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5-FU在大剂量放疗中诱导人胰腺癌细胞株细胞凋亡的实验研究
目的:通过对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)在大剂量放疗中诱导人胰腺癌细胞株细胞凋亡的观察,探讨化疗药物与放疗联合应用的作用机制,为临床制定合理的放化疗方案提供理论依据.方法:将人胰腺癌细胞株panc-1细胞放入培养箱中培育24h后分为三组,(1)单纯照射组:给予10Gy剂量γ射线照射24 h;(2)先化后放组:先分别加入25、50、75、100 μg/mL 的5-FU,24 h 后进行10Gy剂量γ线照射24 h;(3)先放后化组:先给予10Gy剂量γ线照射,24 h 后分别加入 25、50、75、100 μg/mL 的5-FU作用24 h.分别采用透射电镜观察细胞凋亡的形态学表现;流式细胞仪计数细胞凋亡率;免疫组化测定Bcl-2和Bax蛋白表达率.结果:细胞凋亡的形态学表现,为细胞体积缩小、绒毛消失、凋亡细胞呈核固缩、形态多样、异染色质浓集于核膜处、分界清楚、凋亡小体形成.细胞凋亡率:单纯照射组为9.75%;先化后放组分别为11.0%、16.7%、27.3%、15.2%;先放后化组分别为10.5%、12.9%、13.4%、14.6%.Bcl-2阳性表达率(%):单纯照射组为(32.9±0.2);先化后照组分别为(30.8±0.05)、(28.7±0.3)、(25.6±0.2)、(24.7±0.1);先照后化组分别为(32.0±0.5)、(31.7±0.3)、(31.0±0.2)、(33.4±0.1).Bax阳性表达率(%):单纯照射组为(25.4±0.2);先化后照组分别为(30.6±0.3)、(39.8±0.4)、(40.4±0.1)、(43.1±0.5);先照后化组分别为(24.6±0.1)、(26.7±0.3)、(25.9±0.2)、(23.9±0.5).结论:照射前后24 h 分别加入不同剂量的5-FU对细胞的诱导作用均比单纯照射大,其中,以照射前24 h 加入75 μg/mL 5-FU细胞凋亡率高,5-FU与放射治疗联合能够增加对细胞的诱导作用,对放疗有增敏作用.5-FU在大剂量放疗中诱导细胞凋亡与凋亡抑制基因Bcl-2及凋亡促进基因Bax的表达有关.
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siRNA-ILK慢病毒载体的构建
目的 构建RNA干扰整合素连接激酶(ILK)基因的慢病毒载体并转染胰腺癌细胞(Panc-1),并验证其干扰有效性.方法 对胰腺癌Panc-1细胞进行细胞培养,成功构建ILK-specific shRNA慢病毒载体后对Panc-1细胞进行转染,荧光显微镜下观察,评估转染效率,然后通过Real time-PCR及Western Blot方法验证干扰基因片段的有效性.结果 成功构建siRNA-ILK慢病毒载体并转染Panc-1细胞,荧光显微镜下观察可见转染效率达80％以上,RNAi靶点病毒转染的细胞组(KD)的ILK mRNA及蛋白表达明显低于空蛋白组(NC)及正常细胞组(CON,P＜0.01).结论 成功构建RNA干扰ILK基因的慢病毒载体并转染胰腺癌细胞(Panc-1),验证了RNA干扰片段的有效性.
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基因沉默ILK对胰腺癌细胞增殖能力的影响
目的 研究基因沉默ILK对胰腺癌细胞 (Panc-1) 增殖能力的影响.方法 对胰腺癌Panc-1细胞进行细胞培养, 成功构建ILK-specific shRNA慢病毒载体后对Panc-1细胞进行转染, 荧光显微镜下观察评估转染效率, 然后通过real time PCR及Western blot方法验证干扰基因片段的有效性, 应用MTT方法比较转染前后各组胰腺癌细胞增殖能力变化.结果 荧光显微镜下观察可见慢病毒转染Panc-1细胞的感染效率达80％以上, 转染ILK-specific shRNA慢病毒载体后, ILK mRNA及蛋白表达水平明显降低, 在转染后48h、72h、96h时, 细胞增殖受到了明显的抑制, 且抑制趋势随时间逐渐增强 (P＜0.01) .结论 基因沉默ILK的胰腺癌细胞增殖能力受到明显的抑制.
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高强度聚焦超声联合脂质体介导 p53基因转染胰腺癌细胞的实验研究
目的：探讨HIFU联合脂质体介导p53基因转染胰腺癌细胞的可行性以及转染后对细胞生物学行为的影响。方法实验分为5组： I组为单纯细胞组， II组为HIFU＋质粒组， III组为HIFU＋脂质体＋质粒组， IV组为脂质体＋质粒组， V组为单纯质粒组。每组予以相应处理后，采用RT－PCR法检测各组细胞p53 mRNA表达情况， MTT法及流式细胞术检测细胞增殖、凋亡的情况。结果荧光显微镜下见Ⅲ组有较多绿色荧光蛋白表达的细胞（转染率为10.6％）， II组及IV组有少量的荧光细胞（转染率分别为1.2％，4.8％）； V组仅有极少的荧光细胞（0.3％）； I组无荧光表达； III组和IV组经RT－PCR法均检测到p53mRNA表达，且两组灰度值差异有显著性意义（ P＜0.05）； MTT结果显示II， III， IV 组细胞均有明显的生长抑制作用，而其中III组的增殖抑制作用为明显，与其它各组比较差异具有显著性意义（ P＜0.05）；Ⅲ组细胞凋亡率为（14.2±1.55）％，与其它4组比较，凋亡率明显增高（P＜0.05）。结论 HIFU联合脂质体可提高p53质粒转染率；p53质粒转染后促凋亡作用增强，肿瘤细胞生长进一步受到抑制。
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胰腺癌细胞对TRAIL耐药机制的研究进展
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL) 又称凋亡素2配体(APO-2L),它是1995年Wiley等首先从心肌中提取出来的凋亡分子,由于它可以选择性诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞发生凋亡,而对正常细胞几乎无明显杀伤作用[1],这无疑是失去手术机会的胰腺癌患者的一个福音.然而,并非所有的胰腺癌细胞株均对TRAIL敏感,如AsPC-1,CFPAC-1,Suit-2和HUVEC四种细胞系表现出对TRAIL的耐药,而BxPC-3和HPAC则对TRAIL十分敏感[2],因此,找出其中的耐药机制十分重要.
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微米中药胰腺康诱导人胰腺癌SW1990细胞凋亡的研究
目的:观察不同浓度的微米中药胰腺康对胰腺癌SW1990细胞作用的影响.方法:将微米中药胰腺康以不同浓度和时间作用于胰腺癌SW1990细胞,采用MTT比色法观察细胞毒性;应用HE染色法观察凋亡细胞的形态;采用免疫组化方法检测caspase-3蛋白的表迭.结果:微米中药胰腺康以剂量依赖和时间依赖的方式抑制SW1990细胞的生长.HE染色现察到凋亡细胞的形态学改变.caspase-3蛋白高表达.结论:微米中药胰腺康与其提取液相比,能更有效地抑制SW1990细胞增殖,其抗瘤作用与诱导细胞凋亡有关.为临床治疗胰腺癌提供理论依据.
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胰腺癌细胞纳米探针的磁共振荧光双模态成像及抗肿瘤效果观察
目的：探讨QDs＠ Gd‐RGD纳米探针用于MIA Ⅱ胰腺癌细胞磁共振（MRI）荧光双模态成像的效果及其对胰腺癌细胞的抑制作用。方法：构建QDs＠ Gd‐RGD纳米探针，将溶于磷酸盐缓冲液（PBS ）的QDs＠ Gd‐RGD纳米探针（QDs＠ Gd‐RGD组）、Gd（Gd组）分别与M IA Ⅱ胰腺癌细胞共孵育1 h ，Control组不做处理，然后用荧光相差显微镜及1．5 T M RI仪观察3组的成像特点。3组M IA Ⅱ胰腺癌细胞培养24 h后，观察细胞形态、增殖、克隆、迁移、细胞周期、凋亡的变化。结果：荧光相差显微镜下观察发现，QDs＠ Gd‐RGD纳米探针分布于MIA Ⅱ胰腺癌细胞膜，而Gd组及Control组细胞膜及细胞内未观察到荧光分布；1．5 T MRI成像显示，QDs＠ Gd‐RGD组信号强度明显高于Gd组、Control组（P＜0．05）。QDs＠ Gd‐RGD组MIAⅡ胰腺癌细胞失去典型铺路石样形态、细胞核碎裂、细胞质空泡化，细胞克隆能力明显下降，细胞增殖抑制，细胞迁移能力减弱，细胞周期明显被阻滞，细胞凋亡增加（P＜0．05）。结论：QDs＠ Gd‐RGD纳米探针用于MIA Ⅱ胰腺癌细胞MRI荧光双模态成像的效果较好；QDs＠ Gd‐RGD纳米探针体外对M IA Ⅱ胰腺癌细胞有一定的杀伤作用。
关键词： 胰腺癌细胞 QDs Gd-RGD M RI荧光双模态成像 靶向诊断 抗肿瘤治疗 -
花姜酮对胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制的研究
目的:探讨花姜酮(zerumbone)对人胰腺癌绌胞株BxPC-3和Panc-1迁移和侵袭的影响及其相关基因的表达.方法:以BxPC-3和Panc-1为研究对象,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)实验选择毒性较小的花姜酮浓度,用细胞划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验检测药物对细胞迁移和侵袭能力的影响,蛋白质印迹(Western blot)检测各细胞组CXC族趋化因子受体4(CXCR4)、促分裂原活化蛋白酶激酶1/2(MEK1/2)、磷酸化MEK 1/2(p-MEK1/2)、细胞外调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达变化.结果:花姜酮对BxPC-3和Panc-1细胞的生长均有抑制作用,且随着药物浓度的增高和作用时间的延长而增强(P＜0.05).低浓度药物作用后BxPC-3和Pane-1的划痕迁移率都低于对照组(P＜0.05).与对照组相比,Transwell迁移和侵袭实验中BxPC-3和Panc-1用药组的平均穿膜细胞数均减少(P＜0.05).蛋白质印迹检测结果表明:花姜酮抑制CXCR4、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达.结论:花姜酮具有抑制胰腺癌细胞株BxPC-3和Panc-1迁移和侵袭的作用,可能与下调CXCR4、p-MEK1/2、p-ERK1/2表达水平有关,为肿瘤的靶向治疗提供新的依据.
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表没食子儿茶素没食子酸酯对常氧及低氧状态下胰腺癌细胞的作用
目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对在常氧及低氧诱导下人胰腺癌细胞株BxPC-3的增殖、凋亡的影响及其相关基因的表达.方法:采用氯化钴(CoCl2)建立低氧模型,在常氧及低氧状态下,研究不同浓度EGCG对人胰腺癌细胞株BxPC-3的作用.采用四唑氮蓝(MTT)还原法检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞凋亡;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)和血管内皮生长因子A(VEGF-A) mRNA水平的表达变化;蛋白质印迹法(Western-blot)检测MMP-2和VEGF-A蛋白水平的表达变化.结果:低浓度的EGCG短时间内对BxPC-3细胞的生长无显著抑制作用,但随着作用时间的延长和剂量的增加,EGCG显示了细胞生长抑制作用;流式细胞仪结果显示EGCG可诱导胰腺癌细胞凋亡,低氧状态下其抑制作用低于常氧状态.EGCG可显著抑制MMP-2和VEGF-A蛋白的表达,下调MMP-2和VEGF-A mRNA的表达.结论:EGCG无论在常氧或低氧环境下均可以显著抑制胰腺癌BxPC-3细胞的生长,促进其凋亡,低氧状态下其抑制作用低于常氧状态下,提示在临床上胰腺癌化学治疗效果差可能与其肿瘤内低氧状态有关.其可能相关机制与下调VEGF、MMP-2表达水平有关.
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CD95在胰腺癌细胞化疗敏感性中的作用研究
目的探讨CD95系统在胰腺癌细胞对化疗敏感性中的作用.方法通过脂质体介导将CD95基因转入胰腺癌细胞株SW1990,G418筛选转导CD95基因的细胞克隆,Northern-blot和Western-blot检测转导细胞中CD95的表达;MTT法观察转导细胞对氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(ADM)、双氟脱氧胞苷(GCB)及与抗CD95单克隆抗体联合治疗的反应;流式细胞仪(FCM)检测化疗药诱导转导细胞凋亡的作用.结果 CD95基因转导的SW1990细胞可稳定地过表达CD95,其mRNA与蛋白的表达均较未转导及空白对照组显著增高,抗CD95单抗可阻滞转导细胞的生长.临床相关药物浓度的化疗药对转导细胞的生长抑制作用明显高于未转导细胞,加入抗CD95单抗可显著增强化疗药的作用.ADM诱导胰腺癌细胞凋亡作用较明显,且转导细胞显著高于未转导细胞.结论转导CD95基因可提高SW1990细胞对化疗药的敏感性,部分逆转其耐药性.化疗药与抗CD95单抗联合应用对胰腺癌细胞具有协同作用.
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小干扰RNA组蛋白去乙酰化酶1对人胰腺癌细胞甲基化的作用研究
基因甲基化是抑癌基因失活的主要机制.胰腺癌中许多抑癌基因因CpG岛异常超甲基化而失活,如人类错配修复基因1(human mutL homolog 1,hMLH 1)、维甲酸受体β基因(retinoic acid receptor,RAR-β)等.组蛋白去乙酰化后的异染色质蛋白1(heterochromatin protein 1,HP1)可募集DNA甲基转移酶,从而使基因启动子CpG岛甲基化[1].甲基化CpG结合蛋白通过与组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)复合体相互作用而实现其抑制作用[2].甲基化抑制基因转录有赖于抑制性染色质环境.HDAC1过表达可导致组蛋白去乙酰化.本研究通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术研究HDAC1在胰腺癌中对DNA甲基化的影响.
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外源野生型p53正向细胞凋亡调控因子基因对人胰腺癌PC-3细胞生长的作用
p53正向细胞凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)是新近发现的Bcl-2家族BH 3亚家族中的成员,是p53的靶基因,可被内外源性p53快速诱导,具有强大的促凋亡作用[1,2].研究发现,PUMA基因在许多肿瘤细胞系中低或不表达,转染外源性PUMA基因后,细胞凋亡被促进,动物移植瘤的生长明显受到抑制.在前期的工作中,我们检测了胰腺癌组织中PUMA表达情况发现,PUMA在肿瘤组织中的阳性表达明显低于瘤旁组织,并且肿瘤组织中细胞凋亡指数低于对照组,说明PUMA低表达引起的细胞凋亡抑制在胰腺癌的发生中起重要作用.本试验旨在观察PUMA基因转染抑制体外胰腺癌细胞的生长的效果.
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吉非替尼对胰腺癌细胞克隆形成与体外侵袭能力的影响及机制
吉非替尼是表皮生长因子(EGF)受体酪氨酸激酶抑制剂,能与ATP或酶的底物结合位点作用而影响酶的磷酸化.近期研究表明,吉非替尼对多种肿瘤细胞,例如结肠癌、前列腺癌、乳腺癌的生长有抑制作用[1].本研究旨在通过体外实验研究,探讨其对胰腺癌细胞的作用,尤其是对胰腺癌细胞的侵袭、体外克隆形成的影响及相关机制.
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小干扰RNA沉默人胰腺癌细胞内连锁凋亡抑制因子基因表达的研究
X连锁凋亡抑制因子(X-1inked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中有效的caspases抑制剂,它可直接抑制caspases并可多途径调节细胞凋亡,因而在肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用.研究表明,多种肿瘤细胞中XIAP呈高表达,抑制XIAP基因表达可诱导肿瘤细胞凋亡,进而抑制肿瘤生长[1,2].本研究应用近年来开展的RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),设计并合成针对XIAP编码基因的小干扰RNA(siRNA),于胰腺癌细胞BxPC-3中,观察siRNA能否产生肿瘤细胞内源性XIAP表达的转录后沉默,为胰腺癌基因沉寂疗法提供实验依据.
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5-脂氧合酶特异性抑制剂对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响
流行病学和动物研究表明,胰腺癌的发生发展与亚油酸、花生四烯酸(AA)等多聚不饱和脂肪酸的摄入有关.5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)是催化AA转化为5-羟二十碳四烯酸(5-HETE)和白三烯(LT)的关键酶.齐留通(zileuton)其化学名为N-[1-(苯并[b]噻吩基)-2-乙基]-N-羟基,通过抑制5-LOX活性而抑制AA转化为LTB4,是特异性5-LOX抑制剂.我们应用齐留通阻断5-LOX代谢途径,研究对胰腺癌细胞SW1990凋亡及凋亡相关基因bcl-2 mRNA和bax mRNA的影响,从而为胰腺癌的治疗寻找一种新的有效途径.
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自噬在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡中的作用
目的:研究自噬在吉西他滨(gemcitabine,Gem)诱导胰腺癌细胞SW1990凋亡中的作用,并以氯喹特异性抑制自噬,以探讨其可能机制.方法:采用CCK8法检测Gem对胰腺癌细胞增殖的影响,并用实时定量PCR检测自噬相关基因LC3的表达,以p62免疫荧光染色检测细胞内自噬泡,通过Western印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1的表达,并用Annexin V/PI流式细胞方法检测Gem诱导后细胞凋亡的变化.进一步通过氯喹抑制自噬,检测自噬抑制前后细胞增殖、自噬及凋亡的变化.结果:Gem对胰腺癌细胞SW1990增殖具有部分抑制作用,Gem作用能迅速激活细胞自噬从而产生耐药.LC3的mRNA表达升高1.4～2.2倍(P＜0.05),LC3-Ⅱ蛋白水平升高1.5～2.7倍(P＜0.05),Beclin 1蛋白含量升高1.2～1.3倍(P＜0.05).Gem和氯喹联合用药组较Gem单药组细胞凋亡蛋白Caspase3表达升高,细胞存活率从64.3％±3.1％降低为35.2％±3.4％(P＜0.05).结论:自噬在Gem诱导胰腺癌细胞凋亡的过程中可能起到保护作用,氯喹抑制自噬后可增强Gem的促凋亡作用.
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胰腺癌细胞中TRPV1受体参与EGFR介导的细胞功能研究
目的 研究T RPV1受体的表达变化对表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达的调控作用,及其对相关细胞功能的影响.方法 利用过表达技术和siRNA技术研究TRPV1表达变化对EGFR蛋白表达的影响,用CCK-8实验检测细胞的增殖,并用Real-time PCR实验对功能相关的癌基因Akt2和K-ras的表达进行检测.结果 在胰腺癌细胞中TRPV1过表达或是受激动剂激活后,EGFR的蛋白含量下调;反之,干扰TRPV1表达会使EGFR的蛋白表达增加;过表达TRPV1的胰腺癌细胞其增殖速率减缓;过表达TRPV1的胰腺癌细胞中原癌基因Akt2和K-ras的表达明显受到抑制,反之则激活其表达.结论 胰腺癌细胞中T RPV1的表达调控了 EGFR的蛋白含量,并对与其功能密切相关的细胞增殖和癌基因表达也有调节作用.
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干扰素γ对人胰腺癌细胞CD44蛋白表达的影响
目的:探讨干扰素γ(IFNγ)对人胰腺癌细胞CD44蛋白表达的影响.方法:使用CD44s,CD44v9,CD44v6和CD44v4单抗,采用流式细胞分析和免疫组化方法检测IFNγ作用于人胰腺癌细胞(SW1990)48 h后,CD44蛋白表达的变化.结果:IFNγ作用48 h后,SW1990细胞实验组CD44s,CD44v9,CD44v6和CD44v4的表达均较对照组升高,其中CD44v6和CD44v4表达增加在统计学上有显著意义(P<0.05).结论:IFNγ对人胰腺癌细胞CD44蛋白的表达有调节作用.
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Tif1γ在胰腺癌细胞凋亡中的作用
目的 通过吉西他滨(gemcitabine,GEM)与雷替曲塞(raltitrexed,RTX)分别单纯处理人胰腺癌Capan-1细胞,观察转录中介因子1γ (transcriptional internediary factor 1 gamma,Tif1γ)及其信号通路对细胞凋亡的影响.方法 人胰腺癌Capan-1细胞经GEM和RTX分别处理36 h,用流式细胞术检测细胞凋亡的变化,用Western blot检测Tif1γ、TGF-p1、Smad3、p-Smad3、Smad4、Bcl2、BAX和Caspase3蛋白质水平的变化. 结果 流式细胞术检测结果显示,Capan-1细胞经RTX处理后,细胞晚期凋亡(28.7％±5.1％)与死亡(3.7％±0.5％)比例明显高于GEM处理组和对照组(P＜0.01).Western blot结果显示,与GEM处理组和对照组相比,RTX处理可引起Tif1γ、TGF-β1、p-Smad3、BAX和Caspase3蛋白质水平增高,而Smad4蛋白质水平与Bcl2/Bax比值降低.结论 RTX通过增高Tif1γ在Capan-1细胞中的表达,降低Smad4水平,调节凋亡蛋白Bcl/Bax之间的平衡,提高Caspase3水平,诱导细胞凋亡.
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TGFα-PE40对人胰腺癌细胞生长的抑制作用
目的探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PE40,简称TP40)对人胰腺癌细胞生长的导向抑制作用.方法用免疫组化LSAB法检测人胰腺癌SW-1990细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达,用结晶紫染色法和3H-亮氨酸掺入法检测TP40对SW-1990细胞生长及蛋白质合成的抑制,用过量被生长因子(EGF)竞争拮抗TP40的细胞毒作用.结果 SW-1990细胞免疫组化显示出大量棕黄色的EGFR阳性染色.TP40浓度为1～100ng/ml时,对SW-1990细胞生长及蛋白质合成呈剂量依赖性抑制.过量EGF能完全拮抗TP40的细胞毒作用.结论人胰腺癌SW-1990细胞能高水平地表达EGFR,重组TP40对SW-1990细胞生长具有较强的抑制作用,作用部位为细胞的EGFR.
