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2.122豚鼠结肠平滑肌细胞L型钙通道特性研究
目的全细胞式膜片钳技术研究豚鼠结肠平滑肌细胞的L型钙通道特性,以加深对胃肠动力调控的认识及有利于胃肠动力药物的开发.方法豚鼠,200～400g,木瓜蛋白酶酶消化法分离结肠纵肌细胞.全细胞膜片钳法记录单细胞的钙通道电流.
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酶消化法分离人肥大细胞及组织胺水平测定
肥大细胞数目增加及其介质浓度在体液中的增高已发现与支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎及关节炎等疾病有关.但是,迄今为止研究人类肥大细胞体外激活及抑制的手段却十分有限.本研究采用的酶消化法悬浮肥大细胞技术,具有加样均匀、重复性好、经济、省时等优点;并可与多种其他类型细胞相混合,因此,既能用于观察对肥大细胞的直接刺激,又能观察间接刺激.
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透射电镜及激光共聚焦技术观察体外丙型肝炎病毒感染的人胎盘滋养层细胞
目的:探讨体外分离培养的人体胎盘滋养层细胞感染丙型肝炎病毒(HCV)的可能性,以及滋养层细胞感染HCV后的超微结构改变.方法:采用胰蛋白酶消化法及Percoll密度梯度分离法分离培养人胎盘组织中滋养层细胞后,以HCV RNA阳性血清对滋养层细胞进行体外感染试验,应用RT-PCR法定性及定量检测感染后细胞培养上清中HCV RNA,透射电镜观察HCV感染后滋养层细胞的超微结构改变,并用激光共聚焦技术观察免疫荧光染色后HCV NS5在滋养层细胞中的定位.结果:HCV感染后的细胞培养上清中可间断检测到HCVRNA,而对照组始终未检出;激光共聚焦观察显示HCV NS5主要定位于细胞核周;HCV感染后滋养层细胞超微结构发生了明显改变,主要表现为溶酶体大量增生,粗面内质网增生,脂滴减少,出现空泡状结构,并可观察到病毒样颗粒.结论:HCV可以感染滋养层细胞,并导致滋养层细胞的超微结构发生类似黄病毒科病毒感染后的改变.
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新生鼠心脏成纤维细胞原代培养及脂质体转染条件优化的实验研究
目的：探讨新生大鼠心脏成纤维细胞（CFs）的原代培养方法及脂质体转染条件的优化。
方法：酶消化法原代培养CFs，倒置显微镜下观察细胞生长状态，免疫细胞化学染色鉴定CFs，并采用脂质体转染原代CFs，流式细胞术检测转染率。 -
尼古丁诱导人气道成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化
吸烟是COPD的主要致病因素,气道重塑是COPD患者出现持续气流受限的主要病理基础.尼古丁占烟草生物碱总量的95％以上,尼古丁对COPD发病,特别是对气道重塑有着重要影响.我们以原代培养的人气道上皮下成纤维细胞为研究对象,观察尼古丁对成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的影响,以探讨尼古丁在COPD气道重塑中的作用.材料与方法癌周正常肺组织取自广州医学院第一附属医院胸外科2010年1-6月手术治疗的40～60岁肺癌患者,进行细胞原代培养及鉴定[1],分离正常支气管组织后用酶消化法及差速贴壁法获得支气管成纤维细胞,用含有100 U/L青霉素、100 mg/L链霉素和10％胎牛血清的DMEM/F12培养基,置于95％空气、5％ CO2和37℃孵育箱中常规培养及传代.
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人角膜缘干细胞提取方法的比较性研究
目的：比较组织块培养法、酶消化法及平板离心法获取角膜缘干细胞的不同。方法：取得人组织，分别应用组织块培养法、酶消化法及平板离心法获得角膜缘细胞并进行原代细胞培养，对获得的细胞通过免疫组化方法研究其p63、ABCG2及K3表达情况，以比较上述3种方法的不同之处。结果：3种方法均可获取大量阳性表达p63、ABCG2及阴性表达K3的细胞，符合角膜缘干细胞特点，但其中组织块培养法中阴性表达p63的细胞略多，并偶见阳性表达K3的细胞；另外，在提取细胞的实验操作方面，组织块培养法耗时约7天，酶消化法耗时约1天，平板离心法耗时约2天；在获得细胞量方面，1枚人角膜缘材料酶消化法可获得的细胞数量在此3种方法中通常少。结论：平板离心法在目前常用的人角膜缘干细胞提取方法中可能是具优越性的。
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人成骨细胞体外培养、鉴定及护骨素表达的研究
目的用酶消化法从正常人松质骨中分离成骨细胞,进行体外培养和功能鉴定,观察用17β-雌二醇(17β-E2)和雌激素受体拮抗剂ICI182780处理后,成骨细胞中护骨素(OPG)的表达变化.方法用胰酶-胶原酶消化法从正常人松质骨中分离培养成骨细胞,I型胶原染色用Van Gieson法,钙化结节用茜素红染色,用钙钴法显示成骨细胞中碱性磷酸酶的表达,骨钙素和OPG基因的表达用RT-PCR检测,OPG蛋白用Western Blot检测.结果用酶消化法分离的人成骨细胞,在体外培养时可维持合成I型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素,并形成钙化结节等功能;体外培养的人成骨细胞表达OPG,17β-E2上调其表达,并能被雌激素受体拮抗剂ICI182780阻断.结论用酶消化法进行人成骨细胞培养,方便易行,可培养大量高纯度人成骨细胞供研究使用;17β-E2上调OPG表达,而绝经后雌激素缺乏时,OPG的表达相应减少,可能是骨质疏松的发病因素之一.
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人口腔粘膜上皮角朊细胞的体外培养
人口腔粘膜上皮角朊细胞的原代培养有许多困难，其中主要是上皮细胞接种成活率、产量和成纤维细胞污染的问题。我们比较酶消化法和组织块法建立口腔粘膜上皮角朊细胞体外培养模型，并用免疫组织化学法进行培养细胞的定性研究。 1．材料：培养物来源于5个月～10岁唇裂患者修复术中的口内粘膜。切取唇内侧粘膜组织修复剩余物若干，每块约0.5 cm×0.5 cm大小。 2．方法：①酶消化法：用D-Hanks液冲洗粘膜块，剪切至0.2 cm×0.2 cm大小。配制0.3 kg/LⅠ型胶原酶和0.4% Dispase消化液的混合液（1∶1）5 ml，将粘膜块放入其中，密闭放入4℃冰箱内12～20 h。将表皮从基底撕脱，放入5 ml 0.25%胰蛋白酶液中吹打5 min，终止消化。低速离心5 min，去上清，加入5 ml含15% 胎牛血清的基础培养液中，制成细胞悬液并调整细胞数目在5×108/L，接种于25 ml培养瓶中。②组织块法：将肉眼可见的粘膜下组织尽量去除。剪切至0.1 cm×0.1 cm大小，用探针将小组织块以0.5 cm的间距放于25 ml培养瓶内用多聚赖氨酸处理过的小盖片。轻轻翻转，放入37℃温箱2～4 h，加入2 ml含15%胎牛血清的基础培养液，轻轻翻转培养瓶，使培养液浸没组织块，静置培养，每周换液2次。
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人乳牙破牙细胞的体外分离培养及鉴定
目的 采用酶消化法建立成熟人破牙细胞分离和培养方法,为探讨破牙细胞的组织形态学特点及生物学特性奠定基础.方法 采用酶消化法从新鲜离体乳牙中分离获得破牙细胞,结合相差显微镜、苏木素-伊红(HE)染色、特异性抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase staining,TRAP)染色和扫描电镜对破牙细胞进行组织形态学观察和硬组织吸收功能鉴定.结果 采用酶消化法可分离得到成熟的破牙细胞,形态学上表现为多核巨细胞、有多个伪足；TRAP染色结果显示破牙细胞胞质呈酒红色阳性着色；扫描电镜下观察可见与细胞共培养的牙硬组织薄片表面有吸收陷窝形成.结论 应用酶消化法可以从离体吸收乳牙中成功分离获取人破牙细胞,可为探讨人乳牙根吸收机制提供细胞模型.
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改良酶消化法在人脑胶质瘤细胞快速原代培养中的应用
目的 建立一种人脑胶质瘤细胞原代培养的改良酶消化法.方法 基于文献并结合实际工作中经验,改良既往文献报道的酶消化法,对32例不同级别的胶质瘤进行消化后行原代细胞培养,通过倒置相差显微镜观察肿瘤细胞的形态学特点,传代时采用差速贴壁法对原代细胞进行纯化.采用细胞免疫荧光法对原代细胞进行鉴定,通过细胞增殖实验(CCK-8法)绘制生长曲线,研究体外培养细胞的增殖情况.结果 采用改良的酶消化法成功培养28例,失败4例,成功率为87.5％.培养成功的细胞贴壁生长,细胞状态稳定,形态各异,生长状态良好,并可传代.细胞免疫荧光检测显示胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性,证明培养的细胞为胶质瘤细胞;细胞增殖实验显示细胞在体外增殖活跃,肿瘤病理级别越高,细胞增殖能力越强.结论 改良的酶消化法用于人脑胶质瘤细胞原代培养具有简单、高效、成功率高等优点.
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吗啡对体外培养正常女性成骨细胞的增殖及BGP mRNA表达的影响
目的:观察阿片类药物是否对体外培养正常女性成骨细胞增殖有影响.方法:用胰酶-胶原酶消化法从正常女性松质骨中分离培养成骨细胞,用茜素红染色法、改良Gomonri钙钴法鉴定成骨细胞;制备不同浓度的吗啡及其拮抗剂纳洛酮,作用于体外培养的成人正常成骨细胞上,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测吗啡对其的影响;通过RT-PCR法半定量分析不同浓度的吗啡及其拮抗剂纳洛酮对成骨细胞骨钙素(BGP mRNA)表达的影响.结果:用酶消化法分离的人成骨细胞,在体外培养时可合成碱性磷酸酶(ALP)、形成钙化结节.不同浓度的吗啡组与对照组OD490(optical density,OD)值相比差异有显著性(P<0.001);1×10-7 molL-1、1×10-6 molL-1、1×10-5 molL-1和1×10-4 molL-1吗啡组的细胞增殖速度依次降低(P＜0.001);而吗啡(10-5 molL-1)+纳洛酮(10-5 molL-1)组与对照组OD490值相比差异不明显(P>0.05).吗啡作用24 h呈剂量依赖性抑制BGP mRNA的表达.结论:用酶消化法进行人成骨细胞培养,简捷易行,可培养大量高纯度人成骨细胞供研究使用;外源性阿片类药物吗啡可直接抑制人成骨细胞的增殖.阿片类物质可以抑制成骨细胞内BGP mRNA的表达.
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酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞
目的:采用酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞,为血管疾病,特别是为动脉粥样硬化研究提供大量的原代平滑肌细胞.方法:无菌取老龄SD大鼠主动脉,0.2%Ⅱ型胶原酶消化分离细胞.采用自然纯化、差速贴壁纯化平滑肌细胞,免疫组化鉴定平滑肌细胞α肌动蛋白.结果:免疫组化染色显示细胞纯度在95%以上.结论:酶消化法分离获取SD大鼠平滑肌细胞方法简单,易掌握,采用本方法可稳定获得大量的平滑肌细胞供实验使用.
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脂肪干细胞分离纯化方法研究进展
脂肪干细胞作为种子细胞广泛应用于组织工程中，而获得足够量的、活性高的、高纯度的脂肪干细胞是其在组织工程中应用的前提。本文综述近几年来脂肪干细胞分离纯化方法的研究进展，比较各方法的优缺点，为分离纯化出理想的脂肪干细胞提供理论依据。
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不同培养方法对牙周膜细胞生物学特性的影响
目的 探讨酶消化法和组织块法是否影响牙周膜细胞的特性.方法 培养牙周膜细胞,检测克隆形成能力及细胞周期分析,Stro-1的表达,实时定量RT-PCR检测.结果 酶消化法培养的PDLCs+G2M明显高于组织块法的PDLC;酶消化法培养的PDLC克隆形式能力明显高于组织块法培养的PDLC;酶消化法培养的PDLC Stro-1的表达明显高于组织块法培养的PDLC;酶消化法培养的PDLC成骨标志物的表达明显高于组织块法培养的PDLC.酶消化法培养的牙周膜细胞具有更强的增殖能力和间充质干细胞含量更多,成骨标志物表达更强.结论 酶消化法和组织块法影响牙周膜细胞的某些特性.
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改良酶消化法培养成骨细胞的研究
[目的]采用改良胶原酶法体外培养大鼠颅骨成骨细胞.[方法]取新生24 h SD大鼠颅骨,剔净后剪成碎块.依次以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA和0.1% Ⅰ型胶原酶消化后,培养于α-MEM培养液中.倒置显微镜下观察形态学变化,钙钴染色法检测ALP活性,茜素红染色法观察矿化结节的形成.[结果]培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶呈阳性.[结论]采用改良胶原酶法培养的成骨细胞操作简便,成活率高,细胞具有典型的成骨细胞形态特征,且成分较单一.
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酶消化组织块盖玻片培养法原代培养人牙周膜细胞
人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,HPDL)是牙周组织中重要的细胞成分,其可产生胶原纤维,能合成胶原并释放到胞外基质,对牙体组织有着重要作用.基于牙周膜细胞的重要角色, 广大学者对HPDL 的研究数不胜数,而体外培养是研究HPDL 体外模型的一种主要方法,传统的细胞体外培养方法有酶消化法和组织块法.
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神经干细胞的生物学特性和体外培养鉴定
神经干细胞(NSCs)是具有自我更新和多向分化能力的细胞,存在于胚胎、胎儿和成人的脑室下区、齿状回、纹状体、室管膜下区等部位.通过机械分离或酶消化法能从其存在部位分离出NSCs.当培养基中表皮生长因子(EGF)和成纤维生长因子(bFGF)浓度均为20 ng·mL-1时,NSCs能通过对称分裂和不对称分裂在体外增殖,当培养基中bFGF浓度为1～10ng·mL-1时,NSCs可向神经元和胶质细胞分化.目前,表达Nestin、自我增殖和多潜能分化能力是鉴定NSCs的三大条件,但还没有NSCs特异性的鉴定方法.
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三种方法原代培养人牙周膜细胞
背景:牙周膜细胞培养是牙周细胞生物学研究的基础.牙周膜细胞原代培养因其成功率较低,一直是制约牙周细胞生物学研究的瓶颈之一.如何寻找一种简单有效的培养方法,提高原代培养成功率一直是近年来牙周细胞生物学的研究热点之一.目的:比较组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法对人牙周膜细胞的培养效果,探索一种更有效的人牙周膜细胞的体外培养方法.方法:取58例正常恒牙牙周膜组织,随机分为3组,分别采用组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法进行原代培养,再进行传代培养、倒置显微镜下观察细胞生长情况以及细胞形态;免疫组织化学鉴定波形蛋白与角蛋白;取第4代细胞,绘制生长曲线.结果与结论:酶消化结合组织块法培养成功率(35%)明显高于其他两种方法(11%和21%).3种方法获得的细胞均符合正常人牙周膜细胞形态学特征和生物学特征,生长良好.第4代细胞生长曲线均为近似的"S"形,有明显的滞留期、对数生长期和平台期.提示实验建立的酶消化结合组织块法较为简单并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜细胞的可行办法.
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膀胱上皮细胞的体外原代培养方法
背景:国内外获得原代人正常膀胱上皮细胞的方法包括酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法,这些方法各有优缺点,培养基中成分多不易把握,效率不高.目的:分析人膀胱上皮细胞原代培养的佳方法.方法:在同一实验条件下,采用酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法3种不同的原代细胞培养方法培养人正常膀胱黏膜膀胱上皮细胞.结果与结论:酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法各组膀胱上皮细胞培养成功率分别为13.3%,26.7%,86.7%,3组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.001).3组培养的人膀胱上皮细胞角蛋白AE1/AE3荧光染色均呈阳性.说明组织块培养法是一种简单,短期内可扩增出较多纯净的膀胱上皮细胞的原代培养方法.
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构建组织工程瓣膜支架中3种去垢剂的比较
背景:目前,组织工程瓣膜去细胞支架的制备方法和效果各不相同,但总的来说,酶结合去垢剂法显示出一定的优势作用.目的:探讨脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、曲拉通3种去垢剂结合酶消化法对于猪主动脉瓣膜脱细胞的效果以及去细胞后对支架的影响.方法:将新鲜猪主动脉瓣膜用抗生素溶液浸泡12 h后,置于胰蛋白酶和EDTA溶液中12 h,再分别用脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、曲拉通进行处理,后转入核酸酶溶液中浸泡12 h,以达到去除内皮细胞和间质细胞的目的,常规苏木精一伊红染色观察内皮细胞是否除完全,Masson染色观察胶原纤维和弹力纤维损害程度,电子扫描显微镜观察纤维结构以评价效果.结果与结论:3种去垢剂结合酶消化法均能彻底去细胞,但脱氧胆酸钠对支架胶原纤维和弹力纤维的损害较轻微,十二烷基硫酸钠次之,曲拉通对支架的损害作用大.提示脱氧胆酸钠结合酶消化法是一种较合理的组织工程瓣膜支架构建方法.
