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非甾体消炎药对结肠癌细胞HT-29中瘦素作用的初步研究
非甾体消炎药(NSAIDs)是一类以抗炎为主,兼有解热、镇痛作用的药物.近20年来,动物实验、临床研究、个案报道和流行病学资料均显示NSAIDs药物对腺瘤性息肉有治疗作用,并可以预防结肠癌的发生,但其机制尚未完全阐明.目前研究发现瘦素(Leptin)作为一种具有促生长作用的激素,在许多恶性肿瘤中都存在表达,推测其在刺激恶性肿瘤细胞的增殖、调节肿瘤血管的生成及肿瘤侵袭、转移等方面起重要作用.本实验则旨在观察NSAIDs药物对HT-29结肠癌细胞中瘦素的作用,在理论上初步阐明其抗结肠肿瘤的可能机制.
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白藜芦醇通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制结肠癌细胞生长的研究
目地 探讨白藜芦醇抗肿瘤活性的作用机制.方法 本研究使用白藜芦醇处理体外培养结肠癌细胞系HCT116后,通过细胞生长实验和MTT增殖实验来探讨其对HCT116细胞生长、增殖的影响;通过免疫印迹实验检测β-catenin的表达水平和Wnt信号通路靶基因c-Myc和cyclinD1的表达,检测白藜芦醇对Wnt信号通路活化的影响.结果 白藜芦醇能显著抑制HCT116的生长增殖,降低β-catenin的表达水平,抑制Wnt信号通路靶基因c-Myc和cyclinDJ的表达.结论 白藜芦醇通过抑制Wnt信号通路从而抑制肿瘤生长,本研究为白藜芦醇抗肿瘤机制提供了新的思路和方向.
关键词： 白藜芦醇 结肠癌细胞 Wnt/β-catenin信号通路 -
Gab2对结肠癌细胞MMP合成的影响
目的:探讨Gab2对结肠癌细胞MMP合成的影响.方法:临床选择2015年7月~2016年4月本院收治的接受手术的结肠癌病人的临床病理资料及组织标本,应用Western blot法检测接头蛋白Gab2水平,分析接头蛋白Gab2对结肠癌细胞侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9合成的影响.结果:结肠癌接头蛋白Gab2的阳性表达与病人的性别、年龄等临床指标无相关性,而与结肠癌的是否发生远处转移、肿瘤直径大小等临床指标密切相关,差异有统计学意义;接头蛋白Gab2阳性组的MMP-9、MMP-2指标水平显著高于Gab2阴性组,差异有统计学意义.结论:接头蛋白Gab2可通过影响结肠癌细胞MMP-9、MMP-2的表达进而影响结肠癌细胞的转移侵袭.
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鞘氨醇激酶-1调控ERK和NF- κB通路促进HT-29细胞的增殖和侵袭
目的 探讨鞘氨醇激酶-1(Sphk1)对结肠癌HT-29细胞的增殖、凋亡和侵袭转移的影响及其作用机制.方法 采用(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)诱导人结肠癌HT-29细胞Sphk1的活化和表达,N,N-二甲基鞘氨醇(DMS)抑制Sphk1的活化和表达;采用MTT法测定细胞的增殖,流式细胞术分析细胞的凋亡,γ-32P-ATP掺入法检测Sphk1的活性,Western杂交检测蛋白的表达,Transwell小室模型观察细胞迁移和侵袭能力的变化,ELISA法检测细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMp-9和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)的分泌.结果 PMA和DMS能分别有效地诱导和抑制HT-29细胞Sphk1活性和蛋白的表达;同时,PMA能促进细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞的凋亡;DMS则抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞的凋亡.诱导Sphk1的活化以及表达可促进细胞ERK、p-ERK和NF-kBp65的蛋白表达以及MMP-2、MMp-9和uPA的分泌,而抑制Sphk1则抑制ERK、p-ERK和NF-kBp65的蛋白表达以及MMP-2、MMP-9和uPA的分泌.结论 Sphk1可能是通过激活ERK和NF-k B通路,上调MMP-2、MMP-9和uPA的分泌,从而促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞的凋亡.
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二氧化碳处理对人结肠癌CCL-228细胞E钙粘蛋白和血管内皮生长因子表达影响的时间效应关系
目的探讨二氧化碳气体对结肠肿瘤细胞转移能力的影响.方法体外培养人结肠癌CCL-228细胞,应用二氧化碳或氮气处理不同时间后,应用免疫组织化学方法检测细胞中E钙粘蛋白(E-Cadherin)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化.结果二氧化碳处理60min后CCL-228细胞E-Cadherin表达显著降低,而VEGF表达显著增加.而氮气处理对上述指标产生相同影响但其作用明显弱于二氧化碳.结论60min以上时间的二氧化碳气腹可以明显增强肿瘤细胞的转移能力,而氮气对其影响明显弱于二氧化碳,序贯应用二氧化碳、氮气、二氧化碳气腹的方法可改善二氧化碳气腹所致的影响.
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10-去乙酰基紫杉醇配伍紫杉醇对两种肿瘤细胞 生长抑制的作用
目的:观察紫杉醇配伍紫杉烷类成分10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)对A549、LS174T肿瘤细胞株的体外抑制作用.方法:采用A549、LS174T肿瘤细胞株进行MTT细胞毒性实验,观察10-DAT单独给药、10-DAT配伍紫杉醇对两种肿瘤细胞的生长抑制作用.结果:10-DAT单独使用时对LS174T细胞有一定的生长抑制作用,对A549则无抑制生长作用;但配伍紫杉醇反而会拮抗紫杉醇对A549和LS174T细胞的毒性作用.结论:10-DAT单独使用对LS174T细胞具有生长抑制作用,在高浓度下会拮抗紫杉醇对LS174T和A549细胞的细胞毒性,其原因可能源自两个化合物对微管蛋白的竞争性结合,确切机制有待进一步深入研究.
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苦参碱对结肠癌SW1116细胞增殖及端粒酶活性的影响
目的:探讨苦参碱(Matrine,Ma) 对人结肠癌SW1116细胞增殖和端粒酶活性的影响.方法:采用MTT法检测细胞增殖抑制率, TRAP-ELISA测端粒酶活性,半定量RT-PCR法检测hTERT mRNA表达.结果:Ma对SW1116细胞具有显著抑制增殖作用,并呈现较明显的剂量及时间依赖性;与正常对照组相比,端粒酶活性显著下降(P＜0.05或P＜0.01),hTERT mRNA表达明显减少(P＜0.05或P＜0.01).结论:Ma能通过下调hTERT表达而有效地抑制SW1116细胞端粒酶活性,从而抑制其增殖.
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麝香保心丸对体外培养的人结肠癌细胞LoVo增殖和原血管生成因子表达的影响
目的:探讨麝香保心丸对体外培养的肿瘤细胞增殖以及原血管生成因子表达的影响. 方法:在体外用麝香保心丸含药血清处理LoVo细胞,MTT比色实验法检测对肿瘤细胞生长的作用,流式细胞仪检测麝香保心丸对LoVo细胞周期及凋亡指数的影响;RT-PCR观察麝香保心丸对LoVo细胞VEGFmRNA和bFGFmRNA表达的影响.
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复方木鸡颗粒对不同p53基因型的人结肠癌细胞的抑制作用
目的：结肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，开发新的抗结肠癌药是提高结肠癌治疗效果的关键之一。中药在抗肿瘤方面的作用是目前国家中药开发的重要课题之一，复方木鸡颗粒（简称木鸡）由云芝、山豆根、菟丝子、核桃楸皮等组成，具有扶正清热解毒功效，能抑制甲胎蛋白升高和调节免疫功能，已用于临床治疗原发性肝癌、肝硬化、肝炎等肝脏疾病。但在抗结肠癌的研究方面较少。本研究观察木鸡对不同p53基因型的人结肠癌细胞（HCT116p53wt、SW620p53mt和SW480p53mt）的抑制作用，初步探讨木鸡的抑瘤机制。方法：MTT法检测木鸡对细胞的生长抑制作用，光镜观察细胞形态，DAPI染色观察细胞凋亡情况。结果：木鸡对不同p53基因型的人结肠癌细胞有明显的生长抑制作用，5％的浓度抑制率可达92．7％。光镜下可见木鸡处理的结肠癌细胞变圆、浮起，细胞边缘呈发泡状，DAPI染色显示木鸡处理的细胞染色质浓缩，核边集，提示凋亡样改变，且p53野生型的人结肠癌细胞变化更明显。结论：木鸡对人结肠癌细胞有明显的抑生长作用，这种作用在p53野生型的人结肠癌细胞上更显著，提示木鸡的抑瘤作用机制与p53抑癌基因可能存在一定联系。
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银杏叶提取物EGb761诱导人结肠癌细胞凋亡的分子机制
目的：探究银杏叶提取物EGb761对人结肠癌细胞的增殖抑制、诱导凋亡及其作用机制。方法：体外培养12株人结肠癌细胞，给予不同浓度EGb761（0～600 mg／L）作用24 h，采用MTT、集落生成实验以及流式细胞术检测给药处理后结肠癌细胞的增殖和凋亡情况。通过Western blot技术检测RIP－1分子表达水平和凋亡标志物PARP的表达水平变化。利用ELISA技术检测NF－κB信号通路的活性。结果：EGb761在较低浓度（400 mg／L）可以抑制结肠癌细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞发生凋亡。随着药物浓度的增加，EGb761诱导结直肠癌细胞凋亡率也随之增加。 EGb761作用于结肠癌细胞后可导致凋亡相关蛋白RIP－1的降解。同时 EGb761通过抑制 I－κB 磷酸化而抑制 NF－κB 信号通路促细胞增殖的作用。结论：银杏叶提取物（ EGb761）能广泛抑制人结肠癌细胞的增殖，并诱导人结肠癌细胞发生凋亡，研究结果提示凋亡发生的机制与细胞内RIP－1的降解以及NF－κB信号通路的活性降低有关。
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γ-synuclein基因真核表达载体的构建及其对结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能的影响
目的 构建针对γ-synuclein基因的真核表达载体并观察其对结肠癌细胞SW1116体外侵袭及与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)黏附能力的影响.方法 从结肠癌细胞系HT29提取总RNA,经RT-PCR获得γ-synuclein cDNA全长片段,经过酶切连接等反应定向克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1上,以脂质体转染的方法将重组质粒转染至结肠癌细胞系SW1116,经G418筛选出稳定转染的细胞株.采用Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力.将细胞接种于铺有HUVEC的96孔板中,酶标仪读取荧光强度来表示黏附细胞的相对数.结果 成功构建pEGFP-γ-synuclein真核表达载体,经过筛选后可在SW1116细胞中稳定表达,且能在体外翻译出GFP-γ-synuclein融合蛋白质.转染γ-synuclein后,穿过Matrigel胶及Transwell小室膜的细胞数明显增加(198.4±20.7比98.8±13.2,P＜0.05),与HUVEC黏附的细胞数(荧光强度)亦显著增加(3.08±0.36比1.22±0.21,P＜0.05).结论 γ-synuclein可显著增强结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能.
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结肠癌细胞通过Fas/FasL诱导淋巴细胞发生凋亡
背景与目的:研究发现,肿瘤组织中Fas配体阳性表达区肿瘤浸润淋巴细胞的凋亡率比FasL阴性区高,推测肿瘤细胞可通过增加表达FasL来杀伤肿瘤浸润淋巴细胞.本研究拟在体外验证结肠癌细胞SW480是否可以诱导淋巴细胞发生凋亡.方法:结肠癌细胞系SW480(效应细胞)与对Fas介导凋亡敏感的Jurkat细胞(靶细胞)共培养,分为3种效靶比20∶1,10∶1,5∶1.生长曲线法、流式细胞术、荧光显微镜观察分别检测Jurkat细胞的凋亡情况.结果:流式细胞仪检测结果显示,SW480接种浓度为0(对照)、0.5×105/ml、1×105/ml、2×105/ml时,Jurkat细胞凋亡率为(1.8±0.21)%、(5.49±0.17)%、(11.18±0.14)%、(18.22±0.11)%.荧光显微镜观察结果表明,SW480接种浓度为0(对照)、0.5×105/ml、1×105/ml、2×105/ml时,Jurkat细胞凋亡率为(1.58±0.12)%、(5.22±0.13)%、(9.74±0.21)%、(19.33±0.18)%.3种效靶比条件下,SW480细胞均能诱导Jurkat细胞发生凋亡.随着SW480接种浓度的升高及共培养作用时间的延长,Jurkat细胞凋亡率逐渐增加.每个实验组与对照组相比,P值均小于0.01.结论:结肠癌细胞SW480可以通过Fas系统诱导淋巴细胞发生凋亡,这为结肠癌的免疫逃逸、反击机制提供了又一证据.
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Hsa-miR-186在结肠癌细胞中的表达及作用
目的 检测hsa-miR-186在结肠癌组织及细胞中的表达,探讨hsa-mir-186对结肠癌细胞生物学特性的影响及作用.方法 应用实时荧光定量PCR检测了miR-186在12对配对的结肠癌组织、癌旁组织和5株结肠癌细胞中的表达情况；扩增包含miR-186前体序列在内的基因片段,并将其克隆至PLVTHM载体,将PLVTHM-miR186质粒转染SW620细胞,流式分选慢病毒感染的SW620细胞；CCK-8法、划痕实验和Transwell检测细胞检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力.Western Blot检测靶基因YY1蛋白水平的表达.结果 与癌组织相比,12例癌组织中miR-186的平均表达量为0.0024±0.0027,显著低于癌旁组织的0.066±0.068,P=0.008;miR-186在高转移潜能的人结肠癌细胞SW620和LOVO相对表达量分别为0.118±0.138和0.157±0.001,与在低转移潜能HT-29细胞中表达量1.000±0.00,差异具有统计学意义P＜0.05;质粒双酶切及测序鉴定PLVTHM-hsa-miR186重组质粒构建成功；荧光定量PCR表明稳定过表达miR-186的结肠癌细胞株SW620构建成功,且过表达miR-186后降低了细胞的增殖、迁移及侵袭能力,差异均具有统计学意义P＜0.05.稳定过表达miR-186的细胞中,miR-186的表达明显高于对照组和未处理组,YY1蛋白质水平有所下降.结论 hsa-miR-186在结肠癌组织以及在高转移潜能的人结肠癌细胞SW620、LOVO中低表达,具有类似抑癌基因的作用；成功构建PLVTHM-miR186慢病毒重组质粒,并稳定转染结肠癌细胞SW620,抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭能力.miR-186调控YY1表达可能是抑制结直肠癌生物特性的重要机制之一.
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Akt shRNA载体的构建及其对结肠癌细胞株Lovo Akt基因表达的抑制作用
目的 构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,通过RNAi下调Akt基因在结肠癌Lovo细胞系中的表达,观察对结肠癌细胞生长的影响.方法 将靶向人Akt基因的两条shRNA(Akt1-U6-1#;Aktl-U6-2#)表达序列克隆到入门载体pENTRTM/U6的黏性末端,测序鉴定后与目的表达载体Plentio/Block-iT DEST Vector进行LR位点特异性重组；分别将入门载体与目的表达载体转染入Lovo细胞,对细胞株行RT-PCR和Western blotting检测,观察siRNA对靶基因Akt的抑制效果.结果 DNA测序证实pENTRTM/U6-TF-shRNA入门载体和Plentio/Block-iT DEST目的表达载体为阳性克隆,转染Lovo细胞后,Akt基因在mRNA和蛋白水平的表达量受到明显抑制.结论 成功构建了靶向人Akt的shRNA表达载体,且该载体在体外能有效抑制Lovo细胞Akt基因表达,为进一步研究Akt的功能和肿瘤的基因治疗奠定了实验基础.
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白介素-6在人结肠癌LoVo细胞奥沙利铂耐药中的作用
目的 探讨白介素-6(IL-6)在人结肠癌细胞株奥沙利铂(L-OHP)耐药中的作用.方法 通过L-OHP诱导建立人结肠癌L-OHP耐药细胞株LoVo/L-OHP,分别用MTT法、免疫荧光及蛋白印迹检测细胞生长、IL-6表达.L-OHP联合IL-6或IL-6R抗体作用后,MTT法和克隆形成实验检测细胞增殖.结果 与LoVo细胞相比,LoVo/L-OHP细胞的耐药指数为10.4,IL-6表达上调.阻断IL-6可增强L-OHP对耐药细胞的杀伤作用,但阻断IL-6R后耐药细胞对L-OHP敏感性无明显改变.结论 IL-6过表达与LoVo细胞L-OHP耐药相关,阻断IL-6而非IL-6R可增强耐药细胞对L-OHP敏感性.
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三裂鼠尾草素对人γδT 细胞杀伤结肠癌SW －620细胞的影响
目的：探讨三裂鼠尾草素对人γδT细胞杀伤结肠癌SW－620细胞的影响。方法分离健康人外周血单个核细胞，异戊烯焦磷酸法体外扩增γδT细胞，不同浓度三裂鼠尾草素诱导人γδT细胞72 h，CCK8法检测γδT细胞增殖率，乳酸脱氢酶释放法检测诱导后γδT细胞对SW－620细胞的杀伤活性，流式细胞术检测诱导后γδT细胞穿孔素（ PFP）、颗粒酶B（ GraB）、CD107a的表达，Western blot检测诱导后γδT细胞p－ERK1／2的表达情况。结果经培养10 d，γδT细胞比例由4.32％增加至83.63％。三裂鼠尾草素浓度为0.0477～195 pmol／L时γδT细胞增殖率显著升高（P＜0.05），浓度为0.191～195 pmol／L时γδT细胞对SW－620细胞的杀伤活性显著增加（P＜0.05）。经三裂鼠尾草素诱导72 h，γδT细胞PFP、GraB、CD107a的表达显著升高（P＜0.05）。三裂鼠尾草素浓度为0.763～195 pmol／L时γδT细胞p－ERK1／2的表达显著增加（ P＜0.05）。结论在一定浓度范围内三裂鼠尾草素能够促进人γδT细胞增殖，增强其对结肠癌细胞SW－620的杀伤活性，其机制可能与 PFP、GraB的表达上调和p－ERK1／2信号通路活化有关。
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Sphk1对SW480和HT-29体外血管生成拟态的影响
目的:观察Sphk1对人结肠癌细胞体外生成VM的影响,并探讨其作用机制.方法:用100 nmol/LPMA处理HT-29、SW480作为2组激活组,用50 μmol/L DMS处理SW480作为抑制组;在抑制组内分别加入rhMMP2、rhMMP9作为2组试验组.采用Matrigel三维培养法观察VM形成；MTT检测细胞生长增殖；Transwell观察细胞迁移;RT-PCR检测mRNA表达；Western blot、Elisa检测蛋白表达及分泌.结果:PMA上调Sphk1表达,促进VM表达阴性的HT-29体外形成VM,增强SW480增殖迁移能力,上调MMP2、MMP9的基因与蛋白表达分泌.DMS抑制Sphk1表达,减少SW480体外形成VM,加入rhMMP2、rhMMP9后再次形成VM,减弱SW480增殖迁移能力,下调MMP2、MMP9的基因与蛋白表达分泌.结论:Sphk1可促进结肠癌细胞形成VM,其机制可能通过增强结肠癌细胞的侵袭力并增加MMP2、MMP9的表达与分泌而发挥作用.
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hTERT启动子驱动TRAIL基因表达载体对结肠癌HT-29细胞的抑制作用研究
目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因表达载体,探讨其对结肠癌细胞HT-29增殖的抑制作用.方法 构建重组质粒pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL,通过脂质体转染结肠癌HT-29细胞,采用MTT法检测重组质粒对细胞增殖的影响及流式细胞术检测细胞凋亡的变化.结果 pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL组细胞增殖率低于空白对照组和空质粒转染组;流式细胞术检测转染后细胞凋亡率升高,并且pshuttle-hTERT-TRAIL凋亡率高于pshuttle-TRAIL组.结论 hTERT启动子调控的TRAIL可明显抑制结肠癌细胞增殖以及诱导细胞凋亡,可能是结肠癌靶向治疗的新途径.
关键词： 人端粒酶逆转录酶 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 结肠癌细胞 凋亡 -
不同压力下CO2气腹处理对结肠癌HT-29细胞增殖及侵袭能力的影响
目的 观察不同压力CO2气腹处理对结肠癌HT-29细胞体内外增殖与侵袭能力的影响.方法 以HT-29细胞暴露于5 mmHg、10 mmHg及15 mmHg CO2压力下1h建立体外模拟气腹模型为三个实验组,另以常规培养HT-29细胞为对照组.处理1h后,立即取各组细胞培养液检测pH值.常规培养24 h后将各组细胞接种裸鼠腹腔建立体内模型(每组对应6只裸鼠),同时体外以四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolim,MTT)检测各组细胞粘附率,免疫细胞化学法检测E-钙粘蛋白的表达.继续常规培养5d,绘制细胞生长曲线.3w后开腹检查裸鼠腹腔肿瘤种植转移情况并测量肿瘤平均质量,以免疫组化法检测肿瘤组织中E-钙粘蛋白的表达.结果 气腹处理1h后,实验组细胞培养液即时pH值显著低于对照组(均P＜0.05).10 mmHg组和15mmHg组与对照组相比,细胞粘附率下降、裸鼠腹腔内肿瘤平均质量减小、E-钙粘蛋白表达水平降低(均P＜0.05),5 mmHg组上述指标与对照组比较,差异均无统计学意义(均P＞ 0.05).各实验组细胞增殖速度随气腹处理压力的升高呈下降趋势.结论 模拟10 mmHg及15 mmHg CO2气腹处理,可降低结肠癌HT-29细胞的体内外的增殖能力,不增加在腹腔的侵袭能力.5 mmHgCO2气腹处理对HT-29细胞没有显著影响.
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模拟CO2气腹对结肠癌HT-29细胞增殖侵袭能力的影响
目的 观察不同CO2气腹压力对裸鼠腹腔恶性肿瘤细胞生长和种植转移的影响.方法 术前2h将5×105个结肠癌HT-29细胞注入裸鼠腹腔内.模拟不同CO2气腹压力的腹腔镜手术环境,持续1h.将60只裸鼠随机分为4组,每组15只,分别为0 mmHg组、5 mmHg组、10 mmHg组和15 mmHg组,每组CO2作用3小时.30 d开腹检查肿瘤种植转移情况,并测量腹腔种植的肿瘤平均质量,了解不同CO2气腹压力对肿瘤生长和种植转移的影响.结果 4腹腔肿瘤平均质量分别为(566.8±50.4) mg、(616.3±61.2) mg、(777.5±70.5)mg、(960.2±56.7) mg.随气腹压力升高,腹腔内种植的肿瘤质量增加,腹腔内肿瘤种植部位增多,15 mmHg气腹组腹腔内种植的肿瘤质量及肿瘤种植部位均大于其他组(P＜0.01).结论 CO2气腹压强的增高,会增加结肠癌细胞的侵袭和种植的风险,在临床上应引起重视.
