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凋亡素基因治疗系统对人肝癌细胞的影响
原发性肝癌的治疗是临床工作中的难题之一,近年来的研究表明,基因治疗可能是恶性肿瘤治疗的一条新途径.凋亡素基因是鸡贫血病毒基因组中一个编码基因序列[1],由其编码的蛋白为凋亡素(VP3)[2],通过合适的载体将凋亡素基因导入靶细胞,其编码的凋亡素能特异地诱导肿瘤细胞凋亡.本研究旨在构建凋亡素基因治疗系统,并观察其对人肝癌细胞HepG2的影响.
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双基因(VP3、IL-18)联合致小鼠骨肉瘤S-180细胞凋亡的效应
目的 探讨VP3、IL-18双基因抑制骨肉瘤S-180的联合抑瘤作用.方法 将VP3、IL-18基因插入pVAX1表达载体的pCMV启动子之下的EcoR I位点,构建成pVVP3及pVVp3-IL18.将该重组质粒与单独表达凋亡素基因的重组质粒分别注射荷S-180肿瘤细胞的BALB/C小鼠,比较抑瘤趋势和抑瘤率.结果 联合应用VP3基因和IL-18基因的重组病毒治疗组的抑瘤率(46.16%)高于单独应用VP3基因组的抑瘤率(19.56%),两组比较有统计学差异(P<0.05).结论 凋亡素基因具有凋亡诱导效应及体内的抑瘤效应.凋亡素基因VP3与IL-18基因有协同抑瘤效应,联合基因治疗骨肉瘤可提高抑瘤效果.
关键词： 凋亡素基因 IL-18基因 骨肉瘤S-180细胞 -
重组凋亡素基因特异性诱导卵巢癌细胞凋亡的体外研究
卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一,其死亡率位居妇科恶性肿瘤之首[1].随着分子生物学的发展,卵巢癌的治疗性研究已进入到基因水平.研究发现,利用合适的载体将鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV)的凋亡素基因(即VP3基因)导入靶细胞,能特异性诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无影响,提示凋亡素基因是用于恶性肿瘤基因治疗的一个理想的目的基因[2,3].迄今为止,国内外尚未有凋亡素基因对卵巢癌细胞影响的报道.
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凋亡素的抗肿瘤作用
细胞凋亡(Apoptosis)是机体的一种主动、程序化生理过程,受体内多种因素调节,凋亡过程的紊乱与肿瘤的发生发展密切相关.有研究者认为,病毒基因产物对凋亡有两方面的作用,一部分可抑制细胞凋亡,而另一些病毒基因产物则能诱导细胞凋亡[1-3].诱导细胞凋亡的病毒中,鸡贫血病毒(Chicken Anemia Virus, CAV)就是一种典型的具有特征性的代表,它的VP3基因被称为凋亡素基因(Apoptin),可独立诱导鸡成红细胞和成淋巴细胞发生凋亡,并具有诱导人肿瘤细胞或转化细胞等非正常细胞凋亡的作用[4].本文即对Apoptin的结构、功能及其抗肿瘤作用特点做一综述.
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鸡贫血病毒VP3基因核酸疫苗治疗荷SHG-44人脑胶质瘤大鼠的实验研究
目的 探索鸡贫血病毒VP3基因核酸疫苗(pVVP3)对SHG-44人脑胶质瘤生长的抑制作用.方法 构建荷SHG-44人脑胶质瘤Wistar大鼠的肿瘤模型,随机分组给予不同的处理给药,观察治疗期间及治疗后的肿瘤生长情况,通过病理组织学、超微结构分析,检测pVVP3在Wistar大鼠体内的抗肿瘤作用.结果 pVVP3治疗组肿瘤生长速度明显受到抑制,其抑瘤率达90.58%.病理组织学及超微结构观察在pVVP3治疗组可见典型的凋亡特征.说明pVVP3对SHG-44人脑胶质瘤生长有抑制作用,可诱导肿瘤细胞凋亡.
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携Apoptin和PEG3启动子双特异性溶瘤腺病毒对结直肠癌的抑制作用
目的:探讨携带凋亡素基因(Apoptin)和进行性增量基因3(progression-elevated gene 3,PEG3)启动子的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3 p-E1a对结直肠癌的体内、外抑制效果.方法:以Ad-Apoptin-PEG3 p-E1a、Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Ad-mock(均为前期工作构建)分别感染人结直肠癌SW1116细胞和胃黏膜上皮GES细胞,MTT法检测感染后细胞的增殖水平;流式细胞术检测细胞的凋亡情况;采用DCFH-DA和Rho123染色流式细胞术分别检测细胞活性氧水平和线粒体膜电位,Western blotting检测细胞色素C的释放.建立BALB/c小鼠结直肠癌CT26细胞皮下移植瘤模型,观察Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对结直肠癌皮下移植瘤的抑制作用.结果:Ad-Apoptin-PEG3p-E1a抑制SW1116细胞增殖,并具有一定的剂效和时效关系,以MOI=100感染72 h后抑制率达到(56.23-±6.64)％,其抑制能力明显强于Ad-pEG3p-E1a和Ad-Apoptin等对照组(均P＜0.05).Ad-Apoptin-PEG3 p-E1a感染导致SW1116细胞活性氧水平上调、线粒体膜电位下降以及细胞色素C释放增加,终诱导SW1116细胞凋亡,凋亡率为(37.97±3.78)％,但对正常GES细胞的上述各项指标均无明显影响.Ad-Apoptin-PEG3 p-E1a能显著抑制小鼠皮下移植瘤生长(P＜0.05);有效延长模型动物平均生存期,Ad-Apoptin-PEG3 p-E1a治疗组平均生存期为(41.0 ±0.7)d,显著高于Ad-PEG3p-E1a的(34.4±1.6)d、Ad-Apoptin的(33.2±1.2)d和Ad-mock的(28.4±1.4)d(均P＜0.05).结论:Ad-Apoptin-PEG3p-E1a可以特异性有效抑制结直肠癌细胞增殖及皮下移植瘤的生长.
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pIRApoptinHNIL18对结肠癌细胞HCT-116的抑制效应
目的:探讨联合应用凋亡素(apoptin)基因、新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuramidinase, HN)基因及人白介素18(hIL-18)基因体外对人结肠癌细胞HCT-116的抑制效应.方法:重组质粒pIRApoptinHNIL18通过脂质体介导法体外转染人结肠癌细胞HCT-116,通过Western blotting和RT-PCR检测外源基因表达;采用AO/EB染色法检测pIRApoptinHNIL18对人结肠癌细胞HCT-116抑制作用;利用流式细胞术分析pIRApoptinHNIL18对人结肠癌细胞HCT-116线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,△Ψ)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;采用3,5-二羟基甲苯法测定唾液酸含量.结果:pIRApoptinHNIL18转染人结肠癌细胞HCT-116后,外源基因能够有效表达;肿瘤细胞生长受到抑制;线粒体△Ψ由(94.41±8.17)%下降到(30.70±8.01)%(P＜0.05);唾液酸含量由(0.33±0.06) mmol/L下降到(0.09±0.03) mmol/L(P＜0.01);ROS水平由(52.48±6.09)%升高到(68.98±7.26)%(P＜0.05).结论:pIRApoptinHNIL18可通过线粒体途径诱导细胞凋亡,从而抑制人结肠癌细胞HCT-116的生长.
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新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤的治疗
目的:寻求有效的肿瘤基因治疗方法,研究新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因在无胸腺裸鼠体内的抗肿瘤作用.方法:建立BALB/c裸小鼠荷人结肠癌模型,瘤内注射脂质体包裹的真核重组子pVHN和pVVP3.观测pVHN和pVVP3治疗荷HCT裸鼠的效果,免疫组化法检测肿瘤细胞Bcl-2和PCNA的表达.结果:经HN基因和VP3基因联合治疗组的小鼠与荷瘤对照组小鼠相比,肿瘤体积明显缩小,抑瘤率可达70%.病理组织切片表明,治疗组裸鼠体内肿瘤细胞大量凋亡,局部地方可见细胞消失.免疫组化表明,Bcl-2和PCNA蛋白在荷HCT裸鼠对照组与各治疗组均有表达,其中Bcl-2表达在荷瘤对照组与pVHN治疗组差异有显著意义(P＜0.05),PCNA表达在荷瘤对照组与pVHN+pVVP3治疗组差异极其显著(P＜0.01).结论:NDV HN基因与凋亡素VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤细胞的增殖有一定抑制作用,可诱导其凋亡,其凋亡可能与下调Bcl-2表达有关.
关键词： 血凝素神经氨酸酶基因 凋亡素基因 结肠癌 BCL-2蛋白 增殖性细胞核抗原 -
携带凋亡素基因的溶瘤腺病毒ATV对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用
目的:探讨携带凋亡素基因(apopptin)的溶瘤腺病毒ATV感染对人宫颈癌HeLa细胞自噬和凋亡的影响.方法:分别用携带凋亡素基因的溶瘤腺病毒ATV与对照病毒Ad-MOCK(均为前期工作构建)感染HeLa细胞后,应用WST-1法检测ATV感染对HeLa细胞增殖的影响,流式细胞术检测ATV感染对HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响,Western blotting法检测ATV感染对HeLa细胞自噬相关蛋白LC3、P62与mTOR表达的影响,MDC染色法检测ATV感染对HeLa细胞自噬水平的影响.结果:ATV感染后抑制HeLa细胞增殖,并具有一定的时间效应关系;以ATV 100MOI感染72 h后抑制率达到59.26％,其抑制能力明显强于同时间段对照组(P＜0.01).ATV感染48 h,ATV组HeLa细胞凋亡率显著高于对照组[(38.995±4.009)％vs(14.680±1.174)％,P＜0.01].感染后的HeLa细胞,随着ATV作用时间的延长,S期出现阻滞,48 h阻滞强,显著高于对照组[(58.490±2.447)％vs (43.235±4.419)％,P＜0.05].与对照组相比,ATV感染HeLa后,LC3表达量6、12h逐渐增高,12h达到大值(P＜0.01),24 h表达量低(P＜0.01);P62蛋白在24 h出现高表达水平(P＜0.01);而mTOR随着作用时间延长逐渐降低(48 h时,P＜0.01).荧光显微镜下可见HeLa细胞核周区域MDC阳性染色,随着ATV作用时间延长,自噬小体明显增多;与对照组相比,6、12h自噬小体数量显著增多[(28.000±2.828) vs (8.500±2.121),(37.000±4.243) vs(14.000±1.414);均P＜0.01],24 h相对减少[(12.000±2.828) vs (17.000±1.414),P＜0.01].结论:携带凋亡素基因的ATV溶瘤腺病毒可促进人宫颈癌HeLa细胞的凋亡和自噬水平,进而特异性杀伤肿瘤细胞.
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腺病毒携带凋亡素和内皮抑素双基因对小鼠肝癌细胞增殖及凋亡的影响
目的 探讨肝癌基因治疗的新方法 .方法 建立C57 BL/6j小鼠皮下种植性肝癌模型,随机分为A、B、C、D组各8只.A组注射腺病毒携带凋亡素和内皮抑素双基因,B组注射腺病毒携带凋亡素单基因,C组注射腺病毒携带绿色荧光蛋白基因,D组注射生理盐水.治疗后连续12 d监测各组肿瘤体积,计算抑瘤率,RT-PCR法检测肿瘤组织中凋亡素、内皮抑素mRNA表达;TUNEL染色法检测肿瘤组织的原位凋亡并计算凋亡指数. 结果 治疗后第7天A组肿瘤体积明显小于其他各组,抑瘤率明显高于其他各组(P均<0.05);A组肿瘤组织中有凋亡素和内皮抑素mRNA表达,B组肿瘤组织中有凋亡素mRNA表达;A组凋亡指数明显高于其他各组,P<0.05.结论 腺病毒携带凋亡素和内皮抑素双基因能显著抑制小鼠肝癌细胞生长并能诱导其凋亡;该病毒有望用于肝癌的基因治疗.
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凋亡素基因联合抗肿癌药物干预肝细胞癌凋亡的研究
目的 探讨凋亡素基因联合抗肿癌药物干预肝细胞癌凋亡的效果.方法 通过腺病毒载体介导凋亡素基因导入Hepal-6肝细胞癌细胞中,联合应用阿霉素、顺铂,在细胞水平上检测凋亡率,评估效果.结果 观察组细胞凋亡率明显高于对照组和空白组(P<0.05).结论 凋亡素基因联合抗肿癌药物干预肝细胞癌凋亡有较佳的效果.
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VP3、IL-18对小鼠体内骨肉瘤S-180细胞的治疗作用
目的:旨在探讨双基因(VP3、IL-18)抑制骨肉瘤S-180的联合抑瘤作用.方法:将VP3、IL-18基因插入pVAX1表达载体的pCMV启动子之下的EcoRI位点,构建成pVVP3及pVVP3IL-18.将该重组质粒与单独表达凋亡素基因的重组质粒分别注射荷S-180肿瘤细胞的BALB/C小鼠,按照质粒与脂质体3:1的比例混合,每3天注射1次,连续注射3次,比较抑瘤趋势和抑瘤率.结果:联合应用VP3基因和IL-18基因的重组病毒治疗组对肿瘤的抑瘤效果明显优于单独应用VP3基因的重组病毒治疗组.结论:凋亡素基因具有凋亡诱导效应及体内的抑瘤效应.凋亡素基因VP3与IL-18基因有协同抑瘤效应,VP3、IL-18联合基因治疗骨肉瘤可显著提高抑瘤效果.
关键词： 凋亡素基因 IL-18基因 骨肉瘤S-180细胞 -
超声靶向微泡破碎联合半乳糖聚乙烯亚胺促凋亡素基因治疗肝癌移植瘤的实验
目的 探讨超声靶向微泡破碎(UTMD)联合半乳糖聚乙烯亚胺(PEI-Gal)介导凋亡素基因对小鼠肝癌移植瘤的抑制作用.方法 建立c57BL/6小鼠皮下肝癌移植瘤模型,随机分为4组:对照组；PEI-Gal+质粒组;PEI-Gal+超声+质粒组；PEI-Gal+ UTMD+质粒组.对组织行冰冻切片采用免疫荧光法检测转染率、Tunel检测凋亡率.观察肿瘤的体积和组织学变化,同时计算抑瘤率.采用免疫组织化学法检测移植瘤Bcl-2及Caspase-3蛋白在各组肿瘤标本中的表达.结果 PEI-Gal+ UTMD+ pEG-FP-N3组基因转染效率明显高于对照组、PEI-Gal+质粒组与PEI-Gal+超声+质粒组(P均＜0.01且对组织无明显损伤.治疗12天后PEI-Gal+ UTMD+ pCDNA-VP3组肿瘤凋亡率(34.57％±3.56％)、抑瘤率(56.6％)均显著高于对照组和PEI-Gal+质粒组(P均＜0.01).肿瘤组织中Bcl-2蛋白表达明显下降,Caspase3蛋白表达增加与其他各组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 超声靶向微泡破碎联合半乳糖聚乙烯亚胺能显著增强基因转染效率,且对组织无明显影响.联合凋亡素基因能通过诱导凋亡抑制肿瘤生长发挥抗瘤作用.
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表达凋亡素基因的重组禽痘病毒对人喉癌细胞Hep-2的抑制效应研究
目的:探讨含鸡贫血病病毒(CAV)凋亡素(Apoptin)基因的重组禽痘病毒vFVApoptin诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡的作用及其作用方式.方法:用vFVApoptin感染体外培养的人喉癌细胞Hep-2,运用MTT染色法检测重组质粒对肿瘤细胞的抑制作用;并运用流式细胞仪检测肿瘤细胞线粒体跨膜电位(ΔΨm)和细胞内活性氧(ROS)水平变化情况;通过免疫印迹检测细胞色素c(Cyto c)释放;应用底物显色法检测Caspase-3/9活性.结果:vFVApoptin感染可明显抑制Hep-2肿瘤细胞,并具有下调肿瘤细胞ΔΨm,上调其ROS水平,促进Cyto c释放和激活Caspase-3/9的功能.结论:vFVApoptin通过上调Hep-2肿瘤细胞内线粒体ROS产生,造成Cyto c的释放,激活Caspase-9,进而激活Caspase-3等下游凋亡因子,终通过线粒体途径诱导细胞凋亡抑制Hep-2肿瘤细胞.
关键词： 禽痘病毒 凋亡素基因 人喉癌细胞Hep-2 细胞凋亡 -
凋亡素基因的原核表达构建与提纯
目的构建凋亡素原核表达系统,制备提纯抗原物质凋亡素融合蛋白.方法用PCR的技术,以pcDNA-VP3质粒为模板,扩增出凋亡素VP3基因.将其克隆到原核表达载体pET-DsbA的多克隆位点,构建成凋亡素的高效原核表达载体pET-DsbA-VP3,将该质粒转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plysS中,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)对其进行诱导表达,固化Ni离子金属鏊合纯化带6X组氨酸标签的凋亡素融合蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白.结果转化有凋亡素基因的原核表达载体pET-DsbA-VP3的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导,固化Ni离子金属鏊合亲和层析纯化凋亡素融合蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳获得分子量为38.3 KD的目的蛋白条带.结论凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白.
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腺病毒载体介导凋亡素基因联合阿霉素与顺铂对种植性肝癌的治疗研究
目的 探讨腺病毒介导凋亡素基因联合阿霉素(ADM)与顺铂(CDDP)对种植性肝癌的治疗.方法 建立c57BL/6小鼠皮下荷肝细胞癌模型(n=64),计算成瘤率,观察肿瘤内注射含凋亡素基因的重组腺病毒、ADM及CDDP后种植瘤的体积变化、毒副作用和组织学变化,同时计算抑瘤率.结果 在治疗7d后腺病毒AdAFPvp3联合ADM与CDDP治疗组的种植瘤体积、重量均显著低于对照组,比较差异均具有统计学意义,在治疗期间没有观察到毒副作用.结论 携带凋亡素基因的重组腺病毒联合ADM与CDDP对肝细胞癌具有治疗作用.
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腺病毒载体携带凋亡素基因对人胃癌细胞的致凋亡作用
目的 探讨带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的重组腺病毒载体介导的凋亡素(VP3)基因对人胃癌细胞的致凋亡作用.方法 在HEK293细胞中包装Ad-EGFP-VP3和Ad-EGFP两种腺病毒,大量扩增,并测定两种腺病毒滴度.以MOI=20感染人胃癌细胞,12,24,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;用Hoechst33258试剂盒染色,观察凋亡形态学改变.24 h后用RT-PCR检测VP3基因的表达.6,12,24,48,72 h后用FCM检测胃癌细胞的凋亡率.结果 Ad-EGFP-VP3滴度为2.4×108 pfu/ml,Ad-EGFP滴度为2.1×108pfu/ml.Hoechst33528染色显示Ad-EGFP-VP3感染的胃癌细胞出现凋亡形态学改变.RT-PCR检测仅有Ad-EGFP-VP3感染的胃癌细胞表达VP3基因的mRNA.FCM检测Ad-EGFP-VP3感染人胃癌细胞12 h后凋亡率达51.7%.结论带有EGFP标记的重组腺病毒载体介导VP3基因导入胃癌细胞后,能有效诱导胃癌细胞凋亡.
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重组腺病毒载体携带凋亡素基因对肝癌细胞的作用
目的 探讨带有AFP启动子的重组腺病毒载体介导凋亡素基因对肝癌细胞的作用.方法 测定腺病毒AdAFPvp3滴度,并以MOI=100感染Hepal-6肝癌细胞(AFP+),HEK293细胞(AFP-),Lewis肺癌细胞(AFP-),24 h后Hoechst 33258染色观察凋亡形态学改变,RT-PCR检测vp3基因的表达.腺病毒AdAFPvp3以MOI=100感染hepal-6肝癌细胞,FCM检测肝癌细胞不同时段凋亡率.结果 腺病毒AdAFPvp3滴度为5×10(9)PFU/ml.Hoechst 33528染色显示甲胎蛋白阳性的Hepal-6肝癌细胞出现凋亡形态学改变,RT-PCR检测只有甲胎蛋白阳性的Hepal-6肝癌细胞表达vp3mRNA.FCM表明凋亡素基因能有效诱导肝癌细胞凋亡.结论 带有特异性甲胎蛋白启动子的重组腺病毒载体.介导凋亡素基因导入肝癌细胞后,对于能合成甲胎蛋白的肝癌细胞,具有特异性靶向性致凋亡作用.
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超声靶向微泡破碎联合半乳糖聚乙烯亚胺介导凋亡素基因诱导肝癌细胞凋亡的研究
目的:探讨超声靶向微泡破碎(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)联合半乳糖聚乙烯亚胺(PEI-Gal)介导凋亡素基因(VP3)诱导肝癌细胞HepG2凋亡的影响.方法:体外培养HepG2细胞,随机分为4组:(1)对照组;(2)PEI-Gal组;(3)PEI-Gal+超声组;(4)PEI-Gal+超声+微泡组.转染24 h后荧光显微镜观察pEGFP-VP3在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪检测转染效率,RT-PcR和Western blot分别检测VP3 mRNA和蛋白表达水平,AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡率.结果:流式细胞仪、RT-PCR和Western blot分析表明,PEI-Gal+超声+微泡组的转染效率为(28.83±2.07)%、VP3 mRNA水平为0.92±0.02,蛋白水平为1.65±0.06,HepG2凋亡率为(37.40±2.12)%,均显著高于其他各组(均P<0.01).结论:UTMD联合PEI-Gal可明显提高VP3基因转染HepG2细胞的效率及在HepG2细胞内的表达,增加HepG2细胞的凋亡率.
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腺病毒介导凋亡素基因对裸鼠种植性人胆管癌的治疗研究
目的 探讨腺病毒介导凋亡素基因对裸鼠种植性人胆管癌的治疗.方法 建立裸鼠皮下种植性人胆管癌模型,观察肿瘤内注射含凋亡素基因的重组腺病毒后种植瘤的体积变化、毒副作用和组织学变化,同时计算抑瘤率.结果 在治疗12 d后含凋亡素基因的腺病毒治疗组的种植瘤体积为(92.31±28.31)mm,较空病毒组(288.86±113.13)mm和生理盐水组(344.86±113.87)mm相比具有显著差别(P＜0.01).同时抑瘤率达到72.10%,明显高于空病毒治疗组11.9%(P＜0.01).在治疗期间没有观察到毒副作用.组织学结果也提示凋亡素基因是通过引发胆管癌细胞的凋亡来抑制肿瘤生长的.结论 含凋亡素基因的重组腺病毒对胆管癌具有治疗作用.
