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辛二酰苯胺异羟肟酸对结肠癌HCT116和SW480细胞增殖、周期和凋亡的影响
目的:研究辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对结肠癌细胞系HCT116和SW480增殖、周期和凋亡的影响,并对其分子作用机制进行初步探讨.方法:将不同浓度SAHA分别处理结肠癌HCT116和SW480细胞后,MTT法检测SAHA对HCT116和SW480细胞增殖的影响,流式细胞仪检测HCT116和SW480细胞周期和细胞凋亡率,罗丹明(rhodamine) 123和二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测HCT116和SW480细胞线粒体跨膜电位(Aψm)和活性氧(ROS)水平,Real-time PCR和Western blotting法检测乙酰化组蛋白3(Ac-H3)、p21、CyclinD1、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白的表达水平.结果:SAHA作用于HCT116和SW480细胞48 h后,细胞增殖被抑制、细胞周期G1期比率升高、凋亡率升高(均P＜0.05),线粒体跨膜电位显著下降、细胞内ROS产生增多(均P＜0.05).与对照组比较,SAHA处理组p21和Bax mRNA增多、Cyclin D1和Bcl-2 mRNA表达量减少(均P＜0.05),相关蛋白Ac-H3、p21和Bax增多,CyclinD1和Bcl-2减少(均P＜0.05).结论:SAHA抑制结肠癌HCT116和SW480细胞增殖、阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡,其机可能与调节p21、CyclinD1和Bcl-2家族基因的表达、促进组蛋白乙酰化有关.
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EGFR/IGFR-1β异二聚体形成对吉非替尼抑制结肠癌细胞增殖的影响
目的:观察EGFR(epidermal growth factor receptor)和IGFR-1β(insulin-like growth factor receptor-1β)的相互作用,探讨IGFR-1β对吉非替尼(gefitinib)抑制结肠癌细胞增殖的影响.方珐:以免疫共沉淀法和Western blotting检测EGFR和IGFR-1β之间以及受体与下游信号通路蛋白AKT、MAPK的结合.以IGFR-1酪氨酸激酶抑制剂AG1024和吉非替尼单独或联合作用于3种结肠癌细胞(LoVo,HT29,HCT116细胞),MTT法检测细胞增殖率.结果:LoVo细胞(吉非替尼敏感型)在有或无吉非替尼作用下均不出现与EGFR结合的IGFR-1β条带,HT29细胞(吉非替尼中度敏感型)在吉非替尼作用下可见该条带,而HCT116细胞(吉非替尼耐受型)在有或无吉非替尼作用下均可见条带.LoVo细胞的吉非替尼作用组、HT29细胞的联合用药组以及HCT116细胞的AG1024作用组EGFR结合的AKT、MAPK显著减少(P<0.05).LoVo细胞在吉非替尼组的细胞增殖率较对照组明显下降(P<0.05),AG1024单独组的增殖率无明显降低,联合用药组与吉非替尼单独组相比较并未进一步降低;HT29细胞在单独应用吉非替尼或AG1024时增殖率均无明显降低,联合用药组的增殖率显著下降(P<0.05);HCT116细胞在吉非替尼作用下增殖率无明显降低,但在AG1024作用下增殖率显著降低(P<0.05),联合用药组与AG1024单独作用组相比较并未进一步降低.结论:结肠癌细胞耐受吉非替尼作用可能或者部分可能与EGFR/IGFR-1β异二聚体形成激活IGFR-1β信号通路有关,抑制IGFR-1β活性在一定程度上可以提高结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性.
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PD-L1-Ig融合蛋白的酵母表达及其对T细胞的抑制作用
目的:利用毕赤酵母表达系统表达PD-L1-Ig融合蛋白,检测该融合蛋白的生物学活性.方法:化学合成hPD-L1-IgG4融合基因,构建携带该基因的酵母表达载体,转化GS115酵母菌株后分泌表达融合蛋白,亲和层析和离子交换层析法纯化,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定.ELISA法检测融合蛋白与受体PD-1的结合能力,混合淋巴细胞反应检测融合蛋白对T细胞功能的抑制能力,~(51)Cr稀释法检测其对CTL杀伤人结肠癌SW480细胞效应的抑制作用.结果:成功构建酵母表达载体pPIC9K-PD-L1-IgG4,转化菌株分泌表达PD-L1-IgG4融合蛋白,相对分子质量为55 000,含量为120 μg/ml.发酵菌株,纯化制备融合蛋白.融合蛋白与受体PD-1具有良好的结合能力,能够显著抑制T细胞增殖、活化(P<0.01),并抑制CTL对结肠癌细胞的杀伤(P<0.01).结论:成功制备了酵母表达PD-L1-IgG4融合蛋白,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为深入研究其在肿瘤免疫应答中的调控效应奠定了良好基础.
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VEGFR-3 siRNA对人结肠癌细胞黏附力和侵袭性的抑制作用
目的:探讨VEGFR-3对人结肠癌细胞黏附力和侵袭性的影响.方法:构建携靶向 VEGFR-3基因siRNA(small interfering RNA)表达载体,转染人结肠癌LoVo细胞, 半定量RT-PCR和Western blotting检测转染前后LoVo细胞VEGFR-3 mRNA和蛋白表达的变化,基质-黏附实验检测细胞转染后的黏附能力,细胞侵袭实验检测转染后肿瘤细胞侵袭性的改变.结果: 携靶向VEGFR-3基因siRNA的表达载体成功构建,RT-PCR检测转染siRNA后LoVo细胞VEGFR-3 mRNA表达水平降低;Western blotting检测转染siRNA后72 h LoVo细胞VEGFR-3蛋白表达下降,其表达相对值由(1.26±0.19)降至(0.39±0.12)(P<0.05).转染siRNA 72 h后LoVo细胞的黏附能力显著下降[(0.626±0.047)vs (0.407±0.029), P＜0.05];LoVo细胞穿膜细胞数(6.38±3.25)明显低于空白对照组(24.82±3.44)、非特异性对照组(23.58±3.73) (P＜0.05).结论:siRNA能够在LoVo细胞中引发RNA干扰效应,下调VEGFR-3基因的表达,进而抑制LoVo细胞的黏附能力和侵袭性.
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吉非替尼耐药人结肠癌细胞系HT-29/ZD的建立及其耐药机制探讨
目的:建立吉非替尼耐药的人结肠癌细胞系HT-29/ZD,并初步探讨其耐药机制.方法:采用逐步增加剂量法诱导人结肠癌细胞HT-29形成耐药细胞HT-29/ZD;MTT法检测吉非替尼对细胞的半数抑制浓度IC50,计算耐药指数(RI);计数法描绘生长曲线,计算倍增时间TD;FCM检测细胞周期;MTT法检测HT-29/ZD对氟尿嘧啶(fluorouracil,5-Fu)、顺铂(cisplatin,DDP)、奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)、伊立替康(irinotecan,CPT-11)的交叉耐药谱;免疫细胞化学方法检测细胞P-gp、IGF-1Ra、P-IGF-1R的表达.结果:建立了吉非替尼耐药的人结肠癌细胞系HT-29/ZD,其耐药指数RI为26.67,HT-29/ZD和HT-29的TD分别为33.25 h和37.7 h.FCM显示HT-29/ZD的S期、G2/M期比例增加,G0/G1期减少.交叉耐药实验显示,HT-29/ZD对5-Fu、DDP、L-OHP敏感性增加,以L-OHP敏感性增加显著;对CPT-11呈现一定程度的耐药.HT-29和HT-29/ZD均有P-gp表达,但无差异,(P＞0.05);HT-29/ZD IGF-1Ra表达明显低于HT-29(P＜0.01),而P-IGF-1R表达则明显增强(P＜0.01).结论:吉非替尼耐药细胞HT-29/ZD不存在与传统化疗药物相似的多药耐药性;磷酸化IGF-1R(P-IGF-1R)活性增强可能是HT-29/ZD的耐药机制之一,P-gp与其耐药性无关.
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pIRApoptinHNIL18对结肠癌细胞HCT-116的抑制效应
目的:探讨联合应用凋亡素(apoptin)基因、新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuramidinase, HN)基因及人白介素18(hIL-18)基因体外对人结肠癌细胞HCT-116的抑制效应.方法:重组质粒pIRApoptinHNIL18通过脂质体介导法体外转染人结肠癌细胞HCT-116,通过Western blotting和RT-PCR检测外源基因表达;采用AO/EB染色法检测pIRApoptinHNIL18对人结肠癌细胞HCT-116抑制作用;利用流式细胞术分析pIRApoptinHNIL18对人结肠癌细胞HCT-116线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,△Ψ)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;采用3,5-二羟基甲苯法测定唾液酸含量.结果:pIRApoptinHNIL18转染人结肠癌细胞HCT-116后,外源基因能够有效表达;肿瘤细胞生长受到抑制;线粒体△Ψ由(94.41±8.17)%下降到(30.70±8.01)%(P＜0.05);唾液酸含量由(0.33±0.06) mmol/L下降到(0.09±0.03) mmol/L(P＜0.01);ROS水平由(52.48±6.09)%升高到(68.98±7.26)%(P＜0.05).结论:pIRApoptinHNIL18可通过线粒体途径诱导细胞凋亡,从而抑制人结肠癌细胞HCT-116的生长.
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丁酸钠诱导HT-29结肠癌细胞凋亡及其对 p53靶基因的调控
目的:分析丁酸钠对HT-29结肠癌细胞p53三个主要靶基因(p21waf1,bax和gadd45)的调控,并探讨其作用机制.方法:HT-29细胞常规培养在含有和不含有丁酸钠的培养液中.分别用MTT和流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞增殖和细胞周期分布,通过形态学观察、亚G1峰的检测和AnnexinV-FITC双标记观察细胞凋亡情况;RT-PCR和Westernblot分别检测丁酸钠对p21wafl,bax和gadd45三种基因mRNA和蛋白表达水平的影响.结果:丁酸钠以剂量和时间依赖的方式抑制HT-29细胞增殖和诱导凋亡,并阻滞细胞于G1期.RT-PCR和Western blot结果显示丁酸钠可以促进p21waf1和bax基因mRNA和蛋白的表达,而对gadd45基因的表达无明显影响.结论:2.5 mmol/L以上浓度的丁酸钠可以抑制HT-29细胞增殖并诱导凋亡,该作用可能通过上调p21waf1和bax基因表达而实现.
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P16基因克隆及其对结肠癌细胞SW480生长的抑制作用
目的 探讨p16基因对结肠癌细胞生长的抑制作用.方法 采用亚克隆技术将p16基因克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,Lipofectamine法将p16基因转染入结肠癌细胞株SW480.采用MTT法检测未转染细胞(SW480组)、转染空质粒细胞(SW480-GFP组)和转染p16细胞(SW480-p16组)培养24、48和72 h后细胞的增殖率；Real-Time PCR和Western blotting分别检测3组细胞的p16、CDK4、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达情况.结果 p16基因克隆人真核表达载体,并成功转染结肠癌细胞后,在基因和蛋白质水平均有外源性p16基因表达,与SW480组比较,相对表达量均有显著增加(P＜0 01).MTT检测结果显示:培养48 h和72 h后,SW480-p16组的细胞相对增殖率均显著低于SW480组和SW480-GFP组(P＜0.01).Real-Time PCR检测结果显示:SW480-p16组的p16 mRNA相对表达量接近SW480-GFP组的2.38倍,接近SW480细胞的2.59倍,差异具有统计学意义(P＜0.01)；SW480-p16组的cyclin D1 mRNA相对表达量明显低于SW480组和SW480-GFP组细胞(P＜0.05),而CDK4mRNA的相对表达量略低于SW480组和SW480-GFP组,差异无统计学意义(P＞0 05).Western blotting检测结果显示:与SW480-GFP组和SW480组比较,SW480-p16组的P16蛋白表达量明显升高；而CDK4和cyclin D1蛋白表达量明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 p16基因转染入结肠癌细胞,具有抑制癌细胞生长的功能.
关键词： p16基因 克隆 结肠癌细胞 D型细胞周期蛋白 周期蛋白依赖性蛋白激酶4 -
华蟾素抑制结肠癌细胞增殖转移的实验研究
目的:观察华蟾素对结肠癌细胞HCTt 16细胞增殖、迁移的影响,探讨其可能的作用机制.方法:常规体外培养结肠癌细胞HCT116细胞系,采用CCK-8法检测不同浓度华蟾素作用不同时间对HCT116细胞增殖的抑制作用,细胞划痕实验和Transwell小室法检测华蟾素对细胞迁移能力的影响,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、钙黏蛋白(E-Cadherin)的表达水平.结果:CCK-8法检测结果表明,华蟾素对HCT116细胞的生长有明显抑制作用,其抑制作用随药物浓度和作用时间的增加而增强(P＜0.05);细胞划痕实验和Transwell小室法结果显示,随华蟾素药物浓度的增加,HCT116细胞迁移能力下降(P＜0.05);Western blot结果表明,华蟾素能够明显抑制HCT116细胞MMP-9的蛋白表达并上调E-Cadherin的蛋白表达(P＜0.01),但对MMP-2蛋白的表达无显著影响(P＞0.05).结论:华蟾素能够抑制人结肠癌细胞的增殖和转移,其机制可能与其抑制MMP-9和上调E-Cadherin的蛋白表达有关.
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扶正抑癌方含药血清对结肠癌lovo细胞侵袭转移能力及TGF-β1与TβRⅡ蛋白表达的影响
目的:观察扶正抑癌方含药血清对结肠癌lovo细胞侵袭转移能力及TGF-β1和TβRⅡ蛋白表达的影响,以探讨扶正抑癌方降低结肠癌转移的机制.方法:lovo细胞体外培养,制备大鼠不同浓度含药血清后,MTT测定不同浓度含药血清对细胞增殖的影响,以5-Fu作为阳性对照药;通过细胞迁移实验检测细胞运动能力,肿瘤细胞体外侵袭实验检测细胞侵袭能力,SABC免疫组化法检测TGF-β1和TβRⅡ的蛋白表达.结果:高浓度含药血清24 h对lovo细胞作用有效,与对照组和空白组相比,扶正抑癌方含药血清能显著降低细胞的运动能力和侵袭能力,免疫组化提示扶正抑癌方含药血清能降低lovo细胞TGF-β1的蛋白表达和提高TβRⅡ的蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.01).结论:扶正抑癌方含药血清能有效抑制lovo细胞的增值和降低其侵袭力和运动能力,初步认为其作用机制与降低lovo细胞TGF-β1的表达和升高βRⅡ的蛋白表达有一定的相关性.
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多西他赛对结肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用
目的探讨多西他赛治疗结肠癌的作用机制.方法采用不同浓度的多西他赛处理结肠癌LoVo细胞后,应用四唑蓝比色试验检测细胞增殖,采用端粒重复扩增-微孔板杂交法检测端粒酶活性,分别用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测细胞凋亡,采用流式细胞仪测细胞周期.结果多西他赛对结肠癌LoVo细胞增殖具有较强的抑制作用.多西他赛能够抑制端粒酶活性,可诱导结肠癌细胞凋亡,均呈浓度和时间依赖性.结论多西他赛抑制结肠癌细胞恶性增殖与抑制端粒酶活性、诱导凋亡及细胞周期阻滞有关.
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羟基喜树碱对结肠癌LoVo细胞凋亡及 bcl-2、p53基因表达的影响
目的探讨羟基喜树碱治疗结肠癌LoVo细胞的作用机制.方法应用四唑盐比色试验、琼脂糖凝胶电泳、DNA末端原位标记染色法研究羟基喜树碱对结肠癌LoVo细胞生长及诱导凋亡的作用,采用WesternBlot法分析羟基喜树碱处理结肠癌细胞前后bcl-2、p53基因的表达情况.结果羟基喜树碱对结肠癌LoVo细胞生长具有较强的抑制作用,可诱导结肠癌细胞凋亡,且其凋亡作用呈浓度及时间依赖性.羟基喜树碱处理结肠癌LoVo细胞后,bcl-2基因表达下降,p53基因表达上升.结论羟基喜树碱可诱导结肠癌细胞凋亡,可能与下调bcl-2基因及升高p53基因表达有关.
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奥沙利铂对结肠癌细胞DNA损伤修复类抗药基因表达的影响
目的 观察奥利沙铂对结肠癌细胞DNA损伤修复类基因表达的影响.方法 采用奥利沙铂处理结肠癌细胞株HCT116 48 h.以Western blot免疫印迹法检测奥利沙铂诱导的DNA损伤.采用CCK-8方法探讨奥利沙铂对HCT116细胞生长的影响.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测奥利沙铂处理后相关DNA损伤修复基因的表达.结果 奥利沙铂处理后,HCT116细胞中DNA损伤标志基因γ-H12AX表达明显上升.DNA损伤切除修复相关基因XPC表达在奥利沙铂处理后出现显著上升,其他DNA损伤修复基因mRNA表达无明显上调.结论 XPC基因可能在临床应用奥沙利铂治疗结肠癌时肿瘤细胞产生抗药性的过程中起到了关键作用.
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人生长激素对人结肠癌细胞LS-174-T增殖周期的影响
目的： 研究人生长激素(hGH)对体外培养的结肠癌细胞株增殖周期和DNA倍体的影响和意义。 方法： 取指数生长期的结肠癌细胞株LS-174-T(简称174)，以顺铂和(或)不同浓度的hGH体外培养，24 h后以流式细胞仪测定细胞增殖周期等指标。 结果： hGH能诱导174细胞S期数率显著上升(P<0.01)，G2/M期参数下调(P<0.01)，DNA指数未见增高。加用顺铂后细胞大量凋亡，细胞存活率显著下降(P<0.01)，各组S期百分数或显著下降，或与对照组无差异。 结论： hGH体外作用于174细胞，能促使细胞进入对化疗药敏感的DNA合成期，没有上调DNA倍体数；顺铂能诱导细胞大量凋亡，并且抑制hGH促进细胞增殖的作用。
关键词： 人生长激素 顺铂 细胞周期动力学/药物作用 结肠癌细胞 培养的 -
人生长激素对人结肠癌细胞LS-174-T增殖周期的影响
研究人生长激素(hGH)对体外培养的结肠癌细胞株增殖周期和DNA倍体的影响和意义.取指数生长期的结肠癌细胞株LS-174-T(简称174),以顺铂和(或)不同浓度的hGH体外培养,24 h后以流式细胞仪测定细胞增殖周期等指标.
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两种非甾体类抗炎药抑制结肠癌细胞增殖的机制
目的:研究选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂尼美舒利与非选择性COX-2抑制剂舒林酸对结肠癌细胞株LOVO生长的影响,探讨其可能的机制.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察两药对结肠癌细胞增殖的抑制,流式细胞仪(FCM)分析其对细胞凋亡及细胞周期的影响,放免法分析其对PGE2的影响.结果:MTT显示尼美舒利、舒林酸均能抑制LOVO细胞的增殖,呈剂量和浓度依赖性.FCM显示两药均能促进细胞的凋亡,并能使G0/G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低,与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05).上清中PGE2表达水平呈剂量依赖性下调.结论:尼美舒利、舒林酸可抑制结肠癌细胞株LOVO的生长,促进其凋亡,其机制可能与其阻止细胞周期的进展,抑制COX-2的活性及PGE2的合成有关.
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NSAIDs对结肠癌细胞生长的抑制作用及对VEGF表达的影响
目的 明确非甾体抗炎药(NSAIDs)对体外培养结肠癌细胞SW1116生长的影响及血管内皮生长因子(VEGF)表达的调控.方法 采用MTT法观察NSAIDs对SW1116细胞生长的影响;电镜下观察尼美舒利诱导细胞凋亡的形态学变化;ELISA法检测细胞上清液中VEGF的含量.结果 NSAIDs能呈剂量和时间依赖性抑制结肠癌SW1116细胞生长;加入尼美舒利后,上清液中VEGF的含量随作用时间的延长逐渐下降,作用72 h后电镜下见凋亡小体.结论 NSAIDs可明显抑制SW1116细胞生长,尼美舒利可诱导其凋亡,下调VEGF的表达,从而抑制结肠癌新生血管的形成.
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Hedgehog信号通路对塞来昔布介导抗结肠癌效应的影响
目的 研究Hedgehog(Hh)信号通路对环氧合酶2抑制剂塞来昔布介导抗结肠癌效应的影响.方法 以胰腺癌PANC-1细胞为对照,采用MTT检测环巴胺20 μmol/L和塞来昔布80 μmol/L处理后的结肠癌HT-29、LoVo和HCT-116细胞存活率,ELISA法检测胞内胶质瘤相关癌基因同源物1 (GLI1)的含量变化.结果 环巴胺、塞来昔布均能抑制PANC-1细胞生长和GLI1的含量(P＜0.05或P＜0.01).环巴胺处理结肠癌细胞后发现,HT-29和LoVo细胞存活率、GLI1含量降低(P＜0.05或P＜o.01);其中,LoVo细胞的抑制作用更为显著,而HCT-116细胞生长、GLI1含量无明显变化(P＞0.05).塞来昔布处理结肠癌细胞后发现,HT-29和HCT-116细胞存活率、GLI1含量降低(P＜0.05或P＜0.01);其中,HCT-116细胞的抑制作用更为显著,而LoVo细胞生长、GLI1含量无明显变化(P＞0.05).结论 Hh信号在LoVo和HT-29细胞是有活性的,而且该信号对LoVo细胞恶性行为维持是必须的.塞来昔布抗结肠癌细胞的作用是有选择性的,可能是通过SMO非依赖的途径来发挥抗癌作用.
关键词： 结肠癌细胞 Hedgehog信号 塞来昔布 胶质瘤相关癌基因同源物1 -
与结肠癌细胞侵袭相关的培养基筛选
目的 筛选出结肠癌细胞侵袭相关研究的佳培养基.方法 在RPMI 1640、DMEM、DMEM-F12培养基中对人结直肠癌细胞株HCT-116、LOVO、CACO-2进行常规培养,采用集落形成实验检测肿瘤细胞增殖能力,免疫荧光检测上皮型钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、Nm23-H1、p53蛋白表达,RT-PCR检测Nm23-H1、p53、蜗牛基因(snail-1) mRNA表达.结果 与RPMI1640、DMEM培养组相比,DMEM-F12培养组三种人结直肠癌细胞克隆集落形成率、vimentin、p53蛋白、snail-1和p53 mRNA表达均明显增加(P＜0.05),而E-cadherin、Nm23-H1蛋白表达和Nm23-H1mRNA表达降低(P＜0.05)；RPMI 1640培养组与DMEM培养组间各观察指标差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 DMEM-F12培养基相对DMEM、RPMI 1640培养基更适用于结肠癌细胞侵袭性能相关的基础实验研究.
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亚硒酸钠介导人结肠癌HCT116细胞死亡的机制研究
目的:探讨亚硒酸钠杀伤结肠癌HCT116细胞的潜在机制.方法:应用MTS方法和DCFH-DA法分别检测亚硒酸钠对人结肠癌细胞系HCT116存活率和细胞内活性氧水平的影响,同时应用小分子干扰RNA片段研究JNK1和p53在亚硒酸钠介导的细胞死亡过程中的作用.结果:亚硒酸钠可显著提高HCT116细胞内的活性氧水平,使细胞发生氧化应激,激活应激相关蛋白JNK1和p53,从而达到杀伤肿瘤细胞的作用.结论:亚硒酸钠能有效杀伤结肠癌肿瘤细胞,同时JNK1和p53在亚硒酸钠介导的细胞死亡过程中发挥了重要作用.
