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幽门螺杆菌黏附素A的原核表达、纯化及其结晶条件搜索
目的 原核表达、纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素A(H.pylori adhesin A,HpaA),并初步搜索其结晶条件.方法 采用TMHMM和SignalP-4.1软件预测HpaA蛋白中的跨膜序列和信号肽序列,根据GenBank中登录的编码HpaA的基因序列hp0797去掉预测出的信号肽序列后设计引物,以H.pylori标准株26695基因组为模板,PCR扩增编码HpaA的基因序列,插入原核表达载体pET-22b,构建重组表达质粒pET-22b-HpaA,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG 25℃诱导表达,表达的重组蛋白经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析进行纯化.将纯化产物浓缩至10 mg/ml,采用结晶搜索试剂盒,通过悬滴汽相扩散法搜索HpaA的结晶条件,并在此基础上配制条件进行优化.结果 去掉序列中编码信号肽区域或跨膜结构域的密码子,选择HpaA的36 ～ 260位氨基酸进行克隆,构建的重组原核表达质粒pET-22b-HpaA经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白HpaA相对分子质量约27 000,表达量约占菌体总蛋白的10％以上,主要以可溶形式表达,纯化后的纯度可达99％以上.在多种条件下,均有结晶生长,晶体多为薄片状、针状或簇状,在20％ PEG3350,0.1 mol/L HEPES(pH 7.0)条件下,晶体形状类似长方体,外形有所改善.结论 成功表达了HpaA蛋白,初步掌握其结晶条件,为下一步晶体结构学的研究及其在H.pylori感染与致病中的作用机制奠定了基础.
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幽门螺杆菌VacA-HpaA融合蛋白的表达及其免疫学特性
目的 构建H.pylori细胞空泡毒素VacA与黏附素HpaA融合基因的原核表达载体,诱导其表达融合蛋白,并检测表达产物的抗原性与免疫原性.方法 用PCR从pQE30-VacA质粒扩增出VacA基因,克隆至pTrc99A-HpaA载体中,与HpaA基因融合后,插入原核表达载体pQE30中,再将pQE30-VacA-HpaA转化入大肠杆菌DH5α,诱导表达并提纯融合蛋白,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,Bradford法检测融合蛋白含量,Western blot鉴定特异性.将融合蛋白免疫家兔,得到多克隆抗血清,用双向免疫扩散和ELISA检测免疫原性.结果 SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量约为65 000,表达量在35%以上,主要以包涵体形式表达,蛋白含量为0.72 mg/ml,具有良好的VacA和HpaA抗原性与免疫原性.结论 VacA-HpaA融合蛋白已成功表达,且具有良好的免疫原性,为进一步研究制备H.pylori疫苗创造了条件.
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百日咳鲍特菌黏附分子的研究进展
随着生物技术的发展,研究人员对百日咳鲍特菌致病机理进行了大量研究并取得一定的突破,尤其是黏附分子在细菌致病过程中所起的作用.本文就近年来在百日咳鲍特菌黏附分子的研究进展作一简要综述.
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幽门螺杆菌融合蛋白HCTV的保护性研究
目的 探讨幽门螺杆菌融合蛋白HCTV(HpaA-CtxB-VacA, HCTV)小鼠口服后的免疫应答.方法 以Ni2+-NTA柱纯化HCTV为抗原,与重组蛋白HpaA和VacA分别给小鼠灌胃免疫,ELISPOT检测小鼠胃黏膜和派伊尔小结(Peyer patches, PP)特异性抗体分泌细胞(Antibody-secreting cells,ASC),ELISA检测血清IgG和IgA、小肠黏液sIgA和粪便sIgA.结果 ELISPOT和ELISA检测结果表明,胃黏膜和PP sIgA-ASC、IgG-ASC数量明显增加,尤以sIgA-ASC为甚,同时血清IgA和IgG、粪便sIgA、肠黏液sIgA也明显高于HpaA组、VacA组和对照组,差异均有显著意义.结论 已成功获得纯化的融合蛋白HCTV,小鼠灌胃免疫可有效诱导黏膜免疫应答,产生高水平的sIgA,可作候选Hp口服疫苗.
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百日咳黏附素的原核表达及其单克隆抗体的制备
目的 原核表达百日咳黏附素(Pertactin,Prn),并制备抗Prn单克隆抗体.方法 从无细胞百日咳疫苗生产菌株CS株基因组DNA中克隆Prn基因,插入表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-Prn,转化E.coli M15,IPTG诱导表达.表达的重组Prn蛋白经阳、阴离子交换层析纯化后,采用Western blot和ELISA法鉴定重组Prn蛋白的反应原性.以纯化的重组Prn蛋白为免疫原,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并对制各的单抗进行鉴定.结果 重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确；表达的重组Prn蛋白相对分子质量约为69 000,主要以包涵体形式表达；纯化的重组Prn蛋白的纯度达95％以上,产量可达25 mg/L,能与不同来源的抗Prn-Ab血清特异性结合.获得2株分泌抗Prn单抗的杂交瘤细胞株,分泌的单抗均为IgG1类,轻链类型均为κ,效价均达1∶105以上,并能特异性识别Prn蛋白,而与百日咳杆菌其他抗原蛋白无交叉反应.结论 原核表达、纯化了重组Prn蛋白,并制备了2株效价高、特异性强的单抗,为无细胞百日咳疫苗的质量控制及百日咳杆菌致病机制的研究提供了材料.
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葡萄球菌和生物膜
本文综述了葡萄球菌感染中生物膜形成的相关基因和分子基础,包括细胞间黏附素多糖的生物活性与生物合成、生物膜形成的有关蛋白质、黏液层产生和生物膜的调节以及高分子材料相关感染的预防.
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肺炎支原体对宿主细胞黏附机制的研究进展
肺炎支原体通过其末梢尖端结构即黏附细胞器与呼吸道黏膜上皮细胞受体(唾液酸共轭物或糖脂结构域)结合并定植于人体呼吸道,引起原发性非典型性肺炎等疾病.因此,其黏附机制引起了人们的重视.本文着重阐述了肺炎支原体黏附细胞器的形态、结构,黏附素与黏附辅助蛋白的种类、定位、功能及在黏附过程中的协同作用.
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抗金黄色葡萄球菌的人源化单克隆抗体
本文描述了对人源化单克隆抗体Aurexis(R)的体外、体内特性的鉴定.这种单克隆抗体对金黄色葡萄球菌微生物表面组分识别黏附基质分子蛋白ClfA具有高度亲和力和特异性.Aurexis(R)够阻止ClfA与人纤维蛋白原结合,并能促进对ClfA包被颗粒的调理吞噬作用.临床前体内试验表明,在用耐新青霉素Ⅰ金黄色葡萄球菌静脉注射攻击的小鼠败血症和家兔感染性心内膜炎模型中,单剂注射Aurexis(R)能够产生显著保护作用.对19例病人进行的Ⅰ期临床研究所获得的安全性和药代动力学数据支持继续进行Aurexis(R)的Ⅱ期临床研究.
关键词： 黏附素 MSCRAMM(R) 单克隆抗体 金黄色葡萄球菌 -
幽门螺杆菌黏附素基因(hpaA)的表达及重组蛋白的免疫原性检测
目的 研究幽门螺杆菌黏附素A(adhesin A of Helicobacter pylori,HpaA)基因在大肠杆菌中的表达和检测纯化HpaA的免疫原性.方法 将hpaA/pET28a表达质粒转入大肠杆菌BL21(RP)株并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,通过Ni2+亲和层析和分子筛层析纯化表达蛋白.用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达蛋白的相对分子质量,用蛋白质印迹法对表达蛋白进行特性确认.将纯化HpaA腹腔注射BALB/c小鼠,并检测小鼠的抗体水平.结果 表达蛋白的相对分子质量约为30 000,与HpaA相符.纯化的表达蛋白可与抗HpaA抗体发生特异性反应.腹腔注射HpaA的小鼠与对照小鼠间的血清抗HpaA IgG抗体水平差异存在统计学意义(t=8.367,P＜0.01).结论 HpaA在大肠杆菌BL21(RP)株中得到成功表达,且纯化HpaA具有较好的免疫原性.
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尿道致病性大肠埃希菌Afa/Dr家族黏附素研究进展
黏附素是具有黏附作用的细菌表面结构蛋白的统称,根据黏附素所在位置分为菌毛黏附素和非菌毛黏附素.
关键词： 尿道致病性大肠埃希菌 黏附素 受体 -
益生菌的作用机制
益生菌是一种适当摄取后能对机体产生有益作用的微生物.研究表明各种益生菌的作用不同,这与服用剂量、频次密切相关.有些益生菌可生成抗菌物质如抗菌素,可在肠腔内发挥作用;有些可通过增加固有的免疫应答产物,如杯状细胞来源的黏蛋白、潘式细胞来源的防御素,来增强肠道黏膜屏障功能;有些可通过增强获得性免疫应答来促进机体健康;有些则可激活肠道神经系统的某些受体,来缓解由于内脏高敏感性造成的疼痛.此文就益生菌的作用机制作一综述.
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幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究
目的:构建幽门螺杆菌(Hp)尿素酶亚单位B(UreB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)及黏附素A(HpaA)三价重组DNA疫苗并研究其抗原性,为Hp疫苗的开发奠定基础.方法:PCR扩增UreB、NAP、HpaA全长序列,分别克隆入pMD 18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UNH,然后将其亚克隆入真核表达载体pIRES,以此转染COS-7细胞,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果:PCR分别获得约1 707、432和750 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约2 901 bp目的基因.重组质粒pIRES-UNH转染COS-7细胞后表达相对分子质量约107 000的蛋白质,Western印迹显示该重组蛋白可为UreB、NAP、HpaA抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论:成功构建了具有良好免疫原性的UreB-NAP-HpaA三价重组DNA疫苗,为进一步探讨其免疫保护性及Hp疫苗的研制奠定了基础.
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双歧杆菌黏附素对大鼠肠缺血-再灌注损伤的防护作用
目的:研究双歧杆菌分泌型黏附素对大鼠缺血-再灌注(I/R)后肠黏膜屏障的防护作用.方法:将54只大鼠随机分为假手术组(对照组)、模型组(I/R组)和黏附素预处理组(实验组),每组各24只.于造模成功后6 h、第1、第4和第7天,分别取6只大鼠的血和小肠标本,观察小肠组织病理改变,检测各时间点血中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-10、二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸(D-LAC)的活性和含量.结果:与对照组比较,I/R组血中TNF-α、IL-6、IL-10、DAO和D-乳酸水平在各时相点均升高(P<0.05);与I/R组比较,实验组各时间点IL-6和DAO水平明显降低(P<0.05),TNF-α浓度术后第1天低于I/R组(P<0.05),术后第4和第7天实验组大鼠血浆D-LAC浓度明显低于I/R组(P<0.05),小肠病理改变较I/R组减轻(P<0.05).结论:双歧杆菌黏附素对大鼠I/R后肠黏膜屏障具有防护作用,能减轻肠黏膜的I/R损伤.
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白色念珠菌菌丝壁蛋白1的研究进展
此文简述了条件致病菌白色念珠菌的菌丝壁蛋白1(Hwp1)的结构特征、表达部位、其作为哺乳动物转谷氨酰胺酶底物的特点、黏附的二阶段模型、在白色念珠菌病发病中的作用、形成生物被膜时所扮演的角色和对白色念珠菌病诊断及治疗的展望.
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MRSA菌皮肤软组织炎症分离株黏附素与细胞毒素编码基因研究
目的 了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA菌)皮肤软组织炎症分离株中黏附素编码基因与细胞毒素编码基因携带状况.方法 收集皮肤软组织炎症病灶部分离的MRSA菌20株,采用聚合酶链反应(PCR)检测10种黏附素编码基因(sasX、fnbA、clfA、clfB、icaA、cna、bbp、ebpS、efb、map)和5种细胞毒素编码基因(pvl、lukE、lukM、psm-mec、psmα).结果 20株MRSA菌经PCR检测,10种黏附素编码基因中sasX、fnbA、clfA、clfB、icaA、cna、efb等7种均呈阳性,阳性率均为100.0％,bbp、ebpS、map等3种均呈阴性;5种细胞毒素编码基因中pvl、lukE、psmmec等3种均呈阳性,阳性率均达100.0％,lukM、psmα等2种均呈阴性.结论 皮肤软组织炎症病灶部分离到的MRSA菌株黏附毒素编码基因和细胞毒素编码基因检出率较高,这可能也是皮肤软组织炎症发生的原因.
关键词： 细胞毒素 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 黏附素 编码基因 -
三种梅毒螺旋体黏附素在梅毒兔模型中转录水平的差异性比较
目的:从宿主水平探讨梅毒螺旋体(TP)黏附素——TP0136、TP0155和TP0751蛋白在梅毒兔模型中转录水平变化情况.方法:①予新西兰白兔皮下注射TP Nichols Seattle株,建立早期兔梅毒感染模型;②制备TP0136、TP0155和TP0751质粒标准品;③荧光定量PCR连续动态观察兔硬下疳皮损形成过程中TP0136、TP0155和TP0751 mRNA水平的表达差异.结果:①新西兰白兔背部在第6天出现红色丘疹,到第19天皮疹达大并出现溃疡形成硬下疳.第25天起,全身陆续出现播散性二期梅毒疹;②TP0136、TP0155和TP0751 mRNA水平在早期呈现上升趋势,到第15天达高峰(P＜0.05),其后迅速下降,在第27天又有少许上升(P＞0.05);③标准化的TP0136 mRNA水平在第30天达高峰(P＜0.05);标准化的TP0155 mRNA水平分别在第24天和第30天出现峰值(P＜0.05);标准化的TP0751 mRNA水平在第24天达高峰(P＜0.05).结论:从宿主水平证实TP0136、TP0153和TP0751三种TP黏附素间存在转录水平差异,提示TP表达的多个黏附蛋白是具有各自特异性的宿主-病原体相互黏附作用机制.
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幽门螺杆菌4种黏附素基因保守区的克隆、序列及其生物信息学分析
目的克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)4种黏附素(BabA、AlpA、AlpB和HopZ)的保守区,并对其进行序列及生物信息学分析,为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供实验基础.方法利用ANTHEPROTV4.3c软件分析已证实的Hp4种黏附素蛋白序列,发现共同保守区(命名为CB),推导出其DNA序列,设计CB特异引物,将PCR产物定向插入pET-22b(+)载体,构建保守区的重组克隆.DNA自动分析仪进行序列测定,生物信息学软件对其生物学特性进行分析.结果构建了4种黏附素共同保守区的重组质粒,测序显示CB基因长588 bp,该基因编码195个氨基酸,与4种黏附素保守区的同源性均达50%以上,ANTHEPROTV4.3c软件预测其蛋白质相对分子质量约为22 500,并显示出了良好的抗原性和疏水性.BLAST分析了836 767个序列,与其同源性达40%的均为Hp序列.结论Hp4种黏附素存在同源性接近的保守区,表明其黏附作用可能有相似的分子基础,生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性和严格的种属特异性.
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幽门螺杆菌黏附素研究进展
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种定植于胃和十二指肠黏膜的革兰阴性菌,与慢性胃炎、消化道溃疡和胃癌的发生密切相关.Hp感染率在世界人群中超过50％.目前针对Hp的感染主要是采取三联或四联抗菌疗法.然而,随着耐药菌株的不断增多,研制安全有效的疫苗成为控制Hp感染的新出路.Hp感染和致病涉及多个环节,其中Hp黏附定植于胃和十二指肠道黏膜表面是首要条件.决定Hp定居的因素包括细菌鞭毛动力,尿素酶和黏附素.黏附素作为Hp定植的物质基础,在幽门螺杆菌基因重组疫苗的研究中受到越来越多的关注.
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抗幽门螺杆菌HP1188蛋黄抗体的研究
目的 制备抗幽门螺杆菌(H.pylori) HP1188 蛋黄抗体(immunoglobulin yolk,IgY),即 HP1188-IgY,了解其理化特性和生物学活性,为研制H.pylori HP1188-IgY型抗体口服制剂提供实验依据.方法 用纯化的重组HP1188蛋白免疫产蛋鸡,以水稀释法结合氯仿有机沉淀法提取蛋黄抗体(HP1188-IgY),采用SDS-PAGE电泳检测其纯度,Bradford法测定蛋白含量,Western blot分析抗原特异性.间接ELISA评价 HP1188-IgY 对热、酸及胃蛋白酶消化作用的耐受情况.分别检测不同浓度 HP1188-IgY及不同 pH 相同浓度HP1188-IgY对H.pylori的生长抑制试验.用MTT法检测不同浓度HP1188-IgY对H.pylori细胞毒活性的中和作用.结果 HP1188-IgY 纯度约为68%,蛋白浓度为7.79 mg/mL,Western blot结果 显示在相对分子质量30 000附近出现反应条带.HP1188-IgY具有一定的耐热性、耐酸性和耐胃蛋白酶消化的能力.HP1188-IgY在体外可抑制H.pylori生长,并具有浓度依赖性和pH依赖性.HP1188-IgY 能阻断H.pylori菌体蛋白对Hela细胞的毒性作用,且该作用具有浓度依赖性.结论 成功制备了HP1188-IgY,其具有良好的理化性质和生物学特性,为进一步制备预防幽门螺杆菌感染的口服制剂奠定了基础.
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幽门螺杆菌双亚单位表位融合蛋白的构建、表达及鉴定
目的 构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(HUepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白(HUepi-LTB),并对其进行纯化和鉴定.方法 采用PCR技术分别扩增HpaA-UreB表位多肽编码基因HUepi和LTB的编码基因LtB,重叠延伸PCR将2段基因拼接起来,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-HUepi-LtB,经酶切鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用阳离子和阴离子交换层析进行纯化,PAGE检测、N端测序和western blotting、ELISA检测、GM1活性检测.结果 成功构建表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白的高效表达质粒pET-22b(+)-HUepi-LtB,重组工程菌pET-22b(+)-HUepi-LtB/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约20.7×103,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达97 %,免疫学鉴定该融合蛋白与兔抗LTB抗血清可以发生特异性的结合.结论 Hp HpaA-UreB表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白(HUepi-LTB)经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性.为新一代Hp疫苗的研制奠定基础.
关键词： 幽门螺杆菌 黏附素 尿素酶B亚单位 大肠杆菌不耐热毒素B亚单位
