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重组小鼠γ-干扰素对弓形虫感染孕鼠及鼠胚的影响
目的 研究重组小鼠γ-干扰素(rmu-IFN-γ)对妊娠期感染弓形虫的孕鼠蜕膜T淋巴细胞亚群及鼠胚感染率的影响.方法 将60只孕鼠被随机分为4组:空白组、感染组、rmu-IFN-γ小剂量治疗组(A组)和大剂量治疗组(B组).采用弓形虫急性感染妊娠第6～10 d孕鼠,不同剂量rmu-IFN-γ腹腔给药,感染后72 h取孕鼠蜕膜组织,流式细胞术检测各组T淋巴细胞亚群的水平;每组随机取5只孕鼠统计各组鼠胚的数目,SABC免疫组化法检查鼠胚中的弓形虫抗原阳性率.结果 孕鼠感染弓形虫后蜕膜CD4+、CD4+/CD8+降低(P＜0.05),A组和B组两种剂量的rmu-IFN-γ干预后均能提高CD4+、CD4+/CD8+水平(P＜0.05);A组和B组中鼠胚的垂直传播率均低于感染组.结论 孕鼠感染弓形虫后蜕膜局部细胞免疫受到抑制,注射适量的rmu-IFN-γ可以逆转CD4+/CD8+比值,提高机体的细胞免疫水平,降低鼠胚的垂直传播率,对孕鼠及鼠胚具有一定的保护作用.
关键词： 弓形虫 重组小鼠γ- 干扰素 孕鼠 鼠胚 T淋巴细胞亚群 -
中药金叶败毒防治巨细胞病毒宫内感染的动物实验初探
人巨细胞病毒(HCMV)宫内感染是导致出生缺陷的重要原因之一[1],但目前缺乏安全有效的治疗药物.本研究应用豚鼠巨细胞病毒(guinea pig cytomegalovirus,GPCMV)宫内感染模型,研究中药金叶败毒防治GPCMV宫内感染的效果.报道如下.1.细胞和病毒:豚鼠胚肺细胞株和GPCMV标准株(ATCC 22122),均经湖北省预防医学科学院病毒研究所培养传代,病毒滴度106～107 TCID50/0.1 ml.
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小鼠胚胎肝干细胞的分离和鉴定
肝干细胞在成体肝脏中分离难度较大,目前认为采用胎肝分离纯化是一较好途径,我们在Suzuki等[1]利用荧光活化细胞分类法获取肝干细胞的方法基础上予以适当改进,建立以下方法.
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子宫内膜异位症子宫内膜细胞对鼠胚体外早期发育的影响
子宫内膜异位症(EMs,内异症)与妇女不育有着密切的关系,约有25%～4O%的不孕妇女患内异症,而内异症患者中,不育症约占3O%～40%.为探讨子宫内膜异位症患者的子宫内膜是否对胚胎的发育产生不利的影响,本实验将两细胞期鼠胚与内异症妇女子宫内膜细胞体外共培养,观察其对鼠胚早期发育的影响.
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人类胚胎超快速冷冻保存的初步研究
1987年,Trouson等[1]先用鼠胚建立了胚胎的超快速冷冻方法,并认为可获得与常规的慢速冷冻方法相似的冻存效果,同时具有耗时短、易操作和花费低等优点.到1990年才有人类胚胎利用相同冷冻技术保存获得妊娠的报道[2].我室于1996年开始在部分因不孕症行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)者中,开展人类胚胎超快速冷冻的研究,现将结果报道如下.
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鼠胚脑皮质及海马神经元原代培养方法的改进
神经细胞原代培养是研究神经细胞的重要手段之一[1,2].传统方法是将神经细胞与神经胶质细胞混合培养,因此无法满足在单一神经细胞培养基础上进行研究的需要.1998年10月至1999年9月,我们对传统混合培养方法在取材、消化、温度、机械操作等方面进行控制和改进,得到了比较满意的相对单一的神经细胞培养物和单神经细胞网络,为进一步开展神经生物学研究提供了相对稳定的体外模型.
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人嗜T淋巴细胞病毒-1感染细胞瘤变的病毒表达抑制机制
一、Tax在细胞瘤变中的作用人嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLV-1)所编码的转录激活因子Tax于体外试验上可使人T细胞长生化,诱导3T3、Rat-1细胞株及大鼠胚纤维母细胞发生转化,并使Tax转基因小鼠发生肿瘤,因而认为它是成人T细胞性白血病(ATL)的主要病原因子.Tax所致转录制约乃Tax与细胞转录制约因子直接相互作用的结果,此类细胞因子迄今已报告有10种以上,故其病变机制自然难以用一元化进行说明.
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整合素在胚胎发育中的表达及其作用
从精、卵结合,受精卵分裂、分化、增殖、迁移,胚层分化、组织、器官的形成,直至胎儿的发育、成熟这一过程中,细胞粘附分子起着重要作用.人胚的桑椹胚期、牛胚8细胞期、鼠胚在脱透明带前即有整合素的表达,使得胚胎能够通过整合素α5β1、αvβ3与配体纤黏连蛋白(FN)、整合素α6β1、αvβ3与配体层粘连蛋白(LN)及整合素αvβ3与配体玻粘连蛋白(VN)等粘附.此外,胚泡的形成、胚层的分化、组织及器官的发育等也离不开相应的整合素分子的参与作用[1].
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甲状旁腺相关蛋白在鼠胚髁突外植体软骨内成骨中的作用
目的 探讨甲状旁腺相关蛋白(PTHrP)对体外培养的鼠胚髁突软骨内成骨的影响.方法 体外解剖分离鼠胚髁突,行外植体培养,通过组织学、免疫组化等方法观察PTHrP对体外培养的髁突外植体软骨内成骨的影响.结果 髁突外植体在无血清半固态培养系统中能正常发育.加入人PTHrP(1-34)后,实验组髁突长度的增加较对照组明显,两组间差异有显著性(P＜0.05);组织学及免疫组化染色显示:加入人PTHrP(1-34)后培养的髁突外植体增殖层和肥大软骨细胞层明显增厚,同时Ⅱ及Ⅹ型胶原在增殖层和肥大软骨细胞层中表达增强.结论 PTHrP可刺激髁突外植体软骨增殖层和肥大层软骨细胞的增殖,促进髁突软骨内成骨的形成.
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银杏内酯B促进体外培养胚胎大鼠脊髓神经细胞生长发育的研究
目的 探讨GB对体外培养的胚鼠脊髓神经元存活和生长发育的作用.方法 胚胎大鼠脊髓神经细胞原代培养,相差显微镜下进行细胞计数和显微测量,观察GB对神经元存活和生长发育的作用.对培养7 d细胞行NSE免疫组化染色,光镜下观察GB对NSE染色阳性神经元生长发育的影响.结果 GB及NGF能够促进体外培养胚胎大鼠脊髓神经细胞及NSE染色阳性神经元的存活,促进其细胞及突起的生长.其促进脊髓神经细胞的存活、胞体及突起发育的作用与NGF一致,而其促进神经突起分化与生长的作用强于NGF.结论 NGF和GB能促进培养大鼠发育期脊髓神经元存活、分化和生长,并且表现出各自作用的特异性.
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NGF和aFGF对体外培养的胚胎大鼠脊髓神经元生长发育的影响
目的:探讨促进移植脊髓神经元存活生长的因素,观察比较NGF和aFGF对体外培养的胚鼠脊髓神经元生长发育的作用.方法:利用神经细胞培养的方法,在相差显微镜下观察细胞生长发育情况.实验数据用±s表示,2×2析因方差分析及SNK检验.结果:NGF能增加培养早期脊髓神经元的数量;aFGF加强神经元突起的发出和生长;两者对神经元胞体的早期发育均有促进作用.NGF和aFGF联合应用时神经元存活、分化及生长发育等明显优于单独使用NGF或aFGF.结论:NGF和aFGF对培养早期胚鼠脊髓神经元的作用具有选择性和协同性,两种神经营养因子联合应用更加有益.
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含有中肾旁管的小鼠胚胎组织石蜡切片制备
目的 基于雌性小鼠胚胎连续石蜡切片进行中肾旁管定位,探讨制备高质量的含中肾旁管的小鼠胚胎组织切片的方法.方法 正常孕15.5 d、17.5 d、19.5 d小鼠的胚胎,聚合酶链式反应(PCR)鉴定性别,取雌性鼠胚石蜡包埋,连续横断切片,每4张取1张行HE染色后获取连续切片图像.根据雌性小鼠胚胎生殖管道解剖走形,识别并定位中肾旁管.结果 获取含不同发育天数中肾旁管的小鼠胚胎切片.结论 利用石蜡包埋连续切片对中肾旁管进行解剖定位,是有效获得含中肾旁管的小鼠胚胎石蜡切片的方法.
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c-Fos和巢蛋白在鼠胚肺内的表达及缺氧对其影响
目的 探讨胚胎大鼠肺组织内c-Fos和巢蛋白的表达及宫内缺氧对其表达的影响.方法 将孕15d孕鼠采用低张性缺氧模型致鼠胚宫内缺氧,鼠胚肺组织经c-Fos和巢蛋白免疫组化双标染色后,进行观察分析.结果 对照组肺组织c-Fos有弱表达,肺内支气管上皮有较强的巢蛋白表达;缺氧组肺组织c-Fos表达增强(P＜0.05),肺内支气管上皮巢蛋白表达明显增强(P＜0.05),且肺内支气管上皮以外肺组织也有巢蛋白表达.结论 正常鼠胚肺组织内有c-Fos和巢蛋白表达,且巢蛋白的表达只在肺内支气管.缺氧可刺激鼠胚肺组织内c-Fos和巢蛋白的表达.
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小鼠早期胚胎质量与细胞凋亡的相关性
目的 分析小鼠早期胚胎质量与细胞凋亡的关系,了解细胞凋亡调控基因在早期胚胎发育中所起的重要作用,旨在为提高胚胎质量寻找一条新途径.方法 采用脱氧核糖核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)原位荧光检测和Bcl-2免疫荧光检测等凋亡检测技术,以及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光检测细胞增殖程度的技术,分别对小鼠早期形态正常的胚胎、早期发育阻滞的胚胎和有碎片的胚胎进行细胞凋亡程度和增殖程度的检测,比较其凋亡和增殖程度的差异.结果 小鼠早期发育阻滞的胚胎细胞和胚胎中的碎片TUNEL阳性,Caspase活性增强,Bcl-2、PCNA表达水平降低.结论 细胞凋亡与胚胎发育阻滞及胚胎中的碎片形成密切相关.
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宫内缺氧对胎鼠大脑皮质神经元c-Fos和NOS表达的影响
目的探讨宫内缺氧对胚胎大鼠大脑皮质神经元内c-Fos和一氧化氮合酶(nitric oxide syntbase,NOS)表达的影响.方法将8只孕期15天的孕鼠随机分为对照组和缺氧组各4只,缺氧组孕鼠采用低张性缺氧模型致鼠胚宫内缺氧1小时,两组鼠胚大脑组织经c-Fos和NOS免疫组化双标染色后,进行观察分析.结果缺氧组大脑皮质c-Fos阳性细胞、NOS阳性细胞和c-Fos/NOS双染阳性细胞均比对照组明显增多(P＜0.05).结论缺氧可刺激鼠胚大脑神经元内c-Fos和NOS的表达.
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植入后小鼠全胚胎培养技术的建立
哺乳动物胚胎在子宫内生长的不可接近性,使胚胎发育处于"暗箱"状态.而全胚胎培养技术的发展使得在体外维持小鼠或大鼠胚胎发育成为可能.通过全胚胎培养技术,鼠胚在体外可存活相当一段时间,在这段时间可完成原肠胚形成(gastrulation)和早期的器官发育.全胚胎培养技术可允许直接连续地观察胚胎发生的详细过程.全胚胎培养技术的建立, 为发育神经生物学提供了有力的研究手段.但由于技术条件的限制,目前这项技术在国内的开展还面临许多困难.为了用全胚胎培养的神经管缺陷小鼠研究转染原癌基因bcl-2对神经管缺陷的缓解作用,我们自行设计和制作了WHC-2000(Whole Embr yo Culture Box 2000)型胚胎旋转培养箱,改良设计了培养系统,将全血清培养改良为DMEM:鼠血清(1:1)培养基,应用全胚胎培养技术获得良好效果 .正常小鼠的胚胎发育要经历19-20天.在1-2dPC形成2到4个细胞的胚胎.在3. 0-3.5dPC发育成桑椹胚或胚泡.在6.0-6.5dPC成为圆柱状.中胚层于7 .0-7.5dPC形成.在8,0dPC,外胚层增厚形成神经板,继之,在8.0-8 .5dPC,神经褶在颈部水平融合形成神经管.在8.0-8.5dPC神经嵴在中脑水平迁出,分布到全身各部位,演变为黑色素细胞、外周感觉和自主神经系统的组成成分等. 心脏的原基在紧靠神经管前端的腹侧中胚层形成,并在8.5dPC末开始有节律地收缩. 9.0dPC卵黄囊血岛逐渐出现,在9.5dPC前,肢芽开始出现,眼、耳、嗅觉的原基形成,可见2-3对鳃弓、心脏已能搏动.在10.5dPC,胚胎进一步发育,肢芽增长,脑泡增大,颅侧和背根神经节形成,运动神经元开始分化.总之,在8.0-10.5 dPC主要的器官原基已经分化.应用体外全胚胎培养技术,此阶段的胚胎在培养基中易于成功的培养.胚胎培养的方法能有效地控制胚胎发育的环境,提供给胚胎细胞在正常环境中实验研究的机会.目前全胚胎培养技术已被成功地应用于肢芽再生研究,药物与自然产物的致畸作用研究 ,神经嵴细胞迁移的研究,以及利用基因转染来研究器官发生阶段的基因相互作用等.但目前由于此项技术开展不普遍,实验所需的旋转培养箱在国内还没有厂家进行批量生产,在国外购买经费昂贵,因此我们根据实验需要自行设计和制作了用于本实验的WEC-2000 型胚胎旋转培养箱,该培养箱带有37℃的恒温系统,每分钟20-40转的齿轮旋转系统 ,能连续工作200小时,性能指标完全能满足胚胎培养的要求.另外我们用EMDM-鼠血清培养基代替纯大鼠血清,也达到实验要求并节约了经费和劳动力.我们将鼠胚在体外培养 24小时后,其发育状态与母体子宫内生长的胚胎完全同步.形态学特征符合实验要求.实验结果表明,我们的培养系统和培养技术是成功的,可以开展下一步的工作.
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小鼠神经管发生中PCD与原癌基因bcl-2表达的相关性
神经胚形成neur ulation)中关键的形态学变化是神经管的形成,在此过程中,正常PCD是不可缺少的因素之一.在神经管关闭过程中发生率很高的各种神经管关闭缺陷(neural tube closure defect,NTCD),大多数亦与凋亡异常有关.已知神经管发生是一个多因素参与的高度复杂的胚胎学事件,其中原癌基因bcl-2可能参与其中的关键环节.但关于bcl-2在正常神经管发生和神经管缺陷的作用及调控机制仍不清楚.本实验用全胚胎原位杂交技术和TUNEL染色对小鼠神经管发生中bcl-2 m RNA的表达与细胞凋亡的关系进行研究,原位杂交对照实验用sense-bcl-2 cRNA探针代替anti-sense bcl-2 cRNA进行对照实验,结果显示 ,1)9.0dPC神经上皮细胞的凋亡率高,提示9.0dPC神经管的高细胞凋亡率有利于神经管的关闭.从空间分布看,神经管头端的凋亡细胞多于中段和尾段,提示颅侧的细胞凋亡率与脑泡的塑形有关.2)用全胚胎原位杂交研究了小鼠神经管形成过程中原癌基因b cl-2表达及与PCD的关系,7.5dPC鼠胚的bcl-2 mRNA杂交信号弥散于整个胚体,以原条区域较强,提示bcl-2有利于原条细胞向中胚层细胞的分化,8. 5dPC鼠胚bcl-2 mRNA升高,有助于神经上皮顺利进入有丝分裂.以后bcl -2 mRNA表达下降并伴有细胞凋亡率的升高,提示有利于神经上皮进入正常的细胞死亡而利于神经管的关闭.
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转染重组bcl-2基因缓解RA介导NTCD的电镜观察
神经胚形成(neurulation)中关键的形态学变化是神经管的形成,在此过程中, 正常PCD是不可缺少的因素之一.在神经管关闭过程中发生率很高的各种神经管关闭缺陷 (neural tube closure defect,NTCD),大多数亦与凋亡异常有关.研究发现PCD广泛存在于发育中的神经系统,其意义在于对神经系统进行雕塑 ,终使人神经系统的发育达到结构的高度精细和功能的尽善尽美.但目前关于早期神经管发育中的PCD及与原癌基因bcl-2的关系研究极少.为此本实验用电镜技术结合全胚胎培养技术和重组基因转染技术研究转染bcl-2基因能否减轻PA介导NTCD中的细胞凋亡,旨在揭示bcl-2在神经管缺陷中的作用及可能的机制.结果显示正常神经管上皮细胞呈未分化状态,核浆比例大,胞质内细胞器少,主要为核糖体.在RA介导的神经管缺陷组,电镜下神经上皮细胞呈现典型的凋亡特征,早期为染色质的边聚,以后核膜发生凹陷和皱缩,进一步是核在胞浆内的断裂,后形成凋亡小体.在凋亡的全部过程中,细胞膜一直保持完整.我们还观察到,在凋亡的早期有大量空泡(vacuoles)出现在胞浆 ,高倍电镜下这些空泡是由于线粒体内膜嵴的断裂而导致线粒体的气球样变(balloo ned)而形成.经转染正义bcl-2基因后,虽然也偶见凋亡早期的细胞,但多数基本呈现正常的结构,与正常全胚胎培养的鼠胚神经管上皮细胞形态接近.我们将全胚胎培养的正常鼠胚转染反义bcl-2基因后,神经管上皮又呈现出细胞凋亡特征,如核的断裂、线粒体嵴的崩解和空泡形成.过去认为线粒体在凋亡中基本没有变化,故人们即使观察到凋亡细胞内的大量空泡,也不知道这种空泡的来源和意义.这一现象由Sasaki等于199 7年首次描述,认为线粒体的空泡形成是细胞凋亡级联反应的一个组成部分,我们观察到线粒体的破坏和凋亡现象共存在于RA介导的细胞凋亡.转染bcl-2基因后,能缓解部分细胞的凋亡,随之线粒体的损伤也缓解.故我们认为转染外源性bcl-2基因能通过维持线粒体膜的稳定来抑制凋亡.
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鼠胚脊髓运动神经元原代培养方法的改进
神经细胞原代培养是研究神经细胞形态及功能的重要手段之一.传统方法是将神经细胞与神经胶质细胞混合培养,无法满足在单一神经细胞培养基础上进行实验研究的需要.本实验在传统培养方法的基础上加以改良,对原混合培养方法在胎龄、取材、温度、消化、换液、抑制剂、机械操作等方面进行了控制和改进.本培养方法具体改进如下: 1.运动神经细胞取自E14大鼠胚胎的脊髓.因为胚胎运动神经元形态分化和化学分化程度较低,体外存活能力强,E14胎鼠脊髓易剥离.而传统方法是取E12～E16.E1 2胎鼠组织太嫩,不易分离;E16胎鼠脊柱已部分骨化,血液太多,挑离脊髓时易形成撕裂损伤.2.取材时将脊髓沿冠状面切开,取脊髓腹侧半,改变传统的整个脊髓培养,以达到培养单一运动神经元的目的.3.整个取材过程在冰袋上进行,更好的保持细胞活力.4. 严格控制胰酶的浓度和消化时间.胰酶浓度是0.125%,37℃二氧化碳孵育箱内消化 0.5hr较好,采用4℃含血清的DMEM液适时终止反应.为避免组织丢失,改吸弃胰酶为吸组织于另一试管中,且迅速终止消化反应.5.减少传统方法中的吹打次数,用弯头吸管代替直头吸管吹打;取消离心或细胞筛过目等步骤,降低细胞损害程度.6.细胞种植后改传统换全液为换半液,改传统培养2d换液为定时观察,按需换液.这样不仅保证了细胞在已适应了的环境中生长,并且减少了污染的机率.7.本方法不使用抑制剂,减少药物对运动神经元的损伤,使神经细胞在更接近于体内自然环境中生长.种植细胞1～2hr即可观察到细胞贴壁,胞体呈圆形,饱满、透亮,有短的突起出现.因此,本方法的优点是: 不仅能够大大缩短从取材到种植的时间,提高运动神经元的活性,而且成功的获得了相对单一的运动神经元培养物(纯度达90%以上),为进一步开展神经生物学研究提供了相对稳定的体外模型.
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乙二醇在人类胚胎慢速冷冻中的应用研究
由于乙二醇(EG)比丙三醇(PROH)分子量小,为了阐述二者在人类胚胎慢速冷冻中的不同效果,本研究分别采用EG和PROH作为冷冻保护剂,通过观察鼠胚冷冻复苏后的发育情况以及人冻胚移植后的妊娠结局,对EG的渗透性及毒性作一评价.
