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CRIPT与人甘丙肽2型受体的相互作用
目的 通过寻找与人甘丙肽2型受体(hGalR2)C端相互作用的蛋白,以进一步探讨hGalR2转运和信号传导机制.方法 利用酵母双杂交实验寻找可以与hGalR2 C端相互作用的蛋白,并通过酵母双转验证和免疫共沉淀实验验证受体和目标蛋白之间的相互作用.结果 酵母双杂交方法结合免疫共沉淀实验发现和证实hGalR2与蛋白Cysteine-rich PDZ-binding protein(CRIPT)之间存在相互作用.结论 CRIPT可以与hGalR2结合而发生相互作用并可能因此参与hGalR2的转运或信号传导.
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与NRL相互作用所必需的OPTN结合区域的确定
背景 视神经蛋白(OPTN)基因是青光眼和肌萎缩性脊髓侧索硬化的致病基因,在眼部视网膜组织中的表达多.我们先前的研究分离出与OPTN相互作用的蛋白质,确定其中之一为视网膜色素变性的致病基因——碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子,即神经视网膜亮氨酸(NRL)拉链,并证实OPTN和NRL两蛋白间存在相互作用. 目的 确定与NRL相互作用所必需的OPTN蛋白结合区域. 方法 构建一系列带FLAG标签的OPTN部分片段缺失质粒,分别与带血凝素标记的NRL(HA-NRL)共转染HeLaS3细胞.用抗HA和抗FLAG标签抗体分别对细胞质和细胞核提取物进行免疫共沉淀和Western blot检测,分析两蛋白质间的相互结合方式,以确定NRL与OPTN蛋白的结合区域.结果 在OPTN的第一、第二和第三缺失区域质粒转染细胞的细胞核组分中均检测出血凝素标记的NRL(HA-NRL)免疫共沉淀条带,但在第四缺失区域质粒中不产生此HA-NRL条带.从所有缺失质粒及全长OPTN质粒转染细胞的细胞质组分中均未观察到NRL条带.结论 本研究进一步证实OPTN和NRL在HeLaS3细胞核内的相互作用,并明确其蛋白结合区域.在共表达NRL和OPTN的HeLaS3细胞中,Flag-OPTN可与HA-NRL相互结合,且OPTN的尾端区域(423-577)是结合NRL所必需的.
关键词： 视神经蛋白 神经视网膜亮氨酸拉链 蛋白质相互作用 免疫共沉淀 蛋白结合区域 -
大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位
目的:研究大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位,探讨二者的相互作用.方法:采用Western blot检测SK2通道及JP2蛋白在H9c2细胞中的表达,免疫共沉淀鉴定JP2与SK2通道之间的相互作用,免疫荧光标记观察SK2通道和JP2蛋白在H9c2细胞的定位.结果:心肌细胞H9c2表达SK2通道及JP2蛋白,SK2通道和JP2蛋白可形成免疫复合物,SK2通道和JP2蛋白存在部分共定位.结论:心肌细胞H9c2中SK2通道与JP2蛋白存在相互作用.
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重症肌无力患者肌细胞中LRP4胞内区与SNX17的相互作用
目的:探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)和分拣微管连接蛋白17(SNX17)在重症肌无力(MG)患者肌细胞中相互作用关系.方法:分别构建原核表达载体pET30a-LRP4胞内区和真核表达载体pEASY-Blunt M2-SNX17,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达相对分子质量约为17800的His-LRP4胞内区,在HEK293T细胞中诱导表达相对分子质量约为53000的Myc-SNX17.利用抗Myc单克隆抗体磁珠与抗His单克隆抗体磁珠进行双向免疫共沉淀(Co-IP),以验证LRP4、SNX17两种蛋白分子是否存在相互作用.结果:成功构建了原核表达载体pET30a-LRP4胞内区和真核表达载体pEASY-Blunt M2-SNX17;抗Myc单克隆抗体磁珠与His-LRP4混合后不发生共沉淀,如再与Myc-SNX17混合则可发生共沉淀;抗His单克隆抗体磁珠与Myc-SNX17混合后不发生共沉淀,再与His-LRP4胞内区混合可发生共沉淀.结论:原核表达的LRP4胞内区蛋白与真核表达的SNX17体外可发生直接结合.
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酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻cDNA文库中与S-腺苷高半胱氨酸水解酶相互作用的蛋白
目的:应用酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻cDNA文库中能与S-腺苷高半胱氨酸水解酶(dsSAHH)相互作用的蛋白.方法:将构建好的pGBKT7-dsSAHH诱饵载体转化至酵母细胞Y187,与转化有杜氏盐藻cDNA文库的酵母细胞AH109杂交,从杜氏盐藻cDNA文库中筛选出能与dsSAHH相互作用的蛋白质.扩增所得基因片段全长,并在原核内表达该融合蛋白.随后采用Far-western blot、His pull-down及免疫共沉淀方法验证dsSAHH与目的蛋白在体内、外的相互作用.结果:以dsSAHH为诱饵筛选出3个阳性克隆,扩增得到dsRACK1、dsMetAP1和dseEF1α3个新基因.His pull-down和免疫共沉淀体内外实验证实dsRACK1能与dsSAHH相互作用.结论:dsRACK1是dsSAHH的相互作用蛋白.
关键词： S-腺苷高半胱氨酸水解酶 酵母双杂交 蛋白相互作用 免疫共沉淀 -
接头相关蛋白复合物3δ亚单位与BRD7的相互作用及其功能
目的:观察鼻咽癌密切相关基因BRD7与接头相关蛋白复合物3(AP3)δ亚单位的相互作用及功能.方法:首先构建AP3δ基因真核表达载体pCMV-HA-AP3δ和pEGFP-C2-AP3δ,然后采用GFP介导的细胞荧光实验考察非洲绿猴肾COS7细胞中AP3δ的亚细胞定位;通过细胞荧光共定位和免疫共沉淀实验分析BRD7蛋白与AP3δ蛋白的相互作用;后采用荧光素酶实验观察BRD7与AP3δ对COS7细胞E2F3和CyclinD1活性的影响,半定量逆转录PCR观察转染pcDNA3.1-BRD7的HNE1细胞AP3δ mRNA的表达,以转染空白载体的HNE1细胞为对照.结果:成功构建了pCMV-HA-AP3δ和pEGFP-C2-AP3δ;AP3δ蛋白主要定位于胞质;AP3δ蛋白与BRD7蛋白存在相互作用.AP3δ基因可协同BRD7下调细胞E2F3和CyclinD1启动子活性.在BRD7稳定转染的HNE1细胞中,AP3δ mRNA的表达较转染空白载体组明显上调.结论:AP3δ蛋白与BRD7蛋白存在相互作用,在功能上相互促进.
关键词： BRD7 接头相关蛋白复合物3δ 免疫共定位 免疫共沉淀 -
PML coiled-coil结构域与RAN结合蛋白9相互作用的验证
目的 验证前髓细胞性白血病的卷曲螺旋结构域(PML-C)和RAN结合蛋白9(RANBP9)之间的相互作用.方法 构建分别表达诱饵蛋白PML-C和靶蛋白RANBP9的载体pGBKT7-PML-C和pACT2-RANBP9,然后转入酵母AH109,培养3～5 d后对其是否有胞内相互作用进行检测.将目的 片断PML-C和RANBP9再次构建于真核生物表达载体pCMV-HA和pCMV-myc里,然后共转染人胚肾293细胞里(HEK293),后对其是否有体外相互作用通过免疫共沉淀和免疫印迹进行分析.结果 在共转化了质粒pGBKT7-PML-C和pACT2-RANBP9的AH109酵母平板里观察到蓝色菌落生长.用抗HA多克隆抗体对共转染过重组质粒的HEK293细胞的蛋白提取物进行免疫共沉淀,再用抗myc单克隆抗体作为一抗进行免疫印迹,终检测出融合蛋白myc-RANBP9条带.结论 酵母双杂交实验验证了PML-C和RANBP9之间存在胞内相互作用,同时免疫共沉淀实验也从体外验证了它们之间的相互作用.
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PML-C与GINS2蛋白相互作用的胞内验证
目的 通过胞内实验验证PML-C与GINS2蛋白之间的相互作用.方法 将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PML-C和文库蛋白质粒pACT2-GINS2共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证二者之间的相互作用.结果 pGBKT7-PML-C诱饵蛋白质粒和pACT2-GINS2靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆生长;pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀与HA-PML-C相互作用的蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行Western印迹检测,可以检测到Myc-GINS2蛋白.结论 利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在胞内验证了PML-C与GINS2间存在相互作用.
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酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证
目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1(1),pDBLeu-GATA1(2),pDBLeu-GATA1(3),筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.
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红系分化相关基因相互作用蛋白质的分离与鉴定
目的 制备红系分化相关基因(erythroid differentiation-associated gene,EDAG)蛋白的单克隆抗体,利用免疫沉淀联合质谱技术对EDAG相互作用蛋白质进行分离与鉴定.方法 构建EDAG原核表达载体,通过诱导、表达、纯化获得EDAG融合蛋白,杂交瘤技术建立分泌EDAG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,利用Western印迹筛选阳性杂交瘤细胞,免疫小鼠得腹水,后用免疫共沉淀与质谱联合鉴定EDAG相互作用蛋白.结果 纯化获得EDAG重组蛋白,筛选出4株分泌EDAG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备了腹水.该抗体均可用于内源EDAG蛋白的检测,其中两种抗体可用于免疫共沉淀实验,运用质谱技术筛选获得EDAG候选相互作用蛋白.结论 利用EDAG单克隆抗体,筛选到EDAG候选相互作用蛋白质13种,涉及细胞增殖及转录等过程,为EDAG的功能研究及其分子机制的阐明提供了新的线索.
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C6/36细胞上登革2型病毒受体的免疫共沉淀
本文利用差速离心方法提纯的登革2型病毒、抗登革病毒单抗、病毒受体、耦合有G蛋白的琼脂糖珠之间特异性结合的作用,利用免疫共沉淀方法从C6/36细胞中分离鉴定出分子量约为35kDa受体蛋白;并用糖蛋白染色方法否定了此蛋白的糖基化特征.
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汉滩病毒核蛋白与热休克蛋白GRP94、HSP27的相互作用
为研究汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)感染诱导乳鼠脑组织热休克蛋白GRP94、HSP27与病毒蛋白的相互关系,选出生2～3d的昆明乳鼠实验性感染汉滩病毒,取8d后发病乳鼠脑组织部分制石蜡切片,用免疫组化结合共聚焦显微镜检测组织中病毒抗原及GRP94、HSP27的表达,部分制匀浆液,用ELISA、免疫共沉淀方法分析病毒抗原和GRP94、HSP27的关系.结果示汉滩病毒感染诱导乳鼠脑组织神经细胞高表达GRP94且与细胞内病毒抗原有共定位关系,但未见HSP27诱导高表达;免疫共沉淀显示汉滩病毒核心抗原(HINV-NP)与GRP94、HSP27呈非共价复合物形式存在.该结果为进一步探讨HSPs在病毒感染复制中的作用以及抗病毒感染方面提供了有意义的实验资料.
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高迁移率族蛋白B1与活化T细胞核因子2之间存在直接相互作用
目的:探讨高迁移率蛋白1(high mobility protein box 1,HMGB1)与活化T细胞核因子2(nuclear factor of activating T cells 2,NFAT2)之间的直接相互作用.方法:首先观察HMGB1与NFAT2在细胞外的相互作用,构建pET28a(+)-HMGB1、pGEX-KG-NFAT2质粒,应用网织红细胞系统进行体外翻译得到带有放射性硫同位素“S的His-HMGB1融合蛋白.应用蛋白纯化技术得到的GST-NFAT2融合蛋白,利用GST-pulldown实验检验二者在体外是否可直接结合;然后观察HMGB1与NFAT2在细胞内能否直接结合,构建HMGB1和NFAT2的真核表达质粒,共同转染人胚胎肾293T细胞系,刺激之后裂解细胞,应用相应的抗体进行免疫共沉淀检测,观察二者在细胞内直接结合的情况.结果:利用GST-pull down实验及免疫共沉淀实验证实,HMGB1 全长蛋白与NFAT2全长蛋白在细胞内、外有直接结合的条带,而对照组没有结合条带,说明HMGB1可与NFAT2特异性结合.结论:HMGB1与NFAT2之间存在直接相互作用.
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Nelin与F-actin及Filamin相互作用的鉴定
目的 在用酵母双杂交方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选,得到3个阳性克隆的基础上,进一步探讨新基因Nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的功能,并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质.方法 采用基因转染和表达技术,在真核细胞内外分别进行了Nelin蛋白与肌动蛋白(F-actin)结合的共沉降及免疫荧光共定位实验.并通过免疫共沉淀实验进一步验证所得的实验结果.结果 证实了在细胞内外Nelin蛋白均能同F-actin相结合;还能与Filamin的C-末端免疫球蛋白样结构发生相互作用.结论 Nelin为一个新的兼有actin及Filamin结合能力的蛋白.在心肌细胞内,Nelin很可能作为一个膜一细胞骨架连接蛋白,参与了细胞黏着斑形成的过程.
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免疫共沉淀技术的研究进展
免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)技术是检测蛋白质间相互作用的经典方法,也是较常用的方法.文章对近10余年有关免疫共沉淀技术的原理和应用及其优缺点的分析进行文献综述.
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EGFR模拟表位肽筛选及其生物学活性鉴定
目的：帕尼单抗(Panitumumab)可抑制EGFR信号通路，临床用于治疗EGFR高表达的转移性结直肠癌患者。本研究以帕尼单抗为靶分子，应用噬菌体展示肽库进行筛选，获得可模拟与帕尼单抗结合的EGFR表位小肽，并对模拟表位肽的活性进行了初步鉴定。方法：应用噬菌体展示肽库技术筛选可与帕尼单抗结合的噬菌体单克隆，并对阳性噬菌体克隆进行DNA测序鉴定，获得对应的EGFR模拟表位肽序列。通过基因重组、蛋白表达、纯化，获取该小肽与GST的融合蛋白，并通过ELISA，免疫共沉淀和GST-Pull down检测小肽与帕尼单抗的结合，及其对帕尼单抗结合EGFR的竞争抑制作用。结果：通过筛选噬菌体肽库我们获得两种可同帕尼单抗特异性结合的噬菌体单克隆，P19和P26。应用基因重组技术构建GST-小肽融合蛋白表达载体，并在BL21中表达融合蛋白GST-P19、GST-P26。免疫共沉淀(Co-IP)以及GST-pulldown结果初步提示帕尼单抗同GST-P19和GST-P26具有相互作用。ELISA竞争抑制实验结果证明P19和P26可明显抑制帕尼单抗和EGFR蛋白的结合。结论：通过筛选噬菌肽库获得的帕尼单抗特异性结合性小肽有望成为新型EGFR肿瘤疫苗。
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不同临产状态的子宫平滑肌组织中与NF-κB相互作用差异蛋白质的分析
目的:分析不同临产状态子宫下段平滑肌组织中与NF-κB相互作用的差异蛋白质,为分娩机制的研究提供新的实验及理论依据.方法:分别采集足月未临产、自然临产和前列腺素E2栓诱导临产(药物临产组)的孕妇子宫下段平滑肌组织.Western印迹验证NF-κB P65表达;联合免疫共沉淀、SDS-PAGE、电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)和蛋白质生物信息分析等技术,分析不同临产状态子宫平滑肌组织中与NF-1cB相互作用的差异蛋白质,并利用Western印迹进行验证.结果:人类临产前后子宫下段平滑肌组织中NF-κB表达均为阳性,与NF-κB P65相互作用的差异蛋白,自然临产前后鉴定出9个,药物临产前后鉴定出5个,其中不同临产状态共同差异表达的蛋白3个,分别为热休克蛋白70(heat shock 70 kD protein,HSP70)、膜联蛋白A6和结蛋白,经Western印迹验证与蛋白表达相符.这些差异蛋白分别属于分子伴侣、信号转导、细胞骨架和能量代谢相关的蛋白质.结论:子宫平滑肌细胞中NF-κB通过与分子伴侣、信号传导、细胞骨架和能量代谢等相关的多种蛋白质相互作用,参与分娩的启动或调节.
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FXR1真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建携带人脆性X相关基因 1 (FXR1)的真核表达载体pCMV-HA,为研究FXR1P互作蛋白奠定基础. 方法 以pYESTrp3-FXR1为模板进行聚合酶链反应(PCR)特异扩增FXR1基因片断,将扩增片段经EcoR I 和XhoI双酶切后克隆到pCMV-HA载体,酶切鉴定阳性克隆并测序鉴定. 结果成功构建了pCMV-HA/FXR1真核表达载体. 结论 pCMV-HA/FXR1真核表达载体的构建为进一步在细胞内鉴定FXR1互作蛋白奠定了基础,从而对研究FXR1在脆性X综合征中的作用机理具有深远意义.
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HepG2细胞中PIG11相互作用蛋白质的初步分离与鉴定
目的 探讨人肝细胞癌细胞系(HepG2)并初步鉴定候选肝癌抑癌蛋白肿瘤蛋白P53下游靶基因11号(PIG11)相互作用蛋白,确定PIG11的作用方式. 方法 课题组前期利用质粒pLXSN构建逆转录病毒载体,转染细胞后建立起PIG11高表达HepG2细胞株.将HepG2分为HepG2对照组,空载体HepG2组和PIG11高表达HepG2组分别培养,流式细胞术检测细胞凋亡.采用免疫共沉淀富集HepG2细胞中PIG11结合蛋白,切取PIG11结合蛋白条带,胶内酶解后进行电喷雾串联质谱得到肽序列标签,通过数据库查询蛋白. 结果 PIG11蛋白高表达组凋亡率显著高于对照组 (P<0.01). 串联质谱后数据库查询鉴定出11个蛋白,分别是热休克蛋白家族中的HSP60,KH型剪接调节蛋白(KSRP)、脑酸溶性蛋白BASP1、蛋白水解诱导因子(PIF/DCD)、Y染色体RNA结合蛋白、碳酸酐酶、白蛋白以及骨架蛋白中的波形蛋白、α、β-微管蛋白、肌动蛋白. 结论 PIG11蛋白高表达对HepG2具有诱导凋亡作用;初步鉴定出11个PIG11结合蛋白,为进一步阐明PIG11蛋白的作用机制提供线索.
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HSP90高表达细胞系的建立及其对底物蛋白结合能力的影响
目的建立HSP90稳定高表达细胞系,探讨HSP90在应激适应中的作用及其机制.方法含人类HSP90β全长基因的质粒pSmycHSP经酶切鉴定、大肠杆菌转化、质粒提取纯化后,以电穿孔转染,G418筛选建立HSP90稳定高表达的小鼠成纤维细胞系.通过免疫共沉淀方法,观察HSP90表达与底物蛋白HSP70、Raf-1的结合情况.结果经G418筛选的阳性克隆HSP90 clone细胞HSP90胞膜、胞核强染.免疫共沉淀结果表明,细胞内HSP90含量、HSP90结合的Raf-1量、HSP90结合的HSP70量变化趋势为外源性HSP90转染细胞＞对照.结论 HSP90高表达导致HSP90蛋白与部分底物蛋白的结合性改变.提示细胞可通过HSP90分子伴侣功能,抗衡应激反应中蛋白质变性引起的细胞损伤.
