Corning? hybrigro SF?培养基对提高杂交瘤细胞培养密度和抗体产量的研究

近几年，抗体作为生物类治疗药物的需求显著增长。因此，提高抗体生产效率并且降低生产成本愈发必要。而康宁hybrigro SF?培养基的开发，正是致力于在不使用昂贵血清的情况下仍能够高效培养杂交瘤细胞，提高抗体产量。我们使用两种不同的杂交瘤细胞株，并通过与两种商业化生产的无血清培养基以及一种被广泛使用的含血清培养基对比，验证 hybrigro SF?培养基在高密度杂交瘤细胞培养及蛋白产量方面的优越性。

BrdU单克隆抗体的制备及鉴定

DNA的5-溴,2'-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法近年来作为一种新的、简便、敏感特异的检测方法,在肿瘤生物学、遗传学、分子生物学特别是细胞增殖动力学等领域得到广泛应用,在一定程度推动了相关学科的发展.为了满足广泛开展BrdU标记DNA检测对BrdU特异性单抗的需要,我们制备了一株产生BrdU单抗的杂交瘤细胞株.本文对此细胞株制备过程及单抗鉴定情况作了简单叙述.

HAb18Gedomab1单抗的制备及功能研究

目的:制备抗人HAb18G/CD147胞外区蛋白(HAb18Ged)的单抗HAb18Gedomab1,并对其理化性质和生物学功能进行分析鉴定.方法:用HAb18Ged免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术,融合并筛选分泌抗人HAb18Ged蛋白单抗的杂交瘤细胞株,制备腹水,采用离子交换层析法纯化该抗体.采用流式细胞术、免疫组化等方法对其特异性进行鉴定,并通过明胶酶谱、Ⅰ型胶原酶谱、重组基底膜降解实验研究该抗体的体外生物学功能.结果:获得一株稳定分泌抗人HAb18G/CD147胞外区蛋白单抗的杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1,滴度为:1:106,纯化后HAb18Gedomab1单抗的纯度大于90%,抗体亚型属IgG1型.流式细胞术及免疫组化结果证明,该抗体与FHCC-98细胞膜抗原及肝癌组织均呈特异性结合.生物学功能研究表明,HAb1 8Gedomab1可刺激鼠成纤维细胞(3T3)分泌明胶酶MMP-2,MMP-9及胶原酶MMP-1,MMP-8,并具有促进基底膜降解的作用.结论:HAb18Gedomab1单抗可特异识别HAb18Ged,刺激MMPs分泌,促进基底膜降解.

甲基对硫磷单克隆抗体的研制及鉴定

目的研制甲基对硫磷(M1605)单克隆抗体(McAb).方法人工抗原M1605-TTH免疫BALB/C小鼠,用被免疫的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在融合剂PEG4000作用下融合.经过HAT培养液选择性培养、间接ELISA法筛选和有限稀释克隆后,鉴定该杂交瘤细胞株和McAb.结果获得2株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株G12、H02,其培养液和腹水滴度为1:103和1:105.进一步研究G12发现,该杂交瘤细胞株的染色体数为99～108,其McAb分类为IgM,该McAb的亲和力常数为1.67×105L/mol,且具有较好的特异性.结论获得抗M1605的特异性McAb,为建立M1605简便、快速、特异的生物检测方法提供了必要条件.

甲型肝炎病毒克隆抗体细胞株的建立及应用

随着分子生物技术的研究不断深入,单克隆抗体在免疫学、医学、生物学的应用越来越广泛.为了能够对甲型肝炎病毒(HAV)感染的早期诊断及治疗提供快速诊断试剂,我们建立了HAV单克隆抗体杂交瘤细胞株.现将实验结果报告如下.

抗猪IgM单克隆抗体的研制

随着规模化养猪业的发展,我国已相继出现多种新的猪传染病,包括猪繁殖与呼吸综合征、副猪嗜血杆菌和猪圆环病毒Ⅱ型感染等[1-3],并已引起严重的经济损失.研制抗猪IgM单抗来检测这些疫病特异性IgM型抗体,将为该疾病早期诊断提供新且简便的途径.近年来研究发现抗原特异性B细胞有高效抗原递呈作用[4],其膜表面抗原受体对抗原的摄取、浓缩和处理起着重要作用.用抗猪IgM μ链McAbs和抗体-抗原的McAbs组成的双特异性抗体,既能与抗原特异性结合,又能与B细胞膜表面抗原结合,从而能进一步在体内外从分子水平上研究B细胞抗原递呈特点,并且为显著降低疫苗接种剂量,提高机体免疫能力的探索提供新的实验手段.鉴此,本实验室用PEG融合技术,研制出分泌抗猪IgMμ链McAbs杂交瘤细胞株.

β2糖蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)单克隆抗体(MAbs),并鉴定抗体的特性.方法:以纯化的人血浆β2GP Ⅰ免疫BALB/c小鼠,采用PEG融合技术,间接ELISA法和有限稀释法,制备和筛选杂交瘤细胞.杂交瘤细胞继续扩大培养后注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水,经硫酸铵沉淀及Protein G纯化MAbs.秋水仙素阻抑法鉴定杂交瘤细胞株染色体数目,ELISA测定滴度,Ig亚类试剂盒鉴定Ig亚类,Western blot鉴定特异性.结果:获得1株稳定分泌MAbs的杂交瘤细胞株β2,该杂交瘤细胞株的染色体数为99 ～108.进一步研究发现,其培养液和腹水滴度为1∶29和1∶215,其MAbs分类为IgG1/κ,Western blot 显示纯化的MAbs及标准anti-β2GP Ⅰ与β2GP Ⅰ均有反应条带,具有较好的特异性.结论:成功获得并纯化β2GP Ⅰ单克隆抗体,为进一步研究β2GP Ⅰ/anti-β2GP Ⅰ复合物在抗磷脂综合征中的作用奠定了基础.

鸡胸腺细胞特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

人和小鼠淋巴细胞表面抗原的各种单克隆抗体(Monoclonal antibodies,McAbs)试剂商品化应用,为细胞免疫学研究与疾病诊断提供了有力工具,而对禽类细胞免疫学研究相对落后于人和哺乳动物的研究,原因之一是缺乏淋巴细胞表面抗原的各种McAbs试剂.为此,我们研制并建立了抗鸡胸腺细胞McAbs杂交瘤细胞株,为我国禽类免疫和免疫病理研究提供了重要手段.

ACTH单克隆抗体的制备和鉴定

ACTH是垂体分泌的重要激素之一，测定血浆ACTH对下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的评 价 具有重要意义。制备ACTH单克隆抗体，以期建立ACTH-IRMA方法。 ACTH或其片段与BSA经碳化二亚 胺偶联剂联接后制备免疫原，初次免疫为完全福氏佐剂乳化后在背部皮下多点注射，ACTH剂 量约40 μg，以后每隔4 w以不完全福氏佐剂乳化后在背部或腹腔交替注射4～6次，剂量减 半 。融合前3 d每天以无佐剂的ACTH联接物行腹腔注射，总剂量为60 μg。按常规方法进行细 胞融合，每周换液2至3次。阳性克隆的筛选：培养上清液抗体检测按常规RIA进行，计算结 合率，以结合率大于3倍的非特异结合率为阳性。阳性孔经有限稀释法亚克隆3～4次后获得 2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,5G2为ACTH1-28片段所得,D3为ACTH1-13片 段所得。扩增 细胞，一部分冻存，另一部分种于已致敏的BALB/c小鼠腹腔产生含抗体的腹水。收集的腹水 稀释后，以RIA法测定各稀释点抗体的结合率,计算5G2和D3腹水抗体在50%结合率时的终稀 释度分别可达1:5 000和1:2 000。以 1%琼脂双扩（梅花孔）法作抗体亚类鉴定，5G2和D3抗 体 均为IgG1类型,轻链为λ链。根据标准曲线参数，通过公式6y0/(1- y0)(2- y0)(4- y0)( 3ED50-ED25) 计算5G2和D3抗体的亲和常数分别为5.1×109和4.9 ×107 M-1。以ACT H不同片段作 交叉反应试验，进行特异性鉴定。5G2和D3抗体与ACTH1-10、ACTH1-17、 ACTH1-24的交叉反 应率分别为0.04%、8.70%、100.00%和0、35.30%、69.30%。据此推断5G2抗体识别ACTH 氨基酸序列 的17～28片段,D3抗体识别ACTH氨基酸序列的10～13片段。 以羊抗鼠IgG-Sephadex G75偶 联 物层析柱,进行腹水抗体的亲和纯化。按本室的方法将纯化的5G2和D3抗体分别包被马来酸酐 -苯乙烯共聚物塑料管,制备固化抗体管,以125I-ACTH做固相放免, 通过大结合率 确定5G2和D3抗体的饱和结合量分别为5 μg和20 μg，为建立固相IRMA奠定了基础。　　ACTH是 垂体分泌的39肽分子，由于ACTH分子量小，在体内半衰期短；ACTH氨基酸序列只在第26至 33之间有3个氨基酸残基有种属差异，小鼠的免疫细胞不易识别，终导致小鼠不易产生抗 体。在本实验中只有18.3%的小鼠血清抗体阳性，而且抗体滴度不高。我们经过反复筛选获 得的2株抗体分别识别ACTH氨基酸序列的第17～28片段和第10～13片段，其亲和常数分别达 109和107 M-1, 用于液相放射免疫分析不足以达到理想的灵敏度，据文 献报道使用2个单 克隆抗体，建立IRMA方法，则灵敏度可显著提高。由于这2株单抗识别的位点不同,有望建 立ACTH-IRMA方法。

一株新的鼠抗人2IgB7-H3功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

研制功能性鼠抗人2IgB7-H3单克隆抗体.以人2IgB7-H3基因转染细胞L929/2IgB7-H3为免疫原,常规免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;利用B淋巴杂交瘤技术,将免疫小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞株SP2/0融合,L929/2IgB7-H3细胞为抗原筛选阳性细胞;经间接免疫荧光标记法对杂交瘤细胞进行反复筛选和多次克隆化培养;采用快速定性试纸法鉴定单抗Ig亚类;利用竞争抑制性实验分析该单抗识别的抗原表位;采用MTT法分析该单抗在体外阻断DC对T细胞的促增殖效应.结果:获得了1株持续稳定分泌鼠抗人2IgB7-H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7D7),该单抗可特异识别L929/2IgB7-H3分子和介导有效的共刺激信号.该单抗的成功获得和其生物学特性的初步鉴定,为进一步研究B7-H3两个异构体在DC细胞及肿瘤细胞上的作用机制奠定了物质基础.

抗小鼠凝血因子IX的大鼠--小鼠杂交瘤细胞株的建立

抗日本血吸虫重组蛋白20.8 kDa抗原单克隆抗体的建株

以日本血吸虫重组蛋白20.8 kDa抗原免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体.每鼠注入蛋白100 μg,共免疫3次,第1次加福氏完全佐剂,第2、3次加福氏不完全佐剂,间隔3wk.融合前,于免疫的BALB/c小鼠尾静脉注射50 μg血吸虫重组蛋白20.8 kDa抗原,4 d后取脾脏与骨髓瘤细胞SP2/O融合,11d后检测,融合率为13.54%(26/192).ELISA检测培养上清,筛选阳性孔,经3次克隆,获得6株阳性杂交瘤细胞株.将这6株细胞上清浓缩10倍,用琼脂双扩散法测得免疫球蛋白亚类为IgG14株,IgM 2株.将6株细胞扩增后注入BALB/c小鼠腹腔,诱生腹水.

抗嗜肺性军团病杆菌Ⅰ型单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

嗜肺性军团病杆菌(LDB)是引起军团病的病原菌.该菌的第Ⅰ血清型曾于1976年在美国费城引起一次肺炎的暴发流行,死亡率高达15.4%.1978年用人工培养基分离培养LDB成功后,很多国家相继发现本菌感染的患者.我院在报告国内首例军团病患者后[1],又在全面建立军团病实验诊断技术的基础上,于1983年3月分离出国内第一株军团病杆菌[2],并对人群中抗体水平进行了调查[3,4].

人促甲状腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备特异性强、灵敏度高的人促甲状腺激素(hTSH)单克隆抗体,为建立高灵敏性和高特异性的hTSH检测方法奠定基础.方法:人工合成人促甲状腺激素(hTSH)上的28个氨基酸,采用戊二醛交联法与牛血清白蛋白(BSA)构建完全抗原.用人工免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术建立分泌抗hTSH单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对得到的单抗进行鉴定.结果:建立了一株杂交瘤细胞4E5,制备了腹水单抗,经鉴定,抗体重链属于IgG1类型,轻链属于κ型,McAb腹水ELISA效价达1:1.6×105,与促黄体生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)无明显交叉反应,细胞株冻存复苏后抗体分泌稳定.结论:本实验建立的细胞株显示稳定性好,特异性高,McAb腹水效价高,为进一步提高hTSH检测的灵敏性和简便性提供依据.

少突胶质前体细胞分离培养方法的改进及其谱系限定细胞体外分化模型的建立

目的 对少突胶质前体细胞(OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,并建立少突胶质谱系限制细胞的体外分化模型,以模拟体内OPCs的发育过程.方法 通过非特异性差异黏附法与A2B5-IgM抗体免疫筛选法结合,从胚胎大鼠脊髓来源的细胞悬液中分离、纯化OPCs,用含成纤维细胞生长因子-2和血小板源性生长因子的培养液作扩增培养；再以三碘甲状腺氨酸和神经营养因子-3诱导OPCs分化,终分化为成熟的少突胶质细胞(OLs).OPCs及其分化细胞的特性通过形态学观察和免疫化学染色法鉴定.结果 95％以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态,并表达A2B5；在一定的培养条件下,OPCs可持续扩增和反复传代,且扩增的OPCs仍能维持其特有的形态和自我增殖的特性；进入分化进程的细胞将依次表达04、Ol、受体反应蛋白及髓鞘碱性蛋白等特异性分化抗原.结论 分离的OPCs在形态、增殖以及分化格局等方面均与存在于胚胎脑区的02A的体细胞(体内OPCs)相类似.

A群脑膜炎奈瑟球菌多糖单克隆抗体的制备及其应用

目的:筛选能分泌A群脑膜炎奈瑟球菌多糖抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,运用该单抗建立检测ACYW135群脑膜炎奈瑟球菌多糖疫苗中A群多糖的竞争ELISA方法.方法:运用经典的杂交瘤技术筛选杂交瘤细胞株,采用小鼠腹腔注射收获腹水型单克隆抗体,优化条件建立间接竞争ELISA,分别测定5支同一批和3个不同批次的ACYW135群脑膜炎奈瑟球菌多糖疫苗成品中的A群多糖含量,检测结果应用SPSS软件做单样本t检验分析.结果:标准曲线经Log-logit处理,得到回归方程:y=-1.664 8-2.254 2x,R2=0.989 5,线性范围0.022 8～1.200 7μg/mL,IC50为0.165 8μg/mL,低检测限为0.022 8 μg/mL,检测疫苗中A群多糖含量,检测值与疫苗标示量无统计学差异(P＞0.05).结论:成功筛选杂交瘤细胞株,制备A群多糖特异性单克隆抗体,建立的间接竞争ELISA方法,灵敏度高、稳定性好、可重复性强,可用于脑膜炎奈瑟球菌多糖疫苗研发过程中的定量检测,能克服磷含量法和火箭免疫电泳法检测A群多糖含量的缺点.

抗猪囊尾蚴KD26抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株建立和特性鉴定

目的:建立针对猪囊尾蚴KD26抗原的单克隆杂交瘤细胞株,生产相应的单克隆抗体,用于囊虫病免疫保护机制的基础研究和囊虫病临床免疫诊断的应用.方法:用SDS-PAGE电泳,分离纯化制备猪囊尾蚴KD26抗原免疫6周龄BALB/C小鼠3次,无菌取出脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/O(比率10∶1),在50%PEG(4 000 MW)作用下进行细胞融合,随后在HAT培养液中进行选择性培养、筛选和克隆;常规的中期染色体法分析染色体,单克隆抗体鉴定采用免疫双扩散法测定其免疫球蛋白亚类,采用ELISA法测定单抗效价并作特异性鉴定.结果:用常规的有限稀释法对杂交瘤细胞进行了3次筛选和克隆化后,获得了1株杂交瘤XH,染色体数为96,能稳定分泌抗猪囊尾蚴KD26单抗,单抗类型为IgG1,抗体滴度为1∶1 000,其与血吸虫、弓形虫、细粒棘球绦虫抗原均不发生交叉反应.结论:应用杂交瘤技术获得了1株能稳定分泌高滴度抗猪囊尾蚴KD26抗原的单克隆抗体细胞株.

抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究

目的建立分泌抗华支睾吸虫代谢抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株.方法用华支睾吸虫成虫代谢抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株,测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价,检测单抗与日本血吸虫全虫可溶性抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应.结果获得3株分泌高滴度抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应,3株单抗均属IgG.结论制备的抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗,为制备免疫诊断试剂盒奠定了基础.

不同免疫接种方法在单克隆抗体制备中的应用及比较

在制备抗泡球蚴原头节可溶性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞时，我们采用常规的小鼠腹腔免疫接种－脾淋巴细胞法(以下称腹腔免疫法)和后肢跖部局部免疫接种－胴淋巴结淋巴细胞法(以下称后肢跖部法)，进行了4次杂交瘤细胞融合。经ELISA筛选和有限稀释克隆，后获得了16株可以稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。现将这两种免疫接种方法的结果及所获得的单克隆抗体的特性分析报告如下。1 材料和方法1.1 泡球蚴可溶性抗原手术摘取在沙鼠腹腔人工接种培养1年以上的泡球蚴包囊，在事先盛有生理盐水的培养皿中，粗铁纱网破碎过滤，沉淀用生理盐水悬浮清洗3遍后，在解剖镜下，仔细将位于中央的原头节收集，注意不要混入位于周围的大量石灰小体。取1.5×106个原头节，用pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)漂洗2遍后，再冻融2次。将原头节混悬液与等容的50mM n-heptyl-β-D-thioglucoside(含0.5mM PMSF)混合，超声粉碎后，10000g×4℃离心1h。上清即为泡球蚴可溶性抗原。以Bradford法测定蛋白浓度后，用PBS调整为10mg／ml，分装冻存。1.2 单克隆抗体的制备1.2.1 腹腔免疫接种－脾淋巴细胞法 50μg以1ml PBS稀释的泡球蚴原头节可溶性抗原，与等容福氏完全佐剂充分乳化后，腹腔注射BALB／c小鼠。14天后，换用福氏不全佐剂同法加强免疫。2周后，再次以1mlPBS稀释的100μg抗原腹腔注射强化免疫。3天后，检测血清抗体滴度，手术摘取ELISA结果OD值超过1.0小鼠的脾脏，采取脾淋巴细胞后，与P3X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合[1]。

抗鹦鹉热衣原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用

鹦鹉热衣原体(Chlamydia Psittaci,Cps)是感染人和多种畜禽的病原体,自70年代以来,我国青海、广西、湖南、四川、陕西等省区先后对衣原体病在山羊、猪、鸡、鸽、牦牛等动物中的流行及诊断研究作了报道.随着单克隆抗体(McAb)检测技术的发展,如能将其引入该病的检测,必将大大提高该病检测技术的特异性、敏感性和简便性.为此,我们进行了本项研究、制备了具有抗牛源鹦鹉热衣原体特异性的单克隆抗体并进行了初步应用研究,现报告如下.