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人端粒酶逆转录酶RNA干扰对结肠癌细胞生物学行为的影响
目的 研究端粒酶逆转录酶(hTERT)RNA干扰对结肠癌HCT 116细胞生物学行为的影响.方法 将HCT 116细胞分为转染组(转染重组质粒真核表达载体)、对照组(转染空载体质粒)和未转染组.PCR方法检测hTERT干扰序列,RT-PCR方法检测hTERT表达,HE染色、生长曲线和流式细胞术方法分别检测细胞形态、细胞增殖和细胞周期,B-半乳糖苷酶染色方法检测细胞衰老.Annexin V/PI染色流式细胞光度术检测细胞凋亡.结果 转染细胞内均存在hTERT干扰序列,hTERT干扰率为21.5%;与未转染细胞相比,转染细胞核质比明显缩小,增殖率显著下降(P<0.05),衰老细胞和G<,2>-M期细胞明显增加(P
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结肠癌中骨形成蛋白-6启动子异常甲基化
目的 研究骨形成蛋白-6(BMP-6)启动子在结肠癌细胞中的甲基化状态.方法 运用甲基化特异PCR(MSP)法检测30例原发结肠癌和癌旁组织中BMP-6的甲基化水平.甲基化修饰后亚硫酸盐测序PCR(BSP)分析结肠癌细胞C0L0-205细胞BMP-6启动子CpG岛甲基化状态.提取细胞RNA,通过实时定量PCR(real time-PCR)检测BMP-6 mRNA在不同浓度的DNA甲基化酶抑制剂5'-杂氮-2'-脱氧胞嘧啶(5-aga-dC)处理C0L0-205细胞后BMP-6 mRNA的改变情况.结果 原发性结肠癌的甲基化异常检出率是33.3%(10/30).BMP-6在C0L0-205细胞中存在高甲基化状态,C0L0-205细胞经5-aza-dC处理后BMP-6 mRNA表达明显上调.结论 BMP-6存原发性结肠癌中存在甲基化异常,说明BMP-6基因甲基化异常可能参与结肠癌的发生.
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冬凌草甲素诱导结肠癌细胞凋亡的实验研究
目的观察冬凌草甲素体外诱导人结肠癌HCT8细胞凋亡的作用.方法利用光镜及流式细胞仪观察不同浓度冬凌草甲素诱导结肠癌HCT8细胞凋亡的作用.结果冬凌草甲素可诱导HCT8细胞凋亡,且凋亡率随着浓度的增加而增加.结论冬凌草甲素对HCT8细胞株具有体外抗肿瘤作用,其作用机制与诱导凋亡有关.
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洋葱提取物对人结肠癌细胞凋亡及周期的影响
目的 研究洋葱水提取物和乙醇提取物对结肠癌细胞株凋亡及细胞周期的影响.方法 采用水提取和乙醇提取洋葱后,用紫外可见分光光度仪检测提取物中黄酮类化合物含量.体外培养结肠癌细胞株(LoVo cells、SW480 cells、HT-29 cells、HCT -8 cells),采用含黄酮类化合物浓度40 mg/L和60 mg/L的提取物对其进行干预,流式细胞仪检测洋葱水提取物和乙醇提取物对结肠癌细胞株凋亡影响,检测含黄酮类化合物浓度为40 mg/L的水提取物和乙醇提取物对结肠癌细胞周期的影响.结果 洋葱水提取物和乙醇提取物对结肠癌细胞株的凋亡具有剂量依赖性,其中水提取物引起SW480、HCT -8细胞株凋亡率较乙醇提取物高.而乙醇提取物引起HT - 29细胞株凋亡率较水提取物高.洋葱提取物能将结肠癌细胞株的细胞周期阻滞在G1期,阻碍其向S期转换,以抑制细胞增殖.结论 洋葱水提取物和乙醇提取物能够诱导结肠癌细胞株的凋亡,并能够对结肠癌细胞周期产生影响,其具体机制需进一步探讨.
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高压氧联合细胞周期特异性药物对结肠腺癌Lovo细胞的杀伤作用
目的 探讨高压氧(HBO)联合细胞周期特异性药物氟尿嘧啶对结肠腺癌Lovo细胞的杀伤作用.方法 0.20 MPa HBO暴露后联合应用不同浓度氟尿嘧啶处理结肠腺癌Lovo细胞.流式细胞仪检测细胞周期,四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察其对结肠腺癌细胞增殖的抑制作用.结果 ①HBO暴露后Lovo细胞S期细胞积聚较对照组明显增多(P＜0.01),HBO暴露后24 h组Lovo细胞S期积聚明显高于HBO暴露后12 h组和48 h组(P＜0.01)；②0.20 MPa HBO暴露后24 h联合应用低浓度氟尿嘧啶(≤8 μM)作用Lovo细胞12 h后,HBO联合氟尿嘧啶组癌细胞增殖的抑制程度与氟尿嘧啶组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；药物作用48 h后,HBO联合氟尿嘧啶组与氟尿嘧啶组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)；③中浓度和高浓度(16、32和64 μM)的氟尿嘧啶作用于Lovo细胞12 h,HBO联合氟尿嘧啶组与氟尿嘧啶组之间差异无统计学意义(JP＞0.05)；药物作用48 h后,HBO联合氟尿嘧啶组与氟尿嘧啶组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 0.20 MPa HBO暴露可提高细胞周期特异性药物氟尿嘧啶对Lovo细胞的杀伤作用,尤其增强低浓度氟尿嘧啶对结肠腺癌细胞的杀伤作用.
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黏着斑激酶在结肠癌细胞中的表达及对其迁移的影响
[目的]观察局部黏着斑激酶(FAK)在结肠癌细胞中的表达及对结肠癌细胞侵袭动力和生长的影响.[方法]应用RT-PCR、Western blot方法测定结肠癌细胞株(HT-29)和正常肠上皮细胞中FAK的表达;在血小板源性生长因子(PDGF)刺激肿瘤细胞后,应用细胞黏附分析和体外侵袭试验方法,测定不同时间点细胞的体外黏附能力变化及侵袭能力,同时行FAK表达测定.[结果]结肠癌细胞较正常上皮细胞存在较高水平的FAK表达.PDGF干预组与非干预组比较,能促进HT-29的黏附功能(90.0%)和侵袭能力(54.5%),在该过程中,FAK的表达和活性升高(P＜0.05).[结论]FAK对结肠癌细胞的体外黏附与迁移发挥重要的作用.
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血管抑制素基因抑制结肠癌细胞增殖及肿瘤血管生成的研究
目的:研究血管抑制素基因体外对结肠癌细胞增殖的抑制及体内对肿瘤血管生成的抑制,探讨血管抑制素基因对结肠癌的抑制作用.方法:构建重组质粒pcDNA3.1(+)/angio,用脂质体转染法将重组质粒、空白载体导入结肠癌细胞Colo205,培养细胞观察细胞生长,绘制细胞生长曲线,计算增殖抑制率,然后将pcDNA3.1(+)/angio、pcDNA3.1(+)/Colo205、Colo205分别接种至裸鼠右侧颈部皮下,观察肿瘤的生长,测量肿瘤体积,计算抑瘤率,免疫组化检测肿瘤组织中微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果:体外pcDNA3.1(+)/angio组细胞的生长速度略慢于pcDNA3.1(+)/Colo205、Colo205组,但差异无统计学意义(P＞0.05);体内pcDNA3.1(+)/angio组细胞的致瘤力显著降低,瘤体增长缓慢,抑瘤率较高(P＜0.01),瘤体组织中MVD及VEGF的表达较低(P＜0.05);pcDNA3.1(+)/Colo205、Colo205两组之间的差异无统计学意义(P＞0.05).结论:在体外血管抑制素不直接影响结肠癌细胞Colo205的生物学特性,但在体内可强烈抑制肿瘤的生长,其机制可能是通过降低血管生成因子而抑制肿瘤的新生血管生成,发挥抑制肿瘤作用.
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AMPK在二甲双胍诱导结肠癌细胞SW48O自噬中的作用
目的 研究二甲双胍是否影响人结肠癌SW480细胞中AMPK活性,并探讨AMPK在二甲双胍诱导自噬中的作用.方法 用不同剂量(0、1、5、10 mmol/L)二甲双胍处理SW480细胞24 h,Western blot检测AMPK、p-AMPK以及自噬相关蛋白LC3、p62蛋白表达;荧光定量PCR检测LC3 mRNA表达.二甲双胍与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)单独或联合处理后,Western blot检测LC3、p62表达.沉默AMPK后,10 mmol/L二甲双胍处理SW480细胞24 h,Western blot检测LC3、p62蛋白表达,荧光定量PCR检测LC3mRNA表达情况.结果 不同浓度二甲双胍(1、5、10 mmol/L)处理SW480细胞后,AMPK磷酸化水平递增上升,LC3蛋白及mRNA递增表达增加,p62递减表达降低.二甲双胍与3-MA联合处理SW480细胞后,LC3表达降低,p62表达升高.3-MA有抑制二甲双胍的作用.沉默AMPK后,LC3蛋白及mRNA表达下降,p62蛋白表达增加.结论 二甲双胍可诱导SW480细胞中AMPK活化,AMPK的活化参与了二甲双胍诱导的自噬.
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不同氧浓度下结肠癌细胞缺氧诱导因子-1α表达及糖酵解的差异
目的 观察不同氧浓度下结肠癌细胞株SW480中缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor HIF)-1α、糖酵解限速酶表达的差异及细胞培养上清液中乳酸浓度的变化.方法 将传代培养的结肠癌细胞置于不同氧浓度的环境中培养12小时,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和western-blot法检测HIF-1αmRNA和蛋白表达水平;RT-PCR和western-blot法检测常氧和缺氧状态下结肠癌细胞糖酵解限速酶葡萄糖转运蛋白(glucose transporter 1,GLUT-1)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDH-A)基因的表达.比色法测定结肠癌细胞上清液中的乳酸浓度.结果 随着培养环境氧浓度下降,结肠癌细胞中HIF-1α表达逐步增加(P＜0.05),糖酵解限速酶GLUT-1和LDH-A表达逐步增加(P＜0.05),结肠癌细胞培养上清液中乳酸浓度逐步增高(P＜0.05).结论 低氧环境可以上调结肠癌细胞中HIF-1α和GLUT-1、LDH-A的表达,以及细胞培养上清液中乳酸浓度.随着氧浓度下降,差异有统计学意义(P＜0.05).低氧环境下HIF-1 α上调可促进结肠癌细胞的增殖.
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KISS-1基因对结肠癌细胞株HT29体外表达的影响
目的 观察KISS-1基因对结肠癌细胞株HT29体外表达的作用和对其生物学功能的影响.方法 通过基因转染法使KISS-1在结肠癌细胞株HT29中稳定表达,应用噻唑蓝(MTT)法和Transwell侵袭实验检测KISS-1表达对结肠癌细胞株HT29的增殖和侵袭能力的作用和影响;通过免疫组织化学法和实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测KISS-1基因mRNA在体外结肠癌细胞株HT29中的表达水平,并用Real-time PCR测定转染后结肠癌细胞株HT29中c-fos、c-jun mRNA水平表达变化,并通过显微镜、透射电镜等观察凋亡细胞的形态学改变.结果 (1)Real-time PCR和免疫细胞组织化学证实转染后结肠癌细胞中有KISS-1稳定表达.(2)MTt法表明:培养0、24 h时各组HT29细胞数差异无统计学意义(P＞0.05),48 h后,随着培养时间延长,转染组HT29细胞数明显低于空白对照组与阴性对照组(P＜0.05),而空白对照组与阴性对照组HT29细胞数差异无统计学意义(P＞0.05).(3) Transwell侵袭实验结果:转染KISS-1基因的结肠癌细胞HT29穿透Matrigel基底膜的细胞数显著低于空质粒转染组及空白对照组细胞(P＜0.01),侵袭指数显著降低(P＜0.01),侵袭力抑制率达到56.5％,显著低于空质粒转染组及空白对照组细胞(P＜0.01).空质粒转染组及空白对照组细胞比较,侵袭穿膜细胞数差异无统计学意义(P＞0.05).(4)KISS-1作用于结肠癌细胞株HT29 24 h后,形态学观察结肠癌细胞株HT29发生凋亡或坏死.(5)Real-time PCR:转染组c-jun和c-fos吸光度值为0.87 ±0.16和0.44±0.12,阴性对照组吸光度值为1.82±0.39和1.76±0.34,空白对照组吸光度值为1.65±0.36和1.58±0.31.与对照组比较,转染组c-jun和c-fos扩增产物条带吸光度值均显著降低(P＜0.01).结论 KISS-1基因对体外结肠癌细胞株HT29具有抑制增殖和促进凋亡作用,其可能是通过负性调控信号通路降低结肠癌细胞中c-fos、c-jun的表达.
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表没食子儿茶素没食子酸酯对结肠癌HCT-8和HT29细胞株的作用及对Notch1与Notch2的基因表达的影响
表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚中含量高、活性强的单体,具有抗癌作用[1]。本研究旨在观察EGCG对结肠癌细胞HCT-8和HT29细胞增殖的抑制作用及对Notch1与Notch2基因的影响,探讨其抑癌机制。一、材料与方法1.噻唑蓝(MTT)比色法检测EGCG对细胞增殖的抑制作用:将细胞接种于96孔板中,将孔中添加终质量浓度为0 mg/L(对照组),10、20、35 mg/L EGCG(实验组)的完全培养基,孵育24、72 h,加入CCK-8反应液,酶标仪读数后,计算抑制率。
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碱性成纤维细胞生长因子基因敲除肝细胞与结肠癌细胞的关系
我们通过建立一个全新的三维细胞共培养模型观察肿瘤细胞与宿主细胞之间的关系.同时观察来源于野生型及碱性成纤维细胞生长因子(FGF)-2基因敲除的小鼠的肝细胞对结肠癌细胞的移行、增殖的影响,以及共孵育一段时间后培养液内表皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)浓度的变化.
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δ氨基酮戊酸-光动力疗法对人结肠癌细胞SW480游离钙浓度的影响
我们利用激光共聚焦显微镜动态观察δ氨基酮戊酸-光动疗法(ALA-PDT)作用后SW480细胞内 Ca2+浓度的变化,以期对ALA-PDT介导的信号传导机制进行探讨.
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反义GAcDNA重组质粒的构建及其对结肠癌细胞增殖的影响
谷氨酰胺(Gln)是肿瘤细胞的主要呼吸燃料和重要氮源[1].谷氨酰胺酶(GA)是肿瘤细胞酵解Gln的起始酶和关键酶,封闭GA基因则可能阻断肿瘤细胞内Gln的酵解,进而抑制其生长,我们将GAcDNA反向构建在PcDNA3.0真核表达载体上,转染人结肠癌细胞,观察它对结肠癌细胞生长曲线和增殖能力的影响.
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高尔基磷酸化蛋白3基因过表达降低人结肠癌细胞对铂类化疗的敏感性及其机制
目的 探讨高尔基磷酸化蛋白3(GOLPH3)基因过表达对人结肠癌细胞HT29顺铂化疗敏感性的影响及其机制.方法 将HT29细胞分为4组:对照组(HT29)、转染组[小干扰RNA(siRNA)-GOLPH3]、实验组1(10μmol/L顺铂)、实验组2(siRNA-GOLPH3+ 10 μmol/L顺铂).反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测人结肠癌细胞转染后的沉默效果.噻唑蓝(MTT)、瘤球形成实验、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)流式细胞实验分别检测各组细胞增殖、成瘤、凋亡.Western blot检测各组细胞GOLPH3、P-糖蛋白(P-gp)、β-连环蛋白(β-catenin)的表达水平.裸鼠随机分为4组,分别为裸鼠对照组(HT29+ NS)、裸鼠转染组(siRNA-GOLPH3 HT29+ NS)、裸鼠实验组1(HT29+顺铂)及裸鼠实验组2(siRNA-GOLPH3 HT29+顺铂),观察30 d内成瘤.结果 与对照组比较,转染组细胞中的GOLPH3 mRNA和蛋白的相对表达量明显降低(1.002±0.223比0.162 ±0.062;1.003±0.094比0.099±0.112)(P＜0.01),凋亡率明显升高[(1.843±1.298)％比(15.520±2.921)％,P＜0.01].在顺铂处理条件下,实验组2的A值(0.236 ±0.071)及瘤球数[(30.750±14.500)％]明显低于实验组1(0.746±0.085、212.800±30.380),而凋亡率明显高于实验组1[(59.400±2.392)％比(23.890±6.363)％,p＜0.01].裸鼠实验中转染组、实验组1、实验组2裸鼠腋窝皮下移植瘤体的体积均显著低于对照组[(1.738±0.121)、(1.573±0.224)、(0.625±0.189) mm3比(2.083±0.110) mm3],差异均有统计学意义(P＜0.05).实验组1裸鼠自15d后其瘤体体积均大于同期实验组2裸鼠的瘤体体积(P＜0.01).与对照组比较,实验组1的GOLPH3、β-catenin、P-gp蛋白表达量同步升高(1.000±0.173比2.734±0.440,1.000±0.078比2.472±0.444,1.014±0.346比4.269±0.454)(P＜0.01).实验组2的GOLPH3、β-catenin、P-gp的蛋白表达水平较实验组1均明显降低(0.249±0.084比2.734±0.440;0.993±0.052比2.472±0.444;1.842±0.383比4.269±0.454)(P＜0.01).结论 GOLPH3基因过表达可通过激活Wnt/β-catenin细胞信号通路降低HT29结肠癌细胞对顺铂化疗的敏感度.
关键词： 高尔基磷蛋白3 结肠癌细胞 Wnt/β-连环蛋白信号通路 化疗敏感性 顺铂 -
阿司匹林对人结肠癌细胞株SW480、HT29中VEGF、β-catenin表达的影响
目的 探讨阿司匹林对人结肠癌细胞株HT-29、SW480生长增殖的影响及其β-catenin、VEGF蛋白和mRNA的表达,并为结直肠癌的预防和治疗提供新的实验和理论依据.方法 采用MTT法检测阿司匹林对SW480、HT-29细胞生长增殖的影响;Real-time PCR和Western blot法检测HT-29、SW480细胞中VEGF、β-catenin mRNA及蛋白的表达情况.结果 在SW480、HT-29细胞的生长增殖过程中,阿司匹林对其有着显著的抑制作用,且具有量效、时效关系;除6h干预组外,余各组阿司匹林均可抑制VEGF、β-catenin蛋白和mRNA的表达(P＜0.05).结论 阿司匹林对人结直肠癌细胞株SW480、HT-29的生长增殖具有显著的抑制作用,并对SW480、HT-29中VEGF、β-catenin mRNA和蛋白质的表达具有显著的下调效应;而阿司匹林通过抑制β-catenin的表达,同时调节VEGF抑制肿瘤血管的生成可能是其预防和治疗结直肠癌的作用机制之一.
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扶正抑癌方含药血清对结肠癌Lovo细胞TGF-β/Smad信号转导通路的影响及意义
目的 通过观察扶正抑癌方含药血清对结肠癌Lovo细胞TGF-β/smad信号转导通路中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达的影响,明确扶正抑癌方抑制结肠癌细胞间质化转变的作用机制.方法 Lovo细胞体外培养,制备大鼠不同浓度含药血清后,MTT法测定不同浓度含药血清对细胞增殖的影响,以5 Fu作为阳性对照；通过Western blot检测TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白的表达.结果 大剂量含药血清组24 h对Lovo细胞抑制率较中剂量、小剂量组作用更加明显,差异具有统计学意义(P＜0.01).Western blot检测结果表明扶正抑癌方含药血清可以下调Lovo细胞TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表达,与正常组和空白组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 扶正抑癌方含药血清可能通过下调TGF-β/smad信号转导通路中TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表达,抑制Lovo细胞间质化转变.
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bmi-1shRNA逆转录病毒表达载体的构建及稳定转染LoVo细胞系的建立
目的 构建针对原癌基因bmi-1的shRNA逆转录病毒表达载体,建立稳定转染的LoVo细胞系,探讨稳定转染bmi-1shRNA对大肠癌细胞LoVo靶基因表达的影响,为下一步应用RNAi技术治疗打下基础.方法 设计合成靶向bmi-1基因编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,另设计无义对照序列,构建重组载体pSIREN-bmi-1及pSIREN-bmi-1-C,载体经脂质体2000介导转染LoVo细胞,通过嘌呤霉素筛选,建立稳定转染的LoVo细胞系,显微镜观察、MTT检测、荧光定量PCR、Western blot检测bmi-1表达受抑后对细胞的增殖影响.结果 成功构建了针对bmi-1基因的shRNA表达载体,建立了稳定转染的LoVo细胞系,bmi-1shRNA对LoVo细胞bmi-1 mRNA表达抑制率为80%、bmi-1蛋白抑制率为82%,P<0.05.结论 针对bmi-1基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞LoVo的增殖能力,bmi-1 mRNA与蛋白表达受抑制,但对细胞形态学无明显影响.
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榄香烯乳对结肠癌Lovo细胞端粒酶活性、细胞凋亡及细胞周期的影响
目的:探讨榄香烯乳对结肠癌Lovo细胞的作用机制.方法:采用不用浓度的榄香烯乳处理结肠癌Lovo细胞后,分别应用四唑蓝比色试验、端粒重复扩增-微孔板杂交法、琼脂糖凝胶电泳方法及流式细胞仪研究榄香烯乳对结肠癌细胞生长、端粒酶活性、凋亡及细胞周期的影响.结果:榄香烯乳对结肠癌Lovo细胞增殖具有较强的抑制作用,能够抑制端粒酶活性,诱导细胞凋亡,且这种作用呈浓度及时间依赖;且细胞阻滞于G0/G1期.结论:榄香烯乳抑制结肠癌Lovo细胞恶性增殖与抑制端粒酶活性、诱导凋亡及细胞周期阻滞有关.
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丁酸钠对结肠癌细胞SW480凋亡及Survivin基因和VEGF表达水平的影响
目的:观察丁酸钠对结肠癌细胞株SW480的生长抑制、凋亡情况以及对生成素(Survivin)表达水平的影响,探讨其预防结肠癌的作用机制.方法:人传代结肠癌细胞株SW480经不同浓度丁酸钠处理后,在不同时段收集细胞,分别用四唑蓝法检测肿瘤细胞生长增殖率,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化,免疫细胞化学技术观察对Survivin基因和血管内皮生长因子(VEGF)表达水平.结果:随着培养液中丁酸浓度的不断升高和培养时间的延长,SW480细胞的生长逐渐受到抑制.G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,细胞凋亡率逐渐增高.Sur-vivin基因和VEGF随着丁酸浓度的不断升高而表达下降.结论:丁酸钠能抑制SW480细胞株增生,诱导凋亡,并抑制Survivin基因和VEGF表达.
