NSBP1基因干扰RNA慢病毒载体的构建及效应检测

目的 构建和鉴定NSBP1基因RNA干扰慢病毒表达载体.方法 针对NSBP1 mRNA设计了3条siRNA,并构建pGCSIL-GFP-NSBP1慢病毒质粒,测序鉴定.用pGCSIL-GFP-NSBP1、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度.将慢病毒转染前列腺癌DU145细胞,Western-blot检测NSBP1表达,MTT法检测细胞生长活性,用转染细胞种植裸鼠成瘤,观察抑瘤效果.结果 PCR和测序证实,成功构建LV-shNSBP1的慢病毒载体,病毒滴度达2×10~8TU/mL.转染细胞中NSBP1蛋白表达显著降低,且MTT检测细胞生长活性明显减慢,转染细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用.结论 人NSBP1基因RNA干扰慢病毒载体构建成功,且NSBP1对前列腺癌激素非依赖DU145细胞的生长具有重要作用.

载脂蛋白E基因多态性与术后谵妄的关系

目的 探讨载脂蛋白E(ApoE)基因多态性与老年非心脏手术患者术后谵妄是否具有相关性.方法 212例65岁以上的择期非心脏手术患者纳入研究,于手术后1～3 d密切随访,根据CAM的标准判断患者有无发生谵妄.用突变特异性多重扩增系统(multi-ARMS PCR)方法测定患者ApoE基因型.结果 212例患者中有45例发生术后谵妄,共检出ApoE ε4等位基因携带者18例(8.5%).谵妄组有3例ApoE ε4携带者(6.7%),非谵妄组有15例ApoEε4携带者(9.0%),两组比较无显著差异.ε4/4纯合子型共有4例,其中1例术前3 d发生过一过性谵妄,还有1例发生术后严重谵妄,症状持续17 d.结论 ApoE ε4等位基因与术后谵妄发病率无显著的相关性,但ε4/4纯合子型可能更容易发生谵妄.

CXCR4-siRNA表达载体的构建及其对体外乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的 构建趋化因子受体(CXCR4)小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,研究其对体外乳腺癌细胞侵袭能力的影响.方法 选择CXCR4高表达的乳腺癌MDA-MB-231细胞系,设计合成人CXCR4基因不同靶点的能编码siRNA的2条双链DNA序列,克隆到真核表达载体pGE-1-U6/kna中构建siRNA表达载体,体外脂质体介导转染MDA-MB-231细胞,用Western blot分析CXCR4蛋白表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力.结果 成功构建了CXCR4-siRNA表达载体,瞬时转染乳腺癌细胞后能显著降低CXCR4的蛋白表达,可有效抑制人类乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭能力.结论 CXCR4-siRNA表达载体通过降低CXCR4基因的蛋白表达能显著抑制人类乳腺癌细胞的侵袭能力,有望为乳腺癌转移的基因治疗开辟新途径.

昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白及其生物学功能的初步鉴定

目的 建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白技术平台并鉴定其表达产物的生物学功能.方法 用搭桥PCR获得γ9Fc和δ2(OT3)Fc基因片段,构建成pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc重组质粒,与AcNPV昆虫病毒DNA共转染昆虫sf9细胞,表达TCR-γ9/δ2-Fc融合蛋白;Western blot鉴定TCRγ9/δ2-Fc蛋白表达位置;胞内流式细胞仪检测γ9和δ2(OT3)Fc两基因表达效率;蛋白G亲和层析后,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度;激光共聚焦扫描显微镜技术和生物传感器技术检测了TCRγ9/δ2-Fc蛋白与SKOV3细胞和MNS蛋白的结合特性.结果 成功构建pBACp10ph-γ9/δ2(013)-Fc表达载体,经鉴定发现TCRγ9/δ2-Fc蛋白在sf9细胞内表达,但γ9和δ2(OT3)Fc两基因的表达效率有较大差异.纯化得到一定纯度的TCRγ9/δ2-Fc蛋白,并且具有与SKOV3细胞和MNS蛋白结合的特性.结论 成功建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白的技术平台,表达产物TCRγ9/δ2-Fc可以在体外模拟TCRγδ识别抗原的特性.

PDGF-D和VEGF在胃癌中的表达及其意义

目的 探讨血小板源性生长因子D(PDGF-D)和血管内皮生长因子(VEGF)在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系.方法 用免疫组织化学(SP法)检测胃组织中PDGF-D和VEGF蛋白的表达,用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测部分胃癌组织标本PDGF-D和VEGF mRNA,分析两者之间的相关性及其与临床病理特征之间的关系.结果 胃癌组织中PDGF-D和VEGF蛋白的表达显著高于癌旁组织和正常胃组织(P<0.05);PDGF-D和VEGF的表达与胃癌的TNM分期、侵袭深度及淋巴结转移有关(P<0.05),PDGF-D的表达还与胃癌的分化程度有关(P<0.05);PDGF-D和VEGF在mRNA水平和蛋白水平的表达均呈正相关(均P<0.05).结论 PDGF-D和VEGF在胃癌组织中特异性高表达,可能在胃癌的发生、发展与转移中起着重要作用.

AHSG基因多态性与老年女性动脉硬化及骨质疏松的关系

目的 探讨老年女性α2-Hs糖蛋白(AHSG)基因多态性与动脉硬化以及血清骨相关生化指标的关系.方法 用ELISA法测定344名住院20～80岁女性患者骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原羧基末端肽、Ⅰ型胶原氨基末端肽和护骨素的浓度;对患者基因组的DNA样品作限制性内切酶Sac Ⅰ的PCR-RFLP检测,以确定其基因型,全自动生化仪酶法测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C,电极法测定血钙,DXA测定腰椎正位、仰卧侧位腰椎和股骨颈的骨密度(BMD).GG基因型患者做骨组织病理活检,彩色超声诊断仪测定颈动脉中内膜厚度(IMT).结果 (1)老年女性患者AHSG基因CC型、CG型和GG型分布频率分别为59.7%、25.1%和15.2%.不同基因型血脂、血Ca~(2+)和骨生化指标有明显差异;(2)协方差分析显示,正侧位腰椎、股骨颈的BMD和IMT与老年女性CG+GG基因型呈线性正相关趋势;(3)GG型老年女性患者骨组织病理切片和彩超验证了AHSG基因变异与动脉硬化、骨质疏松发生发展的相关性.结论 AHSG基因多态性变异与老年女性动脉硬化和骨质疏松的发病密切相关.

急性重复低氧对小鼠脑组织中糖酵解和线粒体氧化磷酸化以及能量负荷的影响

目的 探讨小鼠在重复急性低氧暴露后脑组织中的糖酵解、线粒体氧化磷酸化及能量负荷的变化.方法 成年BALB/c小鼠重复低氧暴露5次,测定每次低氧暴露时的平均耐受时间、体温及第0、1、3、5次低氧暴露后脑组织中的磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、线粒体复合体Ⅰ活性和磷酸腺苷水平.结果 重复低氧暴露使小鼠低氧耐受性增强,体温降低,脑组织中PFK和PK活性先增高后降低,复合体Ⅰ活性持续降低,能量负荷保持稳定.结论 重复急性低氧使小鼠脑组织的糖酵解活性出现规律性变化,线粒体的氧化磷酸化受抑制,但能量负荷保持稳定.

葛根素减轻乙醇导致大鼠生精细胞的凋亡

目的 观察乙醇导致大鼠生精细胞的凋亡及葛根素的干预.方法 将大鼠30只随机均分为对照组、乙醇组及葛根素干预组.于实验第40天免疫组织化学法(SABC)检测左侧睾丸各组BCL-2、BAX蛋白在生精细胞的表达;RT-PCR检测右侧睾丸各组BCL-2及BAX mRNA的表达;TUNEL法检测生精细胞的凋亡.结果 乙醇组平均每个生精小管断面中BCL-2蛋白阳性细胞数和A值低于对照组(P<0.01),而平均每个生精小管断面中BAX蛋白的阳性细胞数和A值高于对照组(P<0.01);乙醇组BAX mRNA表达较葛根素干预组及对照组强(P<0.05),而BCL-2 mRNA表达较葛根素干预组及对照组弱(P<0.05);乙醇组每个生精小管横切面中的凋亡细胞数目高于对照组(P<0.01),葛根素干预组显著缓解上述变化.结论 葛根素对乙醇导致的大鼠生精细胞凋亡有干预作用.

阿司匹林抑制内皮素-1诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖

目的 探讨阿司匹林(aspirin)对内皮素-1(ET-1)诱导的大鼠心脏成纤维细胞(CFs)增殖的干预作用及可能机制.方法 经差速贴壁法培养的新生大鼠CFs,随机分为7组:对照组、ET-1组、阿司匹林组、ET-1+阿司匹林1、2、5和10 mmol/L组.用四氮唑盐(MTT)法测定CFs数目,流式细胞仪检测CFs细胞周期,液体闪烁计数仪测定CFs[~3H]-脯氨酸掺入率,硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO含量.结果 与对照组相比,10~(-7)mol/L ET-1能显著促CFs增殖及[~3H]-脯氨酸掺入率,降低CFs生成NO_2~-/NO_3~-的量(均P<0.01),1～10 mmol/L阿司匹林呈浓度依赖性地缓解上述变化(均P<0.05);ET-1能显著提高S期细胞百分率(P<0.01),10 mmol/L阿司匹林抑制ET-1诱导S期细胞百分率上升(P<0.01).结论 阿司匹林抑制ET-1诱导的CFs增殖及胶原合成,可能和NO生成有关.

VEGF上调不同类型细胞Survivin的表达

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)对结肠癌细胞(LOVO、HCT116)、人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)Survivin表达的影响和存在的差异.方法 VEGF刺激体外培养的LOVO、HCT116、HUVECs并检测细胞周期和凋亡的变化,用RT-PCR测定mRNA表达,Western blot测定蛋白表达,用免疫细胞化学测定Survivin蛋白表达和部位.结果 VEGF可促进肿瘤细胞增殖,在结肠癌细胞中Survivin表达水平较高,在VEGF诱导后表达上调(P<0.05),主要分布在细胞质;在HUVECs中,Survivin表达不明显,VEGF诱导后表达明显上调(P<0.05),在细胞质和细胞核中均有较高表达.结论 VEGF上调3种细胞Survivin mRNA和蛋白表达,但在肿瘤和非肿瘤细胞Survivin上调的程度和分布存在差异.

移植骨髓间充质干细胞减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤

目的 观察移植骨髓间充质干细胞(MSCs)对脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤(ALI)的治疗修复作用.方法 全骨髓培养法培养小鼠骨髓MSCs;细胞免疫化学染色鉴定MSCs特异表面标记;小鼠咽后壁吸入LPS制造小鼠肺损伤;尾静脉注射引入MSCs;称重计算肺水肿指数;肺组织切片HE染色观察组织病理改变;ELISA检测肺泡灌洗液和肺组织匀浆中IL-1β含量;Brdu(5-Bromo-2-Deoxyuridine)标记供体MSCs,免疫组织化学染色及双染色观察移植细胞的迁移和分化状态.结果 培养的MSCs细胞表面标记CD44阳性,而造血系表面标记CD34阴性.吸入LPS后,小鼠出现典型的肺损伤病理改变,肺水肿指数和肺组织匀浆IL-1β含量明显增加.标记的MSCs移植入同种异体的肺损伤小鼠,其肺部出现标记的MSCs,并表达上皮细胞标志抗原-细胞角蛋白(CK).治疗后小鼠的肺水肿指数和肺组织匀浆IL-1β含量下降.结论 外源性MSCs移植到肺损伤小鼠体内,可迁移至肺损伤部位,并表达上皮细胞标志;移植MSCs可减轻肺水肿程度,减少炎性因子释放.

丙戊酸抑制血管紧张素Ⅱ致大鼠心肌细胞肥大

目的 探讨丙戊酸在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致心肌细胞肥大过程中的抑制作用.方法 常规方法培养大鼠原代心肌细胞,分为3组:对照组、肥大组、丙戊酸组.利用AngⅡ刺激心肌细胞造成肥大模型,并给予丙戊酸进行干预.反转录聚合酶链反应观察β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA表达;相差显微镜和电镜观察心肌细胞的表面积和超微结构变化;免疫组织化学法检测C-FOS蛋白的表达.结果 原代心肌细胞在AngⅡ作用下表面积增加,超微结构发生改变β-MHC mRNA和C-FOS蛋白表达增加(P<0.05).给予丙戊酸干预后,上述变化显著缓解(P<0.05).结论 丙戊酸抑制AngⅡ刺激引起的心肌细胞肥大,为临床上治疗心肌肥厚提供一条新的思路.

2型糖尿病患者单核巨噬细胞胆固醇外流的降低与ABCG1表达下调相关

目的 研究2型糖尿病患者巨噬细胞内胆固醇外流的变化及ABCA1、ABCG1和SR-B1的表达情况.方法 选取2型糖尿病患者30例(包括合并冠心病组与单纯糖尿病组各15例)和正常对照组15例.分离外周血单核细胞进行巨噬化培养,应用Real-time PCR与Western blot方法测定细胞ATP结合盒受体A1(ABCA1)、ATP结合盒受体G1(ABCG1)和清道夫受体B1(SR-B1)的mRNA及蛋白表达.以5%自身血清及标准血清为接受体测定巨噬细胞胆固醇流出率.结果 ABCG1在2型糖尿病患者巨噬细胞中的mRNA与蛋白表达显著低于对照组,而ABCA1与SR-B1的表达在各组间无差异.2型糖尿病患者巨噬细胞的胆固醇流出率也显著低于对照组(P<0.01);ABCG1的mRNA表达与巨噬细胞胆固醇外流率呈显著正相关(r=0.552,r=0.630,P<0.01).结论 2型糖尿病患者巨噬细胞的胆固醇外流功能明显降低,与ABCG1表达下调相关.

与原发性食管癌进展相关基因的筛选

目的 应用基因微矩阵技术分析原发性食管癌基因表达谱,筛选与食管癌进展相关基因.方法 利用激光捕获微切割-T7 RNA聚合酶体外扩增联合cDNA芯片技术对15例原发性食管癌的基因表达谱进行筛选,并通过比较组间差异基因筛选出与肿瘤进展相关的基因.结果 在886条目的 基因中,筛选出34条基因在Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ组间存在显著性差异(P<0.05),其中细胞周期调节类基因与早期食管癌发生有关,而细胞外基质类、黏附分子类基因主要参与食管癌的浸润和转移.结论 多个基因表达变化在食管癌发生中起作用,而进展相关基因的筛选为其临床诊治提供了新的思路和线索.

血管P2受体的功能及其与某些血管疾病的关系

P2受体分为配体门控离子通道型P2X受体和G蛋白偶联型P2Y受体.血管内皮细胞及平滑肌细胞有多种P2X和P2Y受体亚型表达.嘌呤信号与动脉粥样硬化、脑血管老化及血管重塑等血管疾病有关,并可能为治疗与血管有关疾病提供新的治疗靶点.

水通道蛋白与肿瘤

水通道蛋白(AQPa)是一类小分子质量的膜内嵌蛋白,它所介导的自由水快速被动的跨生物膜转运是水进出细胞的主要途径.AQPs大量表达于不同组织来源的肿瘤细胞,特别是侵袭性肿瘤.AQPs高表达的肿瘤细胞在体外表现为较强的迁移能力,体内则表现为局部侵袭力增强、渗出增多以及转移灶增多.抑制AQPs的表达将有可能为肿瘤的治疗提供帮助.

内质网应激参与糖脂毒性引起的胰岛β细胞凋亡

胰岛β细胞具有高度发达的内质网,是对内质网应激敏感的细胞之一.高浓度的游离脂肪酸引起内质网应激反应,进而诱导了β细胞的凋亡,葡萄糖则促进了脂肪酸通过内质网应激引起的β细胞凋亡.总之,内质网应激介导了糖脂毒性引起的β细胞凋亡.

丙戊酸钠对成年癫痫患者血脂代谢及甲状腺功能影响

癫痫是神经系统疾病中的常见病、多发病,目前癫痫的治疗以药物治疗为主~([1]).抗癫痫药丙戊酸钠(VPA)引起血脂异常的机制不明确~([2-3]).本研究检测癫痫患者治疗前后血脂和甲状腺功能,探讨临床意义.

甘精胰岛素在2型糖尿病中的临床疗效分析

2型糖尿病是一种进行性进展的疾病,其特点表现为胰岛B细胞功能的进行性减退和内源性胰岛素分泌的进行性减少.对于2型糖尿病尽早启用基础胰岛素治疗,这对糖尿病专科医生已成共识.甘精胰岛素(insulin glargine)作为基础胰岛素治疗,已经在临床上大量使用.本研究对90例甘精胰岛素临床使用情况进行回顾性分析.

罗格列酮增加STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏色素上皮衍生因子的表达

转化生长因子(TGF)-β1在糖尿病肾病(DN)的发生中起关键作用,而肾小球系膜细胞分泌的色素上皮衍生因子(PEDF)可抑制TGF-β1的表达~([1]),故可能对DN起保护作用.本实验通过罗格列酮干预治疗,探讨其对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏保护作用的机制.

实时荧光PCR检测病原真菌方法的建立及其临床应用

近年来条件致病性真菌感染日益增多,其发病率和死亡率都呈明显上升趋势,由于深部真菌感染初期症状不明显,临床表现缺乏特征性,致使早期明确诊断十分困难,患者生前确诊率相当低,是影响患者预后的重要因素.传统真菌感染的临床鉴定主要依赖于镜检和培养,但这些方法存在周期长、阳性率低的缺点.

病理生理学PBL教学改革的探索和实践

本文介绍了我系自2004年起开展以心力衰竭为专题的PBL教学改革.学生根据病例自学心力衰竭的病理生理知识,各小组推荐发言人对所学知识进行总结陈述,并写出相关的读书报告.在PBL教学工作中,编写病例和小组讨论十分重要,同时要注重教师角色的转换以及与其他学科的配合.

癌症:脂肪与应激