首页 > 文献资料
-
天麻素抑制脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞的自噬
目的 探讨天麻素(Gas)在脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬中的作用.方法 用不同浓度的Gas(5、10、20、50μmol/L)预处理HUVECs 1h,再加入1mg/L LPS共培养12 h后,分别提取细胞总蛋白及mRNA,采用Western blotting及RT-PCR检测Beclin-1、ATG5及LC3的表达变化;采用丹酰尸胺(MDC)染色检测细胞中自噬小体(autophagosome)的表达变化;采用MTT检测HUVECs生存率的变化.结果 LPS诱导HUVECs产生自噬;Gas预处理后自噬水平明显降低且呈剂量依赖性;与此同时细胞的生存率明显增加.结论 LPS诱导HUVECs产生自噬;Gas通过抑制由LPS诱导产生的自噬,提高HUVECs的生存率.
-
扣带素--调节血管内皮细胞屏障功能的新靶点
血管内皮细胞间连接顶端的紧密连接是构成旁细胞屏障的重要结构。紧密连接由跨膜蛋白和胞浆蛋白组成，其中胞浆蛋白作为桥梁连接跨膜蛋白和细胞骨架蛋白，因此在决定紧密连接结构的完整性中发挥了重要的作用。然而目前，关于血管内皮中特异性表达的重要胞浆蛋白的研究仍十分有限。扣带素（cingulin）是1988年发现的一种紧密连接胞浆蛋白，已有研究表明 cingulin 在上皮细胞中参与调控紧密连接跨膜蛋白的表达以及细胞的增殖能力。然而，cingulin 在血管内皮中的作用尚不清楚。作者首先使用免疫组化和免疫荧光技术检测到人皮肤、脑和肺组织的血管内皮上存在 cingulin 特异性的表达，其与经典的紧密连接粘连蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）存在共定位。在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中过表达 cingulin 可增加紧密连接链的长度，增加跨内皮细胞电阻值，并降低分子量为376 Da 和70000 Da 荧光示踪分子的通透性；而在敲低 cingulin的小鼠内皮细胞中，低分子量荧光示踪分子的通透性显著增加，这提示 cingulin 可经促进紧密连接的形成进而增强内皮细胞的旁细胞屏障功能。进一步，作者在 cingulin 敲除小鼠中通过尾静脉注射生物素（作为旁细胞途径示踪分子）后发现，菱形窝下缘后区的神经元以及浦肯野细胞均呈现生物素阳性染色，提示在这些部位的血脑屏障受到了破坏。以上结果表明，cin-gulin 可调控血管内皮细胞的屏障功能，其机制与调节紧密连接结构的形成和稳定性有关，这为将来治疗脑和外周器官的血管渗透综合症提供了新思路。
-
苦参碱对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞炎性反应及氧化应激的影响
目的 探讨苦参碱(MAT)对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎性反应及氧化应激的影响.方法 将HUVECs随机分为5组:对照组;LPS组;LPS+MAT低、中、高剂量处理组.LPS组用100 ng/ml的LPS刺激12 h建立炎性反应及氧化应激损伤模型,LPS+MAT低、中、高剂量处理组分别以不同浓度MAT(0.5、1.0、1.5 mmol/L)预处理HUVECs 24 h,然后加入LPS(100 ng/ml)在培养箱中继续培养12 h.CCK-8法检测HUVECs的存活率,实时荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6、单核细胞趋化因子1(MCP-1)、TNF-α、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)的mRNA水平,酶标仪检测单核巨噬细胞(THP-1)与HUVECs的黏附强度,Western blotting检测ICAM-1、VCAM-1和NF-κB P65的蛋白表达,DCFH-DA探针联合酶标仪检测细胞内反应活性氧(ROS)含量,试剂盒检测细胞内丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性.结果 MAT浓度≥2.0 mmol/L时表现出细胞毒性作用,可浓度依赖性降低HUVECs的存活率(P<0.05).与对照组相比,LPS组的IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的mRNA水平增加,THP-1细胞与HUVECs的黏附率升高,ICAM-1、VCAM-1和P65的蛋白表达增加,ROS、MDA含量升高,GSH-Px和CAT活性降低.MAT预处理后可以抑制LPS诱导的内皮细胞炎性反应,降低黏附因子表达,改善氧化应激水平,且浓度越高抑制作用越强(P<0.05).结论 MAT对LPS诱导的HUVECs损伤具有保护作用,且其保护作用可能与减少炎性因子表达、抑制氧化应激有关
-
人脐静脉内皮细胞在支架上粘附的影响因素研究
目的研究人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在支架上的粘附生长的影响因素,寻求佳细胞粘附条件.方法 HUVEC培养按文献方法进行.利用免疫组化方法(Sp法)检测Ⅷ因子以鉴定细胞纯度,分别比较细胞代数、Fibronectin、poly-L-lysine及Ca2+浓度对HUVEC在支架上的粘附率的影响.结果 (1)第2、3、4代HUVEC在裸支架上的粘附率分别为(20.05±2.1)%、(16.12±4.02)%、(10.61±5.01)%(n=4);(2)Fibronectin(n=6)、poly-L-lysine(n=4)处理支架,HUVEC的粘附率分别为(64.3±6.19)%、(39.88±1.31)%;(3)与1mM、2mM、3mM、4mM、5mM Ca2+相对应的细胞粘附率分别为(59.81±2.58)%、(66.88±3.15)%、(78.35±3.43)%、(81.67±1.91)%、(84.83±1.31)%.结论 (1)Fibronectin、poly-L-lysine可提高HUVEC在支架上的粘附.(2)Ca2+在一定剂量范围内呈剂量依赖性地提高HUVEC在Fibronectin包被支架上的粘附.
-
血根碱抑制TGF-β1诱导人脐静脉内皮细胞向间质细胞转化研究
目的：研究血根碱（SAN）对TGF?β1诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）向间质细胞转化的影响，并探讨其发生机制。方法使用TGF?β1（10μg/L）刺激HUVEC，观察不同浓度SAN对TGF?β1诱导HUVEC向间质细胞转化的影响。采用CCK8检测不同浓度SAN对HUVEC细胞活性的影响；在倒置相差显微镜下观察HUVEC形态学的改变；采用实时半定量逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）检测细胞中collagen?1，fibronectin，N?cadherin的基因表达水平；免疫印迹法检测细胞中p?Smad2，Smad2，p?Smad3，Smad3的蛋白表达量。结果 CCK8结果显示：不同浓度SAN干预HUVEC 72 h后，细胞活性无明显改变；光学显微镜下观察到HUVEC在正常情况下呈规则的铺路石样生长，TGF?β1作用于细胞后可见细胞形态向长梭形转变，而当SAN（0.25μmol/L）与TGF?β1同时作用时则可显著逆转这一现象；RT?PCR结果显示TGF?β1可显著上调HUVEC胞内collagen?1，fibronectin，N?cadherin的基因表达水平，当SAN与TGF?β1同时作用时，可明显逆转这种现象；WB结果显示，在TGF?β1的作用下，p?Smad2和p?Smad3表达增加，而当SAN与TGF?β1同时作用时可逆转这一现象。结论 SAN可抑制TGF?β1诱导的HUVEC向间质细胞转化，提示其对于治疗心肌纤维化疾病可能具有重要的作用。
-
转基因内皮细胞的构建及其在复合血管上种植的初步研究
目的:为了解决小口径(直径7mm以下)人造血管术后通畅率低下的问题,利用生物-人工复合血管,结合分子生物学手段,将转入血管内皮生长因子(VEGF165)基因的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)种植于复合血管内腔面,为解决此临床难题提供新的思路和手段.材料方法:构建VEGF165真核表达质粒pCI-neo-VEGF165,获得正确的质粒用于转染HUVEC.从中科院购买HUVEC(代号:ECV-304),用脂质体介导法将pCI-neo-VEGF165转入细胞,经G418筛选后,计数阳性克隆,以比较脂质体和质粒在不同比例情况下转染效率的高低.实验组按质粒和脂质体比例的不同分为4组:1 μg/3 μl;2 μg/6μl;2 μg/8μl;3μg/12μl.ELISA检测瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达.再将VEGF165基因瞬时转入HUVEC,利用自己设计的旋转培养装置,将细胞均匀地粘附、种植于复合血管内腔面.复合血管是人工材料(聚酯)和生物材料(成纤维细胞长入,胶原形成)有机结合而成,是将包有聚酯网的硅胶棒埋入绵羊背部皮下组织,3个月后取出,抽去硅胶棒而得到的.结果:脂质体转染效率以2μg/8μl组阳性克隆数多;ELISA测定瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达量为532.5±43.1pg/ml.使用旋转培养装置的细胞均匀地粘附于复合血管,未使用者细胞积聚于血管腔面下部;转入和未转入VEGF165基因的HUVEC在复合血管内腔面覆盖面积百分比分别为69.9%±3.5%、43.7%±2.5%,有明显改善.结论:转入VEGF后可促进HUVEC在复合血管上生长,旋转培养装置有利于细胞的均匀粘附.
-
人脐静脉内皮细胞受剪切力作用后原癌基因c-fos和c-myc蛋白的表达
本文的研究目的是揭示不同的流动剪切力对体外培养的人脐静脉内皮细胞c-fos和c-myc蛋白表达的不同影响.我们利用平行板流动小室装置控制剪切力大小和持续时间.然后用免疫组织化学方法对受剪切力作用后的内皮细胞进行染色并进行图像分析.得到一些重要结果.c-fos蛋白表达在静态时非常低,4dynes/cm2和10dynes/cm2的剪应力都可诱导c-fos蛋白水平迅速增加,尤其是10dynes/cm2的剪应力.并随时间的增加而增加,到1.0h达到高峰,随后下降,2.5h时接近基础水平.c-myc蛋白在静态时表达也非常低,经剪切力作用后缓慢增加,c-myc蛋白水平明显较c-fos低,而且剪应力为4dynes/cm2和10dynes/cm2两种情况对c-myc蛋白表达的影响基本无差异.其高峰在1.5h.随后下降,在2.5h时接近基础水平.结果表明人脐静脉内皮细胞c-fos蛋白表达具有对剪切力大小和时间的依赖性;c-myc蛋白表达具有时间依赖性.
-
血小板衍生膜微粒对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响
本研究探讨血小板衍生膜微粒(platelet-derived membrane microparticles,PMP)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖和凋亡的影响.用不同浓度的凝血酶激活血小板释放出PMP,采用流式细胞术检测PMP的释放量,确定制备PMP时凝血酶的佳应用浓度.以体外培养HUVEC为载体,通过噻唑蓝(MTT)实验和流式细胞术研究不同浓度的PMP对HUVEC增殖和凋亡的影响.结果表明,2、1.5、1.0和0.5U/ml凝血酶激活血小板后PMP的释放率分别为28.7、47.7、50.1和43.9 %;HUVEC的增殖与PMP呈剂量依赖关系.在培养液中添加40 μg/ml PMP时,HUVEC增殖是空白对照组的1.8±0.3倍;10μl/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)组的HUVEC增殖是空白对照组的1.9±0.5倍,两组之间无统计学差异,(p＞0.05);PMP能抑制HUVEC的凋亡,40 μg/ml PMP组的细胞凋亡率为(3.9±0.4)%,明显低于空白对照组的细胞凋亡率(9.4±0.5)%(p＜0.05).VEGF(10μl/ml)对HUVEC细胞的凋亡无明显抑制作用,其凋亡率为(8.0±0.8)%.结论:用1 U/ml的凝血酶刺激血小板释放的PMP较为均一,且释放量大,可促进HUVEC细胞的增殖并抑制其凋亡.
-
抗VEGF单克隆抗体生物学活性分析方法的建立及其应用
目的：建立抗 VEGF单克隆抗体生物学活性分析方法，并对实验条件进行优化及方法学验证。方法从新生儿脐带分离获取人脐静脉内皮细胞（HUVEC），使用第4~6代细胞进行活性检测。HUVEC接种96孔板于 CO2培养箱培养4 h后加入不同浓度的抗 VEGF单克隆抗体——VEGF165混合物孵育48 h，加入 CCK8显色4 h，酶标仪读取各孔OD450吸光值，采用四参数拟合绘制标准曲线，计算参比品和样品的 IC50值，获取样品的相对活性。结果该方法专属性强，仅在抗 VEGF单克隆抗体上呈现相应的剂量关系曲线，标准曲线拟合度r2>0.99，精密度样品相对活性RSD <20%，方法在50%~200%活性范围内具有良好的准确性。用该方法对两个候选药分别进行6次重复性检测，候选药相对活性值分别为（95.80±3.29）%，（101.10±3.81）%。结论本研究建立的 HUVEC增殖抑制法特异性高、重复性好，并具有良好的准确性及精密度，可用于抗 VEGF单克隆抗体生物学活性的评估。
关键词： 人脐静脉内皮细胞 血管内皮生长因子类 抗 VEGF单克隆抗体 -
脂质过氧化对人血管内皮细胞NO合成的影响及维生素E的作用
一、材料与方法1. 细胞培养：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养采用本实验室改进的Jaffe培养法。经免疫荧光检测第Ⅷ因子相关抗原阳性，鉴定为血管内皮细胞。
-
脑源性神经营养因子对血管新生的作用
脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 是神经营养因子家族的一员,对中枢和外周神经系统多种类型神经元的生长、发育、分化和再生具有重要作用[1].研究显示人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人脑血管内皮细胞等多种内皮细胞以及新生血管平滑肌细胞均能产生BDNF,而且BDNF对血管内皮细胞的生长发育起着重要的支持作用[2,3].因此我们推测BDNF可能在一定程度上参与了机体新生血管的形成.为此,我们对BDNF的体内体外促血管新生作用进行了研究.
-
联胺诱导培养的人内皮细胞表达血管细胞黏附分子-1
细胞黏附分子涉及许多生理和病理过程,如动脉粥样硬化(AS)[1].有些因素可能诱导细胞黏附分子的表达,如氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导培养的内皮细胞表达血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)[2].这提示细胞黏附分子可能是导致AS的一种重要因素.我们拟用氧化剂联胺处理培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),诱导其脂质过氧化损伤,观察其VCAM-1 mRNA和蛋白表达,为抗氧化剂防治AS提供实验依据.
-
同型半胱氨酸促进内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白1α
单核细胞迁入动脉内皮下间隙是动脉粥样硬化(AS)发生的早期事件[1].巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)对单核细胞有趋化作用.高同型半胱氨酸血症是AS的一个独立危险因子[2].我们观察同型半胱氨酸(HCY)是否诱导培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达MIP-1α,探讨HCY在AS形成中的作用.
-
HIV相关脑病患者中枢神经系统来源的HIV-1 Tat蛋白对HUVECs活性的影响
目的 在原核细胞中表达并纯化HIV相关脑病(HIV-associated dementia,HAD)患者基底核(basal ganglia,BG)来源HIV-1 Tat蛋白,研究其对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)活性的影响.方法 以本室保存的重组质粒pGEX-KG-tat为模板扩增tat,构建重组表达载体pET-32a-tat.转化BL21(DE3)并用IPTG诱导表达Tat蛋白.Tat蛋白经镍亲和层析柱和凝胶过滤预装柱纯化、SDS-PAGE和Western blot(WB)鉴定后浓缩,测定BCA蛋白浓度,cck-8检测不同浓度Tat对HUVECs活性的影响.结果 在BL21大肠杆菌中表达、纯化得到了纯度较高的Tat蛋白,BCA测定浓度为0.47 mg/ml.随着Tat浓度的增加,HUVECs活性逐渐降低,与阴性对照组相比,100 ng/ml、200 ng/ml两组细胞活性差异均无统计学意义(P>0.05),300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ml四组细胞活性差异均有统计学意义(P<0.05),但四组组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 在原核细胞中高效表达了具有生物学活性的HIV-1 Tat蛋白,浓度达到300 ng/ml可显著降低HUVECs的活性.
-
水凝胶上培养的原代人脐静脉内皮细胞感染登革病毒Ⅱ型对细胞产生 IL-29的表达影响
目的：利用水凝胶（ hydrogel ）模拟人血管内皮细胞基底膜弹性硬度，以登革病毒2型（DENV-2）NGC株感染接种于水凝胶为基底的原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endotheli-al cells，HUVECs），观察HUVECs在不同弹性硬度材质上培养产生IL-29的情况。方法分离培养原代HUVECs，将细胞接种于水凝胶，以MOI（multiplicity of infection）＝10的DENV-2感染原代HUVECs，流式细胞术检测48 h细胞凋亡率及病毒感染率，并送检mRNA基因表达谱芯片，通过实时荧光定量PCR及双抗体夹心ELISA法检测IL-29的表达情况。结果 DENV-2感染原代HUVECs 48 h，培养于水凝胶上的细胞的病毒感染率较低，细胞凋亡率与未感染组比较，差异无统计学意义（P＞0．05），基因芯片检测发现IL-29的产生与普通塑料培养瓶接种的脐静脉内皮细胞受到DENV-2感染后存在差异，实时荧光定量PCR和双抗体夹心ELISA法检测IL-29的表达，差异均存在统计学意义（P＜0．05）。结论水凝胶模拟人血管内皮细胞基底膜硬度，用DENV-2感染接种于水凝胶上脐静脉内皮细胞，基因芯片检测发现IL-29的产生，与体外正常培养条件下受到DENV-2感染后存在差异，水凝胶的建立可能为DENV发病机制的研究提供一个新的模型。
-
梅毒螺旋体膜蛋白 Tpp17体外活化血管内皮细胞的实验研究
目的：研究梅毒螺旋体重组蛋白Tpp17体外对人脐静脉内皮细胞（ HUVEC ）的活化作用，探讨膜蛋白Tpp17在梅毒免疫学发病机制中的作用。方法将采用基因工程技术重组合成的梅毒螺旋体膜蛋白Tpp17刺激HUVEC， ELISA测培养上清中细胞因子TNF-α、MCP-1、ICAM-1及E-selectin的水平，荧光定量聚合酶链反应测HUVEC中TNF-α、MCP-1、ICAM-1及E-selectin mRNA的转录水平；将重组蛋白Tpp17预处理的HUVEC与Calcein-AM标记的THP-1细胞共培养，荧光倒置显微镜下观察HUVEC与THP-1细胞的黏附情况；将HUVEC接种于transwell小室的下室，重组蛋白Tpp17处理后，Calcein-AM标记的THP-1细胞接种于上室，荧光倒置显微镜观察下并计数THP-1细胞的迁移率。结果梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp17可上调HUVEC细胞因子TNF-α、MCP-1、ICAM-1及E-se-lectin的表达水平，提高其对THP-1细胞的趋化和黏附能力，与空白组比较，差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp17可体外活化HUVEC，提高HUVEC对THP-1细胞的趋化和黏附能力，可能在梅毒的免疫病理中起重要作用。
-
DENV-2感染的HUVECs与调节性T细胞相互作用对主要炎性细胞因子产生的影响
目的 研究人原代脐静脉内皮细胞( primary human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)被登革病毒2型( DENV-2)感染后,与调节性 T 细胞( regulatory T cells, Treg)共培养, HUVEC与Treg细胞相互作用对各自主要炎性细胞因子的影响.方法 用密度梯度离心法从人浓缩白细胞分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),磁珠阴性分选Treg细胞,流式细胞术检测CD4+CD25+CD127+细胞纯度. HUVECs经DENV-2感染后,用Transwell与Treg细胞共培养,对照组用鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate, S1P)1型特异性受体激动剂CYM-5442预处理24 h去除药物后感染病毒,并与Treg细胞共培养,real-time RT-PCR分别检测HUVECs的IL-6、IL-8、TNF-α和Treg细胞的IL-10、TGF-β的mRNA转录水平;双抗体夹心ELISA法检测培养上清中上述细胞因子表达.结果 感染后HUVECs中DENV-2 NS1基因转录水平逐渐上升,在24 h达到峰值(3. 03 ±0. 26,P<0. 01)后下降.流式细胞术检测经免疫磁珠阴性分选的Treg细胞纯度为(84. 3±0. 5)% .DENV-2感染后HUVECs的IL-6、IL-8、TNF-α mRNA转录均有上调,感染后24 h IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA转录量分别为16. 64±2. 64、26. 80±5. 81和5. 25±0. 42,而未感染组的转录水平分别为1. 70± 0. 68、1. 68±0. 74、1. 45±0. 15,与Treg共培养后上述细胞因子在各时间点的转录有所降低,但仍高于未感染DENV-2的对照组. CYM-5442预处理后被感染的HUVECs IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA转录水平显著下降;共培养的 Treg 细胞所产生的 IL-10、 TGF-β 也下调.结论 被 DENV-2感染的原代HUVECs能增强Treg细胞IL-10与TGF-β的分泌,同时Treg细胞产生的抑制性细胞因子能降低被感染的HUVECs炎性细胞因子的产生.
-
梅毒螺旋体膜蛋白 Tpp17 调节血管内皮屏障通透性的机制研究
目的 研究梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp17(rTpp17)对血管内皮屏障的调节作用,探讨膜蛋白Tpp17在梅毒免疫病理学发病机制中的作用. 方法 利用人脐静脉内皮细胞( HUVEC)构建体外细胞单层模型,将采用基因工程技术重组合成的rTpp17刺激HUVEC单层模型, ELISA检测Tr-answell小室的下室培养基中辣根过氧化物酶( HRP)流量;Cell-ELISA检测细胞表面VE-钙黏蛋白( VE-cadherin)表达水平;rTpp17预处理HUVEC单层模型,加入Calcein-AM标记的THP-1细胞共培养,荧光倒置显微镜下计数THP-1细胞穿过HUVEC单层的迁移率;将HUVEC接种激光共聚焦专用培养皿,rTpp17处理后,加入荧光染料罗丹明-鬼笔环肽工作液,共聚焦显微镜下观察细胞骨架蛋白F-actin排列变化. 结果 rTpp17可提高HUVEC单层模型通透性及下调细胞膜VE-cadherin的表达水平;促进THP-1细胞穿越HUVEC单层的迁移率,与阴性对照组比较,差异有统计学意义( P<0 .05 );rTpp17可促进细胞骨架蛋白F-actin重排. 结论 梅毒螺旋体膜蛋白Tpp17可提高血管内皮屏障通透性,下调血管内皮细胞VE-cadherin的膜表达水平,促进细胞骨架蛋白F-actin重排及单核-巨噬细胞穿过血管内皮细胞单层,可能在梅毒的免疫病理学发病机制中起重要作用.
关键词： 梅毒 梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp17 人脐静脉内皮细胞 内皮屏障 -
创伤弧菌溶细胞素体外诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及其在细胞中的定位
目的 了解创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnifru,cytolysin,WC)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡作用及其机制.方法 采用PCR扩增创伤弧菌GTC333株VVC编码基因vvhA,T-A克隆后测序并构建vvhA基因原核表达系统E.coli BL21DE3pET-42a-vvhA.采用Ni-NTA亲和层析法提纯目的 重组蛋白rVVC,SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统确定rVVC表达量及提取物纯度.采用溶血试验检测rVVC溶解兔红细胞的活性.2,4-二硝基苯肼比色法和四苯硼钠比色法分别测定rVVC作用的HUVEC培养物上清中乳酸脱氢酶(LDH)和K+含量.采用流式细胞术检测rVVC诱导HUVEC凋亡的作用.将FITC标记rVVC,采用激光共聚焦技术对HUVEC中的FITC标记rVVC进行定位.结果 与GenBank中相关序列比较,所克隆的vvhA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为96.09%和98.26%.1μg/ml的rVVC即可溶解兔红细胞(P<0.01).10 μg/ml的rVVC可引起HUVEC培养物上清中K+含量明显增高(P<0.01),但LDH含量无明显改变(P>0.05).1～100μg/ml的rVVC作用2 h可使HUVEC凋亡.在FITC标记rVVC作用HUVEC 5～240 min内,rVVC逐渐从细胞膜表面向膜内侧和胞浆内移行,作用30 min时多数rVVC进入细胞.结论 rVVC具有溶细胞素活性.VVC可进入HUVEC,诱导细胞凋亡是其损伤HUVEC的主要机制.
-
金黄色葡萄球菌及其L型诱导血管内皮细胞凋亡的研究
金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是临床上常见的主要致病菌之一,金葡菌感染可以诱发宿主细胞凋亡.我们用原位末端标记法(TUNEL)、流式细胞术检测金葡菌及其L型诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡情况.
