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磷酸化蛋白质组学揭示小热休克蛋白27是胶质细胞源性神经营养因子引起神经突触生长的新信号分子
胶质细胞源性神经营养因子(GNDF)是胶质细胞分泌的一种神经营养因子,是胶质细胞对神经元发挥保护作用主要的途径.GNDF对多巴胺能神经元的保护及促生长作用明显,是神经保护治疗帕金森病(PD)首选神经营养因子.而对GDNF信号转导的机制尚不清楚,因此,我们用蛋白质组学的方法寻找参与GDNF信号转导通路的可能信号分子.
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甘珀酸对兔脑血管痉挛时缝隙连接蛋白43磷酸化表达的影响
目的 探讨甘珀酸对兔实验性蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)时缝隙连接蛋白43(Cx43)磷酸化表达的影响.方法 建立兔二次SAH模型,脑池及静脉分别给予甘珀酸,脑血管造影及光镜观察分析基底动脉直径及形态学变化并应用Western blot检测基底动脉Cx43蛋白磷酸化表达的变化.结果 SAH组与正常组相比,脑血管造影及光镜观察结果 证实基底动脉痉挛明显;痉挛动脉肇磷酸化的Cx43(P-Cx43)蛋白表达显著升高,但去磷酸化的Cx43(NP-Cx43)蛋白表达显著减少.甘珀酸脑池处理组及静脉处理组与SAH组相比,脑血管造影及光镜观察结果 证实基底动脉痉挛显著减轻;痉挛动脉壁P-Cx43蛋白表达显著减少,但NP-Cx43蛋白表达显著升高.结论 SAH后,Cx43蛋白磷酸化表达发生变化,脑池或静脉给予甘珀酸能明显缓解SAH后CVS,其作用机制可能与基底动脉Cx43蛋白磷酸化表达变化有关.
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亚低温抑制重型颅脑创伤诱导Tau蛋白过度磷酸化的实验研究
目的 观察亚低温对重型颅脑创伤诱导的Tau蛋白磷酸化的影响.方法 体外研究通过细胞液压冲击仪建立SK-N-SH细胞损伤模型,观察冲击1h、6h和12h后Tau蛋白的磷酸化水平.体内研究通过小动物液压冲击仪建立大鼠重型颅脑损伤模型(2.4 atm),接受或不接受亚低温治疗(33℃,4h).观察液压冲击6h、24 h和72 h后Tau蛋白的磷酸化水平,以及亚低温对此变化的影响.结果 SK-N-SH细胞在液压冲击后,Tau蛋白在Thr231和Ser396位点的磷酸化水平从1h开始升高,到6h左右达到高峰.SD大鼠在液压冲击后,Tau蛋白在Thr231和Ser396位点的磷酸化水平从6h开始升高,到24h左右达到高峰,到72 h仍处于高水平；免疫组化的结果也显示,大鼠脑部海马CA1区和皮质区的Tau蛋白磷酸化水平在Thr231位点也明显增高.亚低温可显著逆转液压冲击诱导的SD大鼠Tau蛋白过度磷酸化(P＜0.01).结论 亚低温可抑制重型颅脑创伤诱导的Tau蛋白过度磷酸化.
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喉癌组织中P16的表达及意义
细胞周期失控是癌变的重要原因.细胞周期素D1(cyclin D1),能激活CDK4,使细胞由G1期进入S期,进行DNA合成,开始增殖[1].新近发现的新型抑癌基因P16可限制此过程[2,3],P16基因位于人类染色体短臂9p21上,在许多肿瘤细胞系有缺失,缺失率达75%.p16蛋白与cyclin D1竞争地结合CDK4,抑制它的活性,使之解除对Rb的磷酸化,从而不能释放转录因子E2F,阻止细胞由G1期进入S期,抑制细胞无限增殖[3,5].本实验采用免疫组化S-P法,对P16在喉癌组织中的表达进行定量分析,探讨P16在喉癌发生中的作用及P16与喉癌的生物学行为的关系,以判断喉癌患者的预后.
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胆脂瘤上皮细胞增殖及分子调控机制的免疫组化研究
近年来研究表明胆脂瘤细胞的过度增殖行为与信号传导相关的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTKs)异常激活有关[1],信号传导中涉及细胞周期,G1期的重要调控者周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependen kinase 4,CDK4)和其特异性抑制因子周期蛋白依赖性激酶抑制物p15调控结果对细胞周期产生重要影响,有决定细胞增殖还是凋亡的作用[2],因此,我们用超敏免疫组化技术(ultrasensitive immunohistochemistry,SP)检测胆脂瘤上皮细胞磷酸化PTKs、CDK4、p15的表达水平,报道如下.
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翻译后修饰对α-晶体蛋白分子伴侣活性的影响及白内障形成机制
翻译后修饰(post translational modification，PTM)是蛋白质翻译后通过酶的催化或酶控制下的反应而发生修饰，包括糖基化、氨甲酰化、氧化、磷酸化、乙酰化、脱酰胺和切除作用等。白内障和老化被认为是一类结构性疾病(conformational disease)。PTM可造成蛋白质结构改变。α-晶体蛋白作为晶状体主要的结构蛋白质，具有分子伴侣(molecular chaperone)活性，可抑制蛋白质的凝聚和酶的失活。PTM可诱导α-晶体蛋白分子内部或分子之间的交联，导致其分子伴侣活性降低，加速白内障形成。赖氨酸基团对PTM敏感，封闭赖氨酸的ε-氨基基团，可阻止和延迟蛋白质交联。寻找抑制或阻断PTM的因子，有助于药物治疗此类疾病方法的突破。
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FOXO3a介导PTEN对DNA修复基因RAD51表达的调节作用
目的 探讨转录因子FOXO3a在PTEN调节RAD51表达中的作用.方法 利用Western印迹技术分析PTEN缺陷与否时,总FOXO3a以及细胞核内FOXO3a磷酸化的情况;转染外源AKT到PTEN野生型细胞或外源PTEN和失去激酶活性的AKT(AKT-DN)到PTEN缺陷型细胞,Western印迹检测核内FOXO3a的磷酸化情况.结果 PTEN缺失导致细胞核内FOXO3a磷酸化水平增高;外源PTEN可以降低PTEN缺陷型细胞核内FOXO3a的磷酸化水平,外源AKT可以增加PTEN野生型细胞核内FOXO3a的磷酸化水平;沉默FOXO3a在一定程度上导致RAD51表达水平下降.结论 FOXO3a可以结合到RAD51基因的启动子区,PI3K/AKT/FOXO3a信号通路是PTEN调节RAD51表达的重要方式之一.
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DNA-PKcs单链抗体DPK3-scFv的原核表达纯化及生物学作用研究
目的 原核表达和纯化DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)单链抗体DPK3-scFv,观察其透入细胞及干扰辐射诱发DNA-PKcs磷酸化修饰的生物学作用.方法 PCR扩增DPK3-scFv基因,插入到带有His标签的原核表达载体pET28a,重组质粒转化工程茵BL21、优化表达.免疫荧光显微镜和蛋白免疫印迹观察DPK3-scFv透膜进入HeLa细胞及对电离辐射诱发靶分子DNA-PKcs的磷酸化修饰的影响.结果 成功构建单链抗体表达载体pET28a-DPK3-scFv,在2xYT培养基(16 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和lO g NaCI溶于1 L双蒸水中,高压灭茵)、20℃温度、O.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)条件下诱导可溶性表达,进一步获得了纯化单链抗体.DPK3-scFv能体外抑制DNA-PKcs激酶活性,纯化的DPK3-scFv可跨膜进入细胞内,并与DNA-PKcs共定位在细胞核.DPK3-seFv对γ射线照射HeLa细胞中DNA-PKcs及其S2056位点(pS2056)的自磷酸化具有显著抑制作用.结论 通过优化条件获得了可溶性原核表达的DPK3-scFv单链抗体,具有抑制其靶分子DNA-PKcs的磷酸激酶活性.
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O-GlcNAc修饰研究进展
N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰是一种新鉴定的蛋白质糖基化方式,在细胞内分布广泛,通过糖基转移酶和糖苷酶将N-乙酰葡萄糖胺单糖添加或移除到蛋白质的丝/苏氨酸残基上,并可能与磷酸化存在直接或间接的相互影响,参与转录调控、信号转导、蛋白酶解等多种重要保守的生命活动,从而发挥营养传感器和压力感受器的作用,调节细胞对外界刺激的反应.同时有研究表明,2型糖尿病和老年神经退行性疾病与O-GlcNAc修饰水平的升高和降低也有密切关系.
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有氧运动对肥胖大鼠海马组织tau蛋白磷酸化水平及PI3K/Akt信号通路的影响
目的:探讨有氧运动对肥胖大鼠海马组织tau蛋白磷酸化水平及其调控通路PI3K/Akt的影响,为揭示运动改善肥胖导致的神经系统功能紊乱提供一定的理论依据.方法:3周龄雄性SD大鼠随机分为高脂饮食组和正常饮食组,分别以高脂饲料和普通饲料饲养12周.随后高脂饮食组大鼠随机分为高脂安静组(HF-Sed组)和高脂运动组(HF-Ex组).正常饮食组大鼠随机分为正常安静组(ND-Sed组)和正常运动组(ND-Ex组).HF-Ex组和ND-Ex组大鼠进行为期8周的跑台训练.训练结束后48小时,分离两侧海马组织.通过Western blot检测各组大鼠海马组织中tau、GSK3β、PI3K和Akt蛋白含量及其磷酸化水平.结果:经过12周的饲养后,高脂饮食组大鼠中有55％符合肥胖大鼠建模成功条件.经过8周跑台训练后,HF-Sed组tau蛋白的磷酸化水平显著高于ND-Sed组;而HF-Ex组tau蛋白的磷酸化水平却显著低于HF-Sed组.另外,HF-Sed组GSK3β Ser9位点的磷酸化水平显著低于ND-Sed组,Tyr216位点的磷酸化水平显著高于ND-Sed组,说明HF-Sed组GSK3β激酶活性高于ND-Sed组;而经过8周跑台训练,HF-Ex组GSK3β Ser9位点的磷酸化水平显著高于HF-Sed组,Tyr216位点的磷酸化水平显著低于HF-Sed组,说明HF-Ex组GSK3β激酶活性受到抑制.此外HF-Sed组PI3K p110、p85亚基蛋白含量和AktThr308、Ser473位点的磷酸化水平显著低于ND-Sed组,说明HF-Sed组PI3K/Akt通路活性受到抑制;而HF-Ex组PI3K p110、p85亚基蛋白含量和Akt Thr308、Ser473位点的磷酸化水平显著高于HF-Sed组,说明HF-Ex组该通路活性增强.结论:肥胖能够诱导大鼠海马组织tau蛋白磷酸化水平上升,而有氧运动通过提高肥胖大鼠海马组织PI3K/Akt信号通路活性,抑制GSK3β的激酶活性,从而降低了tau蛋白的磷酸化水平,对于延缓脑内神经纤维缠结的形成,防治肥胖导致的神经系统退行性疾病有积极作用.
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抗阻运动对大鼠大脑皮质和海马组织PI3K/Akt信号通路的影响
目的:探讨抗阻运动对大鼠大脑皮质和海马组织PI3K/Akt信号通路及下游底物的影响.方法:雄性SD大鼠随机分为安静对照组(SG组)和抗阻运动组(RG组).抗阻运动组大鼠进行为期8周的爬梯训练.后一次训练结束后48小时,分离大脑皮质和海马组织.通过荧光定量PCR和Western blot检测各组大鼠大脑皮质和海马组织中PI3K、Akt、GSK3β以及tau蛋白mRNA和蛋白含量及其磷酸化水平.结果:经过8周抗阻运动,抗阻运动组大鼠大脑皮质和海马组织PI3K p110和p85亚基mRNA和蛋白含量显著高于安静对照组;Akt和GSK3β mRNA和总蛋白含量与安静对照组并无显著性差异,但Akt Thr308和Ser473以及GSK3β Ser9位点的磷酸化水平显著高于安静对照组,GSK3β Tyr216位点的磷酸化水平显著低于安静对照组;tau蛋白mRNA和总蛋白水平与安静对照组也无显著性差异,而其Ser202、Thr231和Ser396位点的磷酸化水平却显著低于安静对照组.结论:抗阻运动能够提高大鼠大脑皮质和海马组织PI3K mRNA和蛋白含量,增强其磷脂酰肌醇激酶活性;提高Akt Thrβ08和Ser473位点的磷酸化水平,激活Akt;活化的Akt磷酸化GSK3β Ser9位点,抑制GSK3β的活性;终导致tau蛋白多个位点的磷酸化水平降低.因此,抗阻运动能够提高大鼠大脑皮质和海马组织PI3K/Akt信号通路活性,并对下游底物产生积极影响.
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力竭性游泳对小鼠红细胞腺苷脱氨酶及超氧化物歧化酶活性的影响
腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase,ADA)是核酸代谢中的关键酶之一,它催化腺苷脱氨形成次黄嘌呤核苷,后者在嘌呤核苷磷酸化酶催化下经磷酸化生成次黄嘌呤和1-磷酸核糖:
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电离辐射作用后p53对核仁素的调控作用研究
核仁素(Nucleolin),是细胞核仁中的一种磷酸化蛋白,主要定位于真核细胞核仁的颗粒区和致密纤维组分[1-3].研究发现Nucleolin除了在核仁中发挥作用外,还具有在核仁、细胞核、细胞质之间穿梭的特性[4].
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组蛋白H2AX的磷酸化及其在放射生物学中的潜在应用
染色质核小体是由组蛋白H3、H4、H2A和H2B各2个分子组成八聚体核心,外围缠绕DNA链而成,每个组蛋白通过其球形结构域与DNA和其他组蛋白作用,但它们的NH2-端和C-端暴露在外,因此可以发生多种修饰,如磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等,这些修饰可以改变染色质的结构和DNA的转录特性.
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复合疲劳对大鼠学习记忆能力的影响
目的 通过观察复合疲劳大鼠的空间学习、记忆能力及其海马区磷酸化环磷腺苷相应元件结合蛋白(phosphorylated cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein,p-CREB)的表达水平,探讨复合疲劳对大鼠学习记忆能力影响的机制. 方法 按随机数字表法,将24只成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠分为对照组、食物限制组和复合疲劳组3组,每组8只.运用Morris水迷宫实验方法测定各组大鼠的平均逃避潜伏期及平台所在象限的游泳时间百分比.运用蛋白质印迹(western blot)方法检测大鼠海马区p-CREB的表达.采用SPSS 17.0统计软件对3组大鼠的负重游泳时长、平均逃避潜伏期及平台所在象限的游泳时间百分比进行单因素方差分析. 结果 5d负重游泳实验结果显示,3组大鼠间游泳时长差异有统计学意义(F=40.28～66.04,P＜0.01)；与对照组和食物限制组相比,复合疲劳组大鼠的负重游泳时长明显缩短(P＜0.01).在Morris水迷宫定位航行实验中,3组大鼠之间第2、3、4天的逃避潜伏期差异有统计学意义(F=4.17～7.11,P＜0.05或0.01)；与对照组和食物限制组相比,复合疲劳组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P＜0.05或0.01).在空间探索试验中,3组大鼠在平台所在象限的时间百分比差异有统计学意义(F=3.62,P＜0.05)；与对照组和食物限制组相比,复合疲劳组大鼠在平台所在象限的时间百分比明显降低(P＜0.05).3组大鼠海马区p-CREB的相对含量差异有统计学意义(F=730.07,P＜0.01)；复合疲劳组大鼠低于对照组和食物限制组(P＜0.01). 结论 复合疲劳对大鼠的空间学习、记忆能力具有损害作用,其机制可能与复合疲劳组大鼠海马区p-CREB的表达水平降低有关.
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STAT3异常磷酸化在血液系统肿瘤中的作用
STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)在细胞增殖、分化、存活、凋亡、细胞免疫等多种生理病理过程中发挥关键性作用.STAT3异常磷酸化与肿瘤形成密切相关.STAT3异常磷酸化在肿瘤形成中可能发挥了重要作用.本文就STAT3异常磷酸化在血液系统肿瘤形成中的作用做一简单综述.
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蛋白磷酸酶1对HIV-1转录的调节作用及其抑制剂研究
宿主细胞蛋白-蛋白磷酸酶1(PP1)是人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)转录的调节因子之一,参与HIV-1转录.脱磷酸化cyclin T1依赖性激酶9(CycT1-dependent kinase 9,CDK9)或RNA聚合酶ⅡC末端区(RNAPⅡ CTD)以增强Tat诱导的转录.本文综述了PP1在FIV-1转录过程的作用及其抑制剂研究进展.
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CYP450酶翻译后修饰对其活性影响的研究进展
药物代谢酶,特别是CYP450酶的活性调节一直是药物代谢的研究热点,大多数现有的研究都集中在转录和翻译水平上探讨化合物对其基因表达和蛋白水平的影响.但是随着研究的深入,发现在翻译后水平的修饰作用也可能对代谢酶的活性有重要影响.近年来,翻译后修饰作用对酶活性的影响越来越受到重视,并发现了一些对代谢酶活性有重要影响的修饰方式,如磷酸化、硝基化、泛素化等.本文对近年来翻译后修饰对CYP450酶活性影响的研究进行综述.
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没食子酸丙酯对脑缺血大鼠神经元SAPK/JNK及p38MAPK激活的抑制作用
目的探讨没食子酸丙酯对大鼠脑缺血再灌注模型缺血区周边组织神经元损伤的保护作用及其可能机制.方法通过Nissl和TUNEL染色法检测阳性神经元数量,蛋白免疫印迹、免疫组化法观察活化型Caspase-3,SAPK/州K,p38MAPK及其磷酸化组分的表达.结果没食子酸丙酯干预后,SAPK/JNK,p-SAPK/JNK(1 h),p38MAPK,p-p38MAPK(6 h)及活化型Caspase-3(12 h)表达均减弱,TUNEL阳性神经元减少(24 h),Nissl阳性神经元增多(24 h),神经元凋亡率明显降低.结论没食子酸丙酯保护缺血再灌注后神经元损伤的机制可能与抑制SAPK/JNK及p38MAPK的激活有关.
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人参皂苷Rb1通过JNK/p38 MAPK途径减轻Aβ25-35诱导的胎鼠皮层神经元tau蛋白过度磷酸化
探讨在Aβ25-35(beta-amyloid peptide (25-35),Aβ25-35)诱导的拟阿尔茨海默病样胎鼠皮层神经元tau蛋白过度磷酸化中,人参皂苷Rb1对tau蛋白磷酸化及JNK/p38 MAPK的可能作用.应用蛋白免疫印迹和免疫细胞化学染色的方法,观察tau蛋白磷酸化和JNK(c-jun N-terminal kinase)/p38 MAPK的表达情况.凝聚态Aβ25-35(20 μmol·L-1)作用于皮层神经元12 h,tau蛋白的磷酸化水平明显增高,同时JNK/p38 MAPK的总量及其活性形式--磷酸化JNK/p38 MAPK的蛋白表达水平也增加,人参皂苷Rb1可以减轻tau蛋白的磷酸化水平及JNK/p38 MAPK的蛋白水平.人参皂苷Rb1可通过JNK/p38 MAPK途径减轻Aβ25-35诱导的tau蛋白过度磷酸化.
