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胃癌组织中肝素酶和血管内皮生长因子-C的表达及其临床意义
目的探讨胃癌组织中肝素酶和血管内皮生长因子(VEGF)-C蛋白表达及其临床意义.方法采用免疫组化S-P法检测97例原发性胃癌组织、癌旁组织及20例正常胃黏膜组织中肝素酶和VEGF-C蛋白的表达,并分析其与临床病理特征和预后的关系.结果胃癌组织肝素酶和VEGF-C蛋白表达阳性率分别为61.9%和66.0%,显著高于癌旁组织的7.2%和5.0%,正常胃组织的8.3%和5.0%(P值均＜0.01);肝素酶表达与肿瘤分化程度无关,但与肿瘤直径、淋巴结转移、静脉侵犯、淋巴管侵犯、远处转移、浆膜面受累和TNM分期等密切相关;VEGF-C表达与肿瘤直径、分化程度、静脉侵犯及远处转移等无关,但与淋巴结转移、淋巴管侵犯、浆膜面受累和TNM分期等密切相关;肝素酶和VEGF-C阳性表达组术后生存率明显低于阴性组;在胃癌中肝素酶和VEGF-C阳性表达呈正相关.结论肝素酶及VEGF-C蛋白的阳性表达,可作为胃癌预后不良的参考指标.
关键词： 胃肿瘤 肝素酶 血管内皮生长因子-C 预后 -
早期生长反应基因-1在胃癌中异常表达及其与肝素酶转录水平的关系
胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,侵袭及转移是导致其预后不良的主要原因~([1]).解析胃癌侵袭、转移的分子机制及其防治策略已成为关注的焦点.
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肝素酶介导的肝癌细胞与血管内皮细胞黏附及穿内皮迁移
目的:探讨肝素酶(heparanase,HPSE)对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCc)细胞与血管内皮细胞黏附及穿内皮迁移的影响.方法:选用人正常脐静脉内皮细胞株HUVEC-C,肝LO-2细胞,肝癌HepG2、BEL-7402和HCCLM3细胞,用Real-time PCR筛选高表达HPSE的HCC细胞;设计4个HPSE基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列、构建质粒,并筛选出优RNAi质粒;用该RNAi质粒转染高表达HPSE的HCC细胞,同时设空白对照组、阴性对照组和未转染的HCC细胞组;黏附试验观察各组HCC细胞与HUVEC-C细胞的黏附情况;Transwell小室法观察HCC细胞穿HUVEC-C细胞迁移情况;癌细胞均以0.25％玫瑰红染色、光镜下观察;酶标仪法分别测定脱色后各组细胞D值并分析比较.结果:HCCLM3细胞HPSEmRNA表达水平显著高于肝LO-2、HepG-2和Bel-7402细胞[(5.72±0.62) vs (1.05 ±0.09)、(2.65±0.31)和(3.43±0.58),均P＜0.01)l;设计的4个HPSE之RNAi载体,以siHPSE-3158对HPSE基因表达的抑制效果佳(P＜0.05).RNAi组HCCLM3细胞与HUVEC-C细胞黏附率显著低于空白对照组、阴性对照组和未转染的HCCLM3细胞组[(0.31 ±0.04) vs (0.46±0.06)、(0.45 ±0.05)和(0.64±0.09),均P＜0.01)].RNAi组HCCLM3细胞穿HUVEC-C细胞迁移率也显著低于空白对照组、阴性对照组和未转染的HCCLM3细胞组[(0.28 ±0.03) vs (0.41 ±0.04)、(0.41±0.05)和(0.43±0.05),均P＜o.05)].结论:HPSE参与介导HCC细胞与血管内皮细胞的黏附及HCC细胞穿内皮迁移,可能是HCC微血管捕获、血行转移的重要因素.
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肝素酶在肿瘤转移中的作用
肝素酶(heparanase)是一种能降低细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)的内切糖苷酶.它参与细胞表面细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的降解和重塑,促进多配体蛋白聚糖-1(syndecan-1)的合成和释放;它在内涵体和溶酶体等细胞器中具有管家基因的功能,广泛表达于人类的肿瘤细胞中,在侵袭型的动物肿瘤细胞中也过度表达,因此它的过度表达被认为能促进肿瘤的浸润与转移.近的研究显示,肝素酶能释放硫酸乙酰肝素依赖的生长因子并能产生大量有活性的硫酸乙酰肝素片段,破坏、降解细胞外基底膜屏障,促进肿瘤细胞扩散和转移,并加快血管生成,对肿瘤患者的预后造成了不利的影响.现在,越来越多的肝素酶抑制剂(PI-88、肝素、肽类、硫酸昆布多糖、RNA干扰和苏拉明等)正在被开发出来,并显示出良好的前景.深入研究肝素酶在肿瘤转移和调节中的作用可能会带来肿瘤治疗的新手段.
关键词： 肝素酶 肿瘤 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 转移 治疗 -
微生物肝素酶研究进展
综述了近年来微生物肝素酶的来源、分离纯化、酶学性质、催化机理、克隆表达和应用等方面的研究进展.
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肝素酶的发酵工艺研究
优化了发酵培养肝素黄杆菌生产肝素酶的半合成培养基配方,种子液种龄48h,接种量10%,装量90ml/(750ml摇瓶),25℃培养32h.采用该优化方案,肝素酶的发酵水平可达1768u/L,较合成发酵培养基提高52%.
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CaCO3促进肝素黄杆菌产肝素酶机理的研究
研究了CaCO3促进肝素黄杆菌产肝素酶的机理.结果显示,CaCO3除具调节pH的作用外,其分解产物Ca2+对产酶有促进作用,而CO32-则刺激菌体生长.研究还表明,肝素黄杆菌发酵产肝素酶的佳pH在6.2左右.
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靶向肝素酶基因的microRNAs在胃癌中的表达
目的 检测胃癌组织中肝素酶基因( heparanase,HPA)及可能靶向其表达的microRNAs (miRNAs)的表达水平.方法 应用实时定量PCR检测HPA在胃癌组织中的表达变化；根据miRNAs与HPA 3’非翻译区(3'-UTR)序列的结合情况,运用生物信息学方法筛选出可能靶向HPA的miRNAs,并利用实时定量PCR检测这些miRNAs在胃癌组织中的表达水平.结果 HPA在胃癌组织中表达水平较癌旁组织和正常组织高；生物信息学分析显示,miR-18b、miR-137、miR-502和miR-299-3p可能结合于HPA的3'-UTR上,抑制其表达；实时定量PCR检测结果显示,胃癌组织miR-18b、miR-137、miR-502和miR-299-3p的表达均较癌旁组织和正常组织低.结论 胃癌组织HPA高表达,而可能靶向HPA的miR-18b、miR-137、miR-502和miR-299-3p低表达,提示上述靶向HPA的miRNAs可能参与了胃癌的发生发展.
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人肝素酶蛋白的表达及其单克隆抗体的制备
目的 构建人肝素酶蛋白的原核表达载体,表达并纯化重组人肝素酶蛋白和制备其单克隆抗体.方法 将人肝素酶cDNA克隆至原核表达载体pET30a(+), 经大肠杆菌表达、纯化后,获得的肝素酶纯化蛋白免疫小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备能产生肝素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Western blotting、ELISA等技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定.结果 原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达人肝素酶蛋白,并进一步从10株杂交瘤细胞中选取了3株能稳定分泌人肝素酶单抗的杂交瘤细胞株.结论 成功制备了3株人肝素酶特异性单克隆抗体.
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肝素酶RNAi对HepG2肝癌细胞生物学行为的影响
目的 利用筛选出的肝素酶有效干扰细胞株HepG2/RNAi/1和HepG2/RNAi/3研究肝素酶RNAi对HepG2肝癌细胞生物学行为的影响.方法 通过MTT实验、流式细胞技术、平皿克隆形成实验、Transwell侵袭实验、裸鼠成瘤实验分别检测HepG2肝癌细胞肝素酶RNAi后生长速度、单个细胞形成克隆能力、侵袭能力及成瘤能力的变化.结果 MTT实验表明HepG2/RNAi/1与HepG2/RNAi/3组细胞增殖能力明显低于HepG2组和HepG2/RNAi/N组;流式细胞生长周期实验表明,与HepG2和HepG2/RNAi/N细胞相比,HepG2/RNAi/1与HepG2/RNAi/3 G0/Gl期细胞比例增加,而增殖指数下降;平皿克隆形成实验表明HepG2/RNAi/1与HepG2/RNAi/3组单个细胞形成克隆的能力与HepG2组和HepG2/RNAi/N组相比显著降低[分别为(34±4)、(26±5)和(138±7)、(123±22),P<0.05)];Transwell体外侵袭实验表明,HepG2/RNAi/1与HepG2/RNAi/3细胞穿膜数较HepG2和HepG2/RNAi/N细胞穿膜数明显减少[分别为(85.1±9.1)、(78.1±10.4)和(182.2±9.7)、(183.5±9.3),P<0.05)];裸鼠成瘤实验显示,HepG2、HepG2/RNAi/N细胞成瘤率为100%,虽然HepG2/RNAi/1细胞成瘤亦为100%.但裸鼠皮下肿瘤体积较HepG2、HepG2/RNAi/N细胞明显缩小[分别为(0.099±0.030)和(0.585±0.135)、(0.690±0.099).P<0.01)],而HepG2/RNAi/3细胞裸鼠皮下未见肿瘤形成.结论 肝素酶RNA干扰可以明显抑制HepG2肝癌细胞增殖速度、单个细胞克隆形成能力、体外侵袭能力以及裸鼠皮下成瘤能力.
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小鼠肝素酶H-2Kb限制性CTL表位的实验鉴定
目的 实验鉴定H-2Kb限制性小鼠肝素酶(mHpa)CTL表位.方法 5条mHpa表位分别负载C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞,并进一步诱导产生表位特异性的效应细胞,采用标准4 hCr释放试验检测效应细胞对不同靶细胞的免疫杀伤效应;采用ELISPOT检测效应细胞分泌IFN-γ的能力.结果 5条mHpa CTL表位中,仅mHpa398-405和mHpa519-526可以诱导小鼠产生特异性CTL.对同来源的B16黑色素瘤细胞、Lewis肺癌细胞和EL-4淋巴瘤细胞具有明显的免疫杀伤效应,而对H-2Kb阴性的P815肥大细胞瘤细胞不具有免疫杀伤效应,进一步研究发现,上述多肽特异性CTL对自体淋巴细胞和DC细胞不具有杀伤效应,另一方面,mHpa398-405和mHpa519-526还可促进效应细胞分泌IFN-γ的能力.结论 mH-pa398-405、mHpa519-526为小鼠肝素酶来源且受仟12Kb限制性CTL表位,小鼠体内可以诱导产生表位特异性的CTL反应.
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肝素酶CTL表位负载的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤免疫效应研究
目的 研究肝素酶(Hpa)多肽疫苗体外能否诱发肝素酶特异性CTL反应,为肝素酶多肽疫苗的临床应用提供理论依据.方法 5条HLA-A2限制性肝素酶抗原表位[Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(353-361)(PLLSDTFAA)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(400-408)(PLPDYWLSL)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)]分别负载正常人外周血来源(PBMC)的树突状细胞(DC),诱导肝素酶特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),采用4 h标准51Cr释放实验检测上述CTL对不同肿瘤细胞的免疫杀伤效应,采用ELISPOT方法检测肝素酶表位肽负载的DC疫苗刺激的效应细胞IFN-γ的释放.结果 5条肝素酶多肽表位中,只有Hpa(525-533)、Hpa(277-285)和Hpa(405-413)体外可以诱导肝素酶表位特异性CTL反应,对Hpa阳性且HLA-A2阳性的KATO-S胃癌细胞、U2OS骨肉瘤细胞、SW480结肠癌细胞具有明显的杀伤效应.对HLA-A2阴性的HepG2肝癌细胞和Hpm阴性的MCF-7乳腺癌细胞不具有杀伤效应,但对转染了HLA-A2的HepG2细胞和转染了肝素酶质粒的MCF-7细胞恢复杀伤效应,对自体淋巴细胞不具有杀伤效应,进一步研究表明,Hpa(525-533)、Hpa(277-285)和Hpa(405-413)表位肽可以促进CTL细胞IFN-γ的释放.结论 人肝素酶特异性抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环,这种肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点,为肝素酶表位多肽疫苗的临床应用提供了理论依据.
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肝素酶:中晚期肿瘤治疗的理想靶位
恶性肿瘤是当前严重影响人类健康的重要的疾病之一,而肿瘤的侵袭和转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因.
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肝素酶多肽在胃癌组织芯片表达及其与患者预后的关系
转移、低未分化和TNM分期Ⅲ、Ⅳ期的胃癌组织中明显增高,阳性表达者预后较差,1年、5年生存率较低.结论 肝素酶MAP2多肽与肝索酶全蛋白相似,其表达与胃癌的侵袭、转移及预后密切相关,对临床治疗和预后判断有一定指导意义.
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肝素酶在唾液腺腺样囊性癌中的表达及其意义
目的 探讨肝素酶在唾液腺腺样囊性癌中的表达及与肿瘤的临床病理及生物学行为的关系.方法 采用免疫组化S-P法检测35例唾液腺腺样囊性癌和正常腺体中肝素酶的表达.结果 35例腺样囊性癌标本中肝素酶表达阳性为32例,阳性率为91.4%.肝素酶的表达主要位于胞膜及胞质.在实性型以及神经侵袭的标本中表达增强(P＜0.05),但其表达强度与性别、年龄无关.肝素酶在正常腺体内没有表达.结论 肝素酶的表达与腺样囊性癌的侵袭以及预后关系密切.
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酶法制备低分子量肝素及其活性研究
用肝素酶Ⅰ(heparinase Ⅰ,EC 4.2.2.7)对肝素进行控制性降解,分别在反应16,32,48 h终止反应,超滤离心粗分级后,用Bio-Gel P6低压柱色谱分离纯化,得到3组不同分子量范围的肝素寡糖混合物.用生色底物法和羊血浆法测定抗X a活性和抗Ⅱa活性.不同反应时间得到的肝素寡糖的抗X a和抗Ⅱa活性分别为82.4/40.3、21.5/11.8和5.6/4.5 IU/mg,其抗Xa/抗Ⅱa活性值分别为2.04、1.82和1.24.结果表明降解16 h所得寡糖可供制备符合小分子肝素药物质控要求的产品.
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以肝素酶为靶点的抗肿瘤药物研究进展
恶性肿瘤一直以来都是全球范围内的热门课题,肿瘤细胞的恶性转移是肿瘤致死率居高不下的重要原因.研究发现,肝素酶(Heparanase,HPA)在肿瘤发展的过程中起关键作用,是抗肿瘤治疗的重要靶点;肝素酶抑制剂,通过降低HPA的活性或抑制HPA的表达,有效抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移,是颇具潜力的抗肿瘤治疗药物.文章对HPA作为肿瘤治疗靶点以及针对该靶点的抗肿瘤新药研发进行了综述,重点介绍了具有干扰HPA活性的底物类似物——肝素衍生物SST0001和硫酸化寡糖PG545、小分子化合物,以及抑制HPA表达的小干扰RNA(siRNA)等,为设计合理、高效的肝素酶抑制剂提供参考.
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肝素酶在胃癌组织中表达的临床意义探讨
目的:探讨肝素酶表达在胃癌发生、发展中的作用.方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)测定42例胃癌和26例非癌组织中肝素酶的表达情况.采用χ2检验比较肝素酶的表达与胃癌临床病理特征之间的关系.结果:胃癌中肝素酶呈阳性表达26例(61.9%);非癌组织中呈弱阳性表达1例(3.8%).RT-PCR和FQ-PCR的检测结果均相同.胃癌TNM分期中Ⅲ、Ⅳ期肝素酶mRNA表达阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ期(P＜0.05);肝素酶表达与浆膜浸润、淋巴结转移或远端转移呈相关性(P＜0.05).结论:肝素酶可能促进胃癌浸润和转移,在胃癌的转移途径中,参与淋巴道转移而非血道转移.肝素酶可作为预测胃癌复发、转移的分子标志物之一.
关键词： 胃癌 肝素酶 逆转录聚合酶链反应 实时荧光定量聚合酶链反应 -
miR-337-3p抑制肝素酶的表达调控胃癌细胞转移的作用和机制
目的 确定miR-337-3p对肝素酶(HPSE)的靶向调控作用,明确miR-337-3p对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 利用生物信息学预测的方法筛选靶向HPSE的microRNAs,通过荧光素酶报告基因系统和western blot的方法确定miR-337-3p对HPSE的靶向调控.通过脂质体转染模拟物的方法在胃癌细胞中过表达miR-337-3p,MTT法确认胃癌细胞增殖能力的变化,Transwell侵袭实验确认胃癌细胞侵袭能力的变化.收集临床胃癌组织及癌旁组织,利用实时定量PCR的方法检测miR-337-3p和HPSE基因的相对表达水平.结果 miR-337-3p在HPSE基因的3'UTR上有1个结合位点,荧光素酶报告基因系统显示过表达miR-337-3p能够显著下调含HPSE基因3'UTR序列的荧光素酶活性以及内源性的HPSE蛋白水平.胃癌细胞中过表达miR-337-3p后,细胞增殖能力显著降低,侵袭能力明显下降.37例胃癌组织中,miR-337-3p在癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织,而HPSE在癌组织中的表达明显高于癌旁组织.胃癌组织中的miR-337-3p与HPSE的水平与胃癌浸润程度、淋巴结转移以及TMN分期均有关(均P＜0.05).结论 miR-337-3p通过调控靶基因HPSE的表达,调控胃癌细胞增殖和侵袭能力.
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肝素酶B细胞表位MAP疫苗对肝癌生长及肺转移影响的实验研究
目的：研究自行合成的肝素酶B细胞表位多抗原肽（MAP）疫苗在活体内对HCC97H原发性肝癌生长及肺转移的抑制作用。方法新鲜合成肝素酶B淋巴细胞表位MAP疫苗并经主动免疫白毛黑眼兔获得特异性免疫血清，经纯化后被动免疫于荷瘤鼠体内，观察肝癌局部生长侵袭情况及肺部微转移灶数目、肝癌组织中VEGF、bFGF、CD34的表达等情况，并进行统计分析。结果通过主动免疫的方法，获得了含高浓度、高纯度且能与肝素酶50kDa大亚基及前体蛋白特异性结合的抗MAP抗体的免疫血清，该特异性抗体可显著抑制HCC97H细胞肝素酶活性、抑制VEGF和bFGF的表达及降低微血管密度；注射抗肝素酶B细胞表位MAP抗体各组的原位肝癌体积及肺转移灶数目都明显小于未经免疫兔IgG对照组（P＜0.01）及希罗达阳性对照组（P＜0.05），且其作用具有一定的浓度依赖性。结论本研究证实了肝素酶B淋巴细胞表位MAP疫苗在活体内具有抗原发性肝癌生长及抑制肺转移的作用，可为原发性肝癌的防治提供新的思路。
