP1可以上调PKC活性.Annexin Ⅰ的丝氨酸磷酸化水平随PKC活性的变化而变化.结论:EB病毒LMP1通过PKC信号通路调节Annexin Ⅰ丝氨酸磷酸化.
-
蛋白酪氨酸磷酸化水平与乳腺癌细胞株抗失巢凋亡特性的关系
背景与目的:正常上皮或内皮细胞脱离与细胞外基质的联系时会发生失巢凋亡(anoikis),而大多数来源于上皮或内皮的肿瘤细胞则丧失了这种特性,多数相关研究表明肿瘤细胞的抗失巢凋失特性与细胞信号转导的异常密切相关.本研究初步探讨信号分子的蛋白酪氨酸磷酸化水平与肿瘤细胞抗失巢凋亡特性之间的关系.方法:用琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯状带,用流式细胞术以及软琼脂集落形成实验等方法观察正常狗肾脏上皮细胞株MDCK(Madin-Darby canine kidney)和3种乳腺癌细胞株MCF-7、Bcap-37以及MDA-MB-231的抗失巢凋亡特性.同时分析广谱蛋白酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮(genistein)对肿瘤细胞这种特性的抑制作用,并通过Western blot检测3种乳腺癌细胞在悬浮培养与贴壁培养时总体蛋白酪氨酸磷酸化水平的差异.结果:3种乳腺癌细胞均表现出明显的抗失巢凋亡特性,进一步的研究证明这种特性可被染料木黄酮所抑制.Western blot的结果显示与贴壁培养时相比,在悬浮培养的MDCK细胞中所有的蛋白酪氨酸的磷酸化水平均呈现下降趋势;而在肿瘤细胞中,尽管大多数蛋白质酪氨酸的磷酸化水平下降,但是可见有酪氨酸磷酸化水平异常增高的蛋白条带(幅度3.5～6.5倍).结论:3种乳腺癌细胞均具有不同程度的抗失巢凋亡特性,而信号蛋白酪氨酸的异常磷酸化与这些肿瘤细胞的抗失巢凋亡特性有关.
-
肝细胞癌中MAPK和Stat3磷酸化与c-fos和c-jun蛋白表达的关系
目的:探讨肝细胞癌中MAPK和Stat3磷酸化与c-fos和c-iun蛋白表达的关系.方法:利用SP免疫组织化学技术检测55例肝细胞癌(hepatocellulancarcinoma,HCC)及其癌旁肝组织中p42/44MAPK、p-Stat3、c-fos和c-jun蛋白的表达.结果:HCC组织中p42/44MAPK、p-Stat3、c-fos和c-jun蛋白的阳性率和阳性信号强度显著高于癌旁肝组织(P＜0.01);在HCC和癌旁肝组织中p42/44MAPK和c-fos蛋白表达强度呈正相关;p-Stat3与c-jun蛋白亦呈正相关;但p42/44MAPK和p-Stat3信号强度之间均无明显相关性.结论:本资料提示Ras/Raf/MAPK和JAKs/Stat3信号级联异常可能在细胞恶性转化中均起重要作用;癌旁组织中呈p42/44MAPK和p-Stat3阳性的肝细胞可能是具有恶性潜能的癌前细胞群,推测MAPK和Stat3激活可能是HCC发生的早期事件.
关键词： 肝肿瘤 丝裂原激活的蛋白激酶 磷酸化 信号传导和转录激活因子3 信号传导 癌基因 -
2ME2对脊髓损伤大鼠运动功能及Tau蛋白磷酸化的影响
目的 探讨2-甲氧基雌二醇(2ME2)对脊髓损伤大鼠运动功能及Tau蛋白磷酸化的影响. 方法 成年雄性SD大鼠72只按随机数字表法分为假手术组、脊髓损伤组和2ME2治疗组,每组24只.后2组大鼠采用改良的Allen's法制作脊髓损伤大鼠模型.造模后1d2ME2治疗组大鼠腹腔注射2ME2(24 mg/kg),连续7d.脊髓损伤组大鼠注射等剂量生理盐水,假手术组不予干预.造模后1、3、7、14、21、28 d应用BBB评分法对各组大鼠的后肢功能进行评分.造模后7d应用免疫荧光染色和Westem blotting检测损伤脊髓磷酸化Tau蛋白(p-Tau)的表达. 结果 脊髓损伤组和2ME2治疗组大鼠脊髓损伤后1～28 d随着时间的延长BBB评分升高,差异有统计学意义(P＜0.05).损伤后7、14、21、28 d 2ME2治疗组大鼠BBB评分明显高于脊髓损伤组,差异有统计学意义(P＜0.05);与假手术组比较,脊髓损伤组和2ME2治疗组大鼠脊髓p-Tau阳性细胞数、蛋白表达均增加,且2ME2治疗组p-Tau阳性细胞数、蛋白表达(19.05±1.34、0.283±0.094)明显少于脊髓损伤组(10.36±1.28、0.607±0.105),差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 2ME2可改善脊髓损伤大鼠的运动功能,具有一定的神经保护作用,其可能通过降低Tau蛋白磷酸化水平来实现.
-
脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43磷酸化位点分析及S368位点与其关系的研究
目的 观察脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43的磷酸化位点及其S368位点磷酸化水平的变化,探讨其与脑血管痉挛的关系. 方法 新西兰大白兔78只按随机数字表法分为4组:正常对照组(n=6)、单纯脑池注血组(n=24)、甘珀酸(CBX)脑池处理组(n=24)和溶媒脑池处理组(n=24),后3组应用枕大池二次注血法建立兔蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛模型及相应给药,并按1d、3d、7d、14d分成4亚组,每亚组6只.采用磷酸化蛋白富集试剂盒富集各组基底动脉中Cx43磷酸化总蛋白,再利用质谱技术鉴定出其磷酸化位点；应用Western blotting方法分析各组Cx43S368位点磷酸化水平的变化；通过数字减影血管造影技术(DSA)观察各组基底动脉直径变化情况. 结果 (1)质谱技术成功鉴定出Cx43的4个磷酸化位点,分别为Y265、S364、S365、S368.(2)Western blotting结果显示:正常对照组基底动脉Cx43 S368位点磷酸化水平较低(17.0％±2.3％)；单纯脑池注血组及溶媒脑池处理组与正常对照组相比,Cx43 S368位点磷酸化水平在1d、3d、7d、14d各时间点均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05),且以7d表达高,14d开始下降；CBX脑池处理组各时间点基底动脉Cx43 S368位点磷酸化水平显著低于单纯脑池注血组及溶媒脑池处理组,差异有统计学意义(P＜0.05).(3)DSA显示正常对照组第二次与首次造影基底动脉直径的百分比值平均为99.1％±1.3％,单纯脑池注血组、CBX脑池处理组、溶媒脑池处理组分别为66.1％±7.2％、91.3％±5.3％、63.7％±6.6％,CBX脑池处理组基底动脉直径显著狭窄于单纯脑池注血组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 缝隙连接蛋白Cx43 S368位点磷酸化可能与脑血管痉挛密切相关,且其可能是CBX缓解脑血管痉挛的机制之一.
关键词： 缝隙连接蛋白Cx43 磷酸化 脑血管痉挛 -
四氧嘧啶脑室内注射对小鼠学习记忆的影响
目的 研究脑内葡萄糖代谢改变对小鼠学习记忆的影响及其在AD发病机制中的作用.方法 小鼠按随机数字表法分为四氧嘧啶低剂量组(剂量1.5 mg/kg)、四氧嘧啶高剂量组(剂量4mg/kg)和对照组(注射等量0.9%生理盐水),每组7只,前2组小鼠脑室内注射O位N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)转移酶的抑制剂四氧嘧啶,干预脑内葡萄糖代谢.Morris水迷宫实验检测小鼠学习和记忆能力,Western blotting蛋白免疫印迹和免疫组织化学染色分析小鼠脑组织细胞骨架蛋白神经丝的糖基化和磷酸化改变.结果 定位航行实验:四氧嘧啶脑室内注射小鼠平均逃避潜伏期和路径长度较对照组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05);空间探索实验:四氧嘧啶脑室内注射小鼠穿越隐匿平台次数较对照组明显减少,初始角度(小鼠入水时游向和入水点跟平台连线的夹角)明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,四氧嘧啶脑室内注射小鼠神经丝蛋白的磷酸化表达明显增加,相应分子量蛋白的糖基化表达明显减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).与对照脑组织比较,AD脑皮质神经丝的磷酸化表达增加而糖基化表达减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论四氧嘧啶脑室内注射导致小鼠学习记忆能力的减退,其可能和脑内糖代谢改变影响细胞骨架的糖基化和磷酸化有关,并与AD脑内神经丝的糖基化和磷酸化改变相似.
-
七氟烷促进成年大鼠海马神经干细胞增殖
目的 观察七氟烷对体外培养的成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)是否具有增殖作用及可能的分子机制. 方法 常规培养成年NSCs并应用免疫荧光染色巢蛋白进行鉴定.将培养2h的NSCs分别放入含不同浓度(1.3%、1.9%、2.7%、3.3%)七氟烷的密闭容器中,作用2 h后按常规方法 继续培养24h.应用DAPI染色检测NSCs数目的 变化.用Western blot法检测细胞环磷腺苷反应元件结合蛋白(CREB)、磷酸化CREB(pCREB)水平的变化. 结果与空白对照组比较,1.9%、2.7%、3.3%七氟烷组细胞数升高,而且浓度越大,作用越明显,差异均有统计学意义(P<0.05);Western blot检测发现空白对照组和1.3%、1.9%七氟烷组细胞均表达CREB和pCREB,但1.9%七氟烷组细胞pCREB/CREB水平较高,与空白对照组和1.3%七氟烷组比较差异有统计学意义(P<0.05). 结论 七氟烷可促进NSCs的增殖能力,其机制可能与提高了细胞中CREB的磷酸化水平有关.
关键词： 七氟烷 神经干细胞 细胞增殖 环磷腺苷反应元件结合蛋白 磷酸化 -
间隙连接蛋白43在口腔鳞状细胞癌中的研究进展
细胞间隙连接是普遍存在于动物组织中的一种细胞连接形式,介导相邻细胞间的信息、能量和物质的交换.研究表明,间隙连接蛋白43 (connexin 43,Cx43)基因的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关,本文就Cx43异常表达与口腔鳞状细胞癌的相关研究进展作一综述.
-
着丝粒蛋白A与肿瘤发生
癌症是中国人群死亡的首要原因,也是主要的公共健康问题.癌症已经严重威胁人们的健康,肿瘤靶向治疗的研究方兴未艾.作为有丝分裂的重要调控因子,着丝粒蛋白A(CENP-A)通过磷酸化使着丝粒准确装配到染色体上.有丝分裂过程中发生错误会导致染色体的不稳定性、非整倍体的形成及肿瘤的发生,因此有丝分裂相关蛋白的细胞内调控机制成为研究重点.笔者阐述了CENP-A的结构、功能及其与肿瘤发生的关系,并简要介绍了目前与CENP-A调控通路相关的小分子抑制剂的研究进展.
-
组蛋白去乙酰化酶抑制剂应用前景
组蛋白去乙酰化(HDACs)与组蛋白乙酰基转移酶(HATs)染色体由DNA、组蛋白和非组蛋白组成.染色体的基本结构单位是核小体,它由大约146 bp的DNA和组蛋白八聚体组成,组蛋白H2A、H2B、H3、H4各两分子组成八聚体包裹着DNA.40年前就有人提出组蛋白的乙酰化修饰在基因表达调控中发挥作用,现在有大量的证据表明包围DNA的染色质蛋白重建是基因调控表观遗传学的根本机制,这包括组蛋白尾部可逆的转录后修饰如:赖氨酸残基乙酰化、赖氨酸残基和精氨酸残基的甲基化、丝氨酸残基的磷酸化、赖氨酸残基的泛素化和类泛素化.HDACs和HATs决定组蛋白的乙酰化.
-
蛋白激酶D1在烟曲霉介导的NF-κB信号通路激活及转录活性中的作用
目的 研究蛋白激酶D1 (PKDl)在烟曲霉介导的NF-κB信号通路激活及转录活性中的作用,为进一步探讨PKD1在烟曲霉感染引起的肺曲霉病中的作用及其机制奠定基础.方法 首先将GFP、GFP-PKD1表达质粒分别转染人肺腺癌细胞A549和HEK293细胞中,分别将灭活的烟曲霉分生孢子(1×105 CFU/ml)于不同时间处理上述两组细胞,Western blotting证实PKD1的过表达,并检测PKD1的磷酸化活性;其次在A549细胞中分别转染GFP-PKD1、siRNA-PKD1并以灭活的烟曲霉分生孢子处理细胞30 min,分别检测下游NF-κB通路相关信号分子的磷酸化活性;后,将NF-κB-1uc荧光素酶报告基因及内参照报告质粒海肾荧光素酶(pRL-SV40)共转染人表达GFP、GFP-PKDl的A549细胞中,两组细胞在有无烟曲霉分生孢子的作用下处理24 h,收集细胞裂解液,进行双色荧光素酶活性检测.结果 Western blotting证实PKD1的过表达时间依赖性地增强烟曲霉刺激的A549细胞和HEK293细胞中PKD1的磷酸化活性及NF-κB通路中IKB和p65(pS276)的磷酸化活性,反之,敲低PKD1的表达则抑制烟曲霉介导的NF-κB通路中IKB和p65(pS276)的磷酸化活性.过表达PKD1明显增加NF-κB-luc荧光素酶的转录激活活性.结论 PKD1可能在烟曲霉刺激的NF-κB通路的激活及转录活性中起重要作用.
-
ZIP1和ZIP2不同程度激活PKC对钾离子通道的磷酸化
蛋白修饰酶的定向修饰反应是蛋白合成后进行特异、有效修饰的一个关键步骤.ZIP1和ZIP2是两个互为剪切异构体的蛋白,它们既与钾离子通道的Kvb 2亚基结合,又与蛋白激酶c(pkcζ )结合.由于它们的联结作用,使三者形成一个复合物.而ZIP1和ZIP2可不同程度激活pkcζ对钾离子通道的磷酸化,且二者可以相互结合,形成异型多聚体,这就使它们对pkcζ的刺激复杂多变.另外,ZIP1和ZIP2共存于同一种细胞中,并且经神经生长因子刺激后,升高的程度各不相同.这些实验结果提示了pkcζ定向磷酸化的特异性和调控性的分子机理.
-
磷酸化caspase-8在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义
目的：探索Src对caspase-8的磷酸化作用对非小细胞肺癌患者的临床意义。方法应用免疫组化方法检测Src及caspase-8在非小细胞肺癌组织及对照肺组织中的表达，应用Western blot检测非小细胞肺癌组织和对照肺组织的磷酸化caspase-8（p-Y380-casp8）的表达，Kaplan-Meire法分析p-Y380-casp8阳性组和阴性组的无疾病生存情况。结果 Caspase-8与Src在非小细胞肺癌组织和对照肺组织中阳性表达率无显著性差异（P>0.05），免疫组化caspase-8（+）Src（+）的非小细胞肺癌组织中磷酸化caspase-8均阳性表达，磷酸化caspase-8在非小细胞肺癌组织中的阳性率显著高于对照肺组织（52.4%vs 7.1%，P<0.05），磷酸化caspase-8阳性表达非小细胞肺癌患者组术后2年无疾病生存率显著低于磷酸化caspase-8阴性组（32.0%vs 60.3%，P<0.05）。结论磷酸化caspase-8可以成为非小细胞肺癌患者不佳预后的标志分子，为临床非小细胞肺癌患者预后评估提供了全新理论基础。
-
PTEN磷酸酶活性对人乳腺癌ZR-75-1细胞的迁移及粘着斑激酶磷酸化水平的影响
目的:探讨PTEN磷酸酶活性对ZR-75-1人乳腺癌细胞迁移及粘着斑激酶磷酸化水平的影响.方法:用有和无磷酸酶活性的两种PTEN表达质粒(Wt和G129)转染人乳腺癌细胞株ZR-75-1,用人工基底膜侵袭试验检测其转染前后的迁移能力,以Western-blot检测未转染的ZR-75-1和两种表达质粒的ZR-75-1磷酸化粘着斑激酶水平.结果:转染后有磷酸酶活性、无磷酸酶活细胞与未转染ZR-75-1细胞间侵袭抑制率、运动抑制率差异有显著性(P＜0.01).各组细胞间总FAK(粘着斑激酶)水平无明显差异,而WT-PTEN与G129和ZR-75-1组FAK 397位酪氨酸磷化水平有明显差异.结论:PTEN具有抑制乳腺癌细胞ZR-75-1转移的作用,其机制可能与PTEN使FAK去磷酸化有关.
-
Tyrphostin AG555对重组人磷脂酰肌醇3-激酶pll0 β催化亚基的影响
磷脂酰肌醇3-激酶(P13-K)是多磷脂酰肌醇通路中一个重要的效应器和涉及信号转导、细胞转化的关键酶.P13-K根据结构的相似性和底物的特殊性可分为3种类型,其中第一种类型的P13-K是由85 kD(p85 α和p85 β)调节亚基和110 kD(p110 α、p110 β和p110 δ)催化亚基组成的高度同源性的异二聚体,而且p110催化亚基具有激酶的活性,可以磷酸化质膜中的磷脂酰肌醇.P13-K能使磷脂酰肌醇的第三位羟基磷酸化,生成磷脂酰肌醇-3-磷酸;P13-K主要磷酸化磷脂酰肌醇-4-磷酸和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸,生成磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸[(PtdIns(3,4)P2]和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸[PtdIns(3,4,5)P3].PtdIns(3,4)P2和PtdIns(3,4,5)P3在细胞内起到第二信使的作用,它们被认为在细胞分裂中起重要作用.近的研究表明P13-K是一个重要的药物靶点,特异的P13-K抑制剂可望成为新的抗肿瘤药物.
-
溃结通对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎大鼠IκBα/NF-κB p65信号通路磷酸化的影响
[目的]在前期研究基础上,进一步探讨溃结通是否可通过抑制上游核因子κB抑制蛋白α/核转录因子-κB p65(IκBα/NF-κB p65)磷酸化,从而达到抑制溃疡性结肠炎(UC)炎症反应的效果.[方法]采用葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮水建立UC大鼠模型.将SD大鼠随机分为正常组、 模型组、 溃结通高剂量组(灌胃剂量为15 g·kg-1·d-1)、 溃结通低剂量组(灌胃剂量为5 g·kg-1·d-1),柳氮磺吡啶(SASP)组(灌胃剂量为0.3 g·kg-1·d-1),治疗2周后,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法测定结肠组织p-IκBα/IκBα、p-NF-κB p65/NF-κB p65的表达.[结果]溃结通高剂量组p-IκBα/IκBα、p-NF-κB p65/NF-κB p65的蛋白表达明显降低,与模型组、 西药组比较,差异有统计学意义(P<0.001).[结论]溃结通可能是通过阻断NF-κB经典炎症通路的活化起到抗UC炎症作用,且高剂量效果更明显.
-
连接蛋白43磷酸化状态与缝隙连接通道功能的关系
缝隙连接(GJ)是介导相邻细胞间直接通讯的特殊膜结构.连接蛋白43(Cx43)的磷酸化与去磷酸化对GJ通道的功能有非常重要的影响.激活不同的蛋白激酶可引起Cx43的羧基端21个丝氨酸中的12个残基、6个酪氨基的2个残基(247、265)磷酸化;通过点突变方法研究发现,这些特殊部位的磷酸化导致GJ通道功能改变.现就Cx43磷酸化状态与GJ通道功能的关系作一综述.
