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Caveolin-1在大鼠肝脏不同发育阶段的表达及意义
胞膜窖(Caveolae)是一种细瓶颈状的细胞膜内陷结构,由Palade等(1953)首次发现,后来由Yamada命名.Caveolin-1是相对分子质量为21 000～24 000的整合膜蛋白,是胞膜窖的主要结构成分.至今已克隆到caveolin基因家族中的3个成员:CAV1、CAV2和CAV3.因组织分布和序列结构的不同,又可产生5种mRNA和6种基因产物,分别命名为窖蛋白1α、1β、2α、2β、2γ和3[2].
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土拨鼠肝炎病毒可复制性克隆的构建和鉴定
HBV慢性感染迄今仍缺乏特效的治疗措施,其中主要原因之一是缺乏完善的体内和体外复制系统.土拨鼠肝炎病毒(WHV) 发现于1978年[2],与HBV同属于正嗜肝病毒.研究发现,WHV在形态学、基因组结构、基因产物、复制过程、流行病学、感染过程及致病、致癌等方面都与HBV非常相似.目前,土拨鼠-WHV模型是人类HBV感染较理想的动物模型,已经用于疫苗开发、治疗性疫苗和抗病毒药物的研究,以及病毒生活周期、致病致癌分子机制的研究 [3].
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HLA-Ⅱ类基因多态性与肝脏疾病相关性研究进展
肝组织的免疫损伤是大部分肝脏疾病共同的发病机制.病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎等疾病的发展转归均与免疫功能密切相关.人类主要组织相容性复合体( Major histocompatibility complex,MHC)决定着机体的免疫特性,其基因位于人类6号染色体的短臂(6p21.3),全长约3 600 kb,是多态性为复杂的基因群.人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)为MHC的基因产物.目前MHC基因区内已发现239个基因位点,可表达基因达130个,其中39.8％的基因与免疫系统有关,而Ⅱ类区域中几乎所有的基因均与免疫功能相关[1].
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正确认识HBeAg的临床意义,建议废弃"大三阳"、"小三阳"不科学的名称
HBeAg(e抗原)是乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白基因组的前C区和C区段的基因产物,在细胞蛋白酶作用下,形成HBeAg分泌至血液中.所以一般认为HBeAg可反映HBV的复制.慢性乙型肝炎的自然史一般可分为:免疫耐受期、免疫清除期和非活动或低(非)复制期3个阶段.在慢性乙型肝炎的自然病程中,血清中HBeAg水平往往与HBV DNA载量相关.
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新疆地区人类免疫缺陷病毒-1感染者CRF07_BC流行毒株gag基因遗传特性
目的 分析新疆地区HIV-1感染者中流行的单一亚型CRF07_BC毒株的gag基因遗传特性.方法 对35例CRF07_BC亚型的HIV-1感染者分别于2011年9月(T1时间点)、2012年5月(T2时间点)、2013年2月(T3时间点)和2013年10月(T4时间点)4个时间点采集全血标本.为排除不同程度免疫功能对HIV-1基因变异的影响,使用流式细胞仪进行CD4+T淋巴细胞计数,并按照CD4+T淋巴细胞＜200/μL(重度免疫抑制)、200～500/μL(中度免疫抑制)和＞500/μL(无免疫抑制)分为不同免疫功能的3组.抽提标本RNA,套式PCR扩增gag基因片段,终将3组研究对象得到的4次序列进行基因离散率和进化树分析,并使用BEAST软件估算该地区CRF07_BC流行毒株的近共.同祖先株形成时间和平均进化速率.为排除HARRT对HIV-1基因变异影响,对HARRT组和非HARRT组进行基因离散率分析.结果 3组不同免疫功能的研究对象均呈现出在T1、T2、T3、T4时间点的组内和组间基因离散率依次升高的趋势.HARRT组和非HARRT组也均呈现出在T1、T2、T3、T4时间点的组内和组间基因离散率依次升高的趋势.进化树分析显示,同一样本的几次序列在进化树上聚集成一簇,大部分毒株均在T4时间点上独立分出一支;其近共同祖先株形成时间为10.9年[95％高后验密度(HPD):2.0～22.2年],平均进化速率为1.34×101替换·位点1·年-1(95％HPD:5.16×10-4～2.23×10-3替换·位点-1·年1).结论 新疆地区HIV-1感染者CRF07_BC亚型毒株会随着在一个地区流行时间的延长,加大该地区同一亚型内的基因离散率;CRF07_BC单一亚型内病毒株的gag基因进化速率相对文献报道的略慢.
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人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析
目的 构建HIV-1 HXB2株Tat基因半胱氨酸富集区3'末端移位突变体,经原核表达和纯化,分析该突变体蛋白(Tat-cct)的免疫原性.方法 用PCR方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸)移位至Tat基因的3'末端,获得其突变体DNA序列,并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,转入大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化.以Tat-cct融合表达蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法对该抗血清进行免疫原性检测分析.结果 pET32a-Tat-cct重组质粒可在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,纯化后其融合蛋白相对分子质量约为31 000.Tat-cct重组蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白(1～101位氨基酸)均呈特异性结合反应.结论 Tat突变体重组蛋白Tat-cct能在大肠埃希菌中有效表达.并较好保留其免疫原性,为HIV-1 Tat疫苗的基础研究提供了有价值的实验结论.
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人类免疫缺陷病毒-1 Vif蛋白的表达及生物学功能
目的 分析上海HIV-1分离株病毒感染因子(Vif)蛋白编码基因突变特点,构建HIV-1vif基因原核表达质粒,并了解其免疫原性.方法 采用RT-PCR法扩增23例上海HIV-1分离株vif基因并测序,与HIV-1国际标准毒株比较;将vif编码基因克隆入原核表达载体pET32b(+),构建pET32b(+)-HIV-1/Vif重组质粒;将该质粒转化入细胞BL21D3(Star)表达,并纯化HIV-1 Vif蛋白,制备Vif蛋白鼠多克隆抗体,并以ELISA检测Vif蛋白及其鼠多克隆抗体的免疫原性.统计学处理采用t检验.结果 上海HIV-1分离株vif基因与国际标准毒株相比较,核苷酸突变率为(0.179±0.006)%,并具有多处相似的变异位点,上海HIV-1分离株Vif蛋白第151～240位氨基酸相对保守;成功构建HIV-1 vif基因原核表达质粒pET32b(+)-HIV-1/Vif,表达并纯化Vif蛋白,制备了Vif多克隆抗体;重组HIV-1 Vif蛋白与HIV感染者及健康人血清反应比较,差异无统计学意义(P＞0.05);鼠多克隆抗体与重组Vif蛋白反应与健康对照组血清比较差异有统计学意义(t=178.61,P<0.01).结论 上海HIV-1分离株vif基因与HIV-1国际标准毒株比较存在较高突变,成功地构建了HIV-1 vif基因原核表达载体pET32b(+)-HIV-1/Vif,制备了Vif多克隆抗体.
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人类免疫缺陷病毒Tat融合蛋白后的修饰与生物学活性分析
目的 分析HIVTat融合后对融合蛋白生物学活性的影响,探讨HIV Tat的生物细胞膜穿透功能和意义.方法 以胸腺激酶(TK)基因为报告基因,将不同长度的甘氨酸(Gly)密码子融合在HIV Tat与TK基因之间以及两种基因倒置融合,分别克隆至PBK原核表达载体,大肠埃希菌表达,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,超声波破碎后,经耦联Tat蛋白单克隆抗体的层析柱层析收集.融合蛋白与HepG2细胞共培养,24 h后间接免疫荧光检测.加用更昔洛韦,3 d后锥虫蓝染色计算细胞死亡率,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.结果 克隆出含有不同甘氨酸密码子的HIV Tat-Gly(n)TK(n=0,2,4,6)融合基因,成功表达Tat-TK系列融合蛋白和TK-Tat融合蛋白.间接免疫荧光检测发现Tat-TK系列融合蛋白与Tat蛋白、TK-Tat融合蛋白透过膜效率相似;但流式细胞仪检测表明,在培养基含有更昔洛韦的条件下,Tat-Gly(4)-TK、Tat-Gly(6)-TK、Tat-Gly(2)-TK、Tat-TK融合蛋白、HIV Tat组和TK-Tat致HepG2细胞凋亡率分别为14.77%、4.30%、12.69%、3.00%、1.03%和4.40%.锥虫蓝染色发现细胞死亡率也有类似结果,分别为80.2%、56.7%、65.4%、58.4%、9.1%和57.1%,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05),但TK-Tat和Tat-TK融合蛋白组之间差异无统计学意义(P=0.24).结论 Tat与TK基因之间融合甘氨酸密码子的数目对融合蛋白中Tat的细胞融合穿透功能不产生影响,而对TK的体外细胞致死作用有较大影响,其中间隔4个甘氨酸密码子对融合蛋白TK体外细胞致死作用的影响小,同时TK基因与HIV Tat的倒置融合不影响两者生物学功能.
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碘染色联合P53、生存素及端粒酶检测对早期食管癌的诊断
食管癌是我国常见和高发的恶性肿瘤之一,早期发现、早期诊断和早期治疗是降低食管癌死亡率的关键.内镜与活组织检查是发现和诊断早期食管癌的首选方法,但活检存在一定局限性,而内镜下黏膜染色不仅可以确切获得病变形态学的判断,且有利于正确选择活检部位[1].有文献报道,食管癌的发生和发展与一些癌基因产物的表达有关[2,3].本文探讨内镜下碘染色联合组织P53、生存素及端粒酶检测对早期食管癌及癌前病变的诊断价值.
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乙型肝炎病毒感染与人类白细胞抗原-DRB1等位基因的相关性研究
不同个体感染乙型肝炎病毒(HBV)后会出现不同的疾病过程,普遍认为这与HBV本身无关,而与个体的免疫反应状况有关,而后者主要取决于人类主要组织相容性复合体(MHC).人类白细胞抗原(HLA)是MHC的基因产物,其中HLA-DRB1多态性为复杂,在机体免疫应答和免疫调节过程中发挥重要作用.我们利用聚合酶链反应/序列特异性引物(PCR/SSP)技术进行HLA-DRB1基因多态性分析,从基因水平探讨免疫、遗传因素在乙型肝炎发生机制中的作用.
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胃癌细胞内在耐药性与MDR1基因表达产物P-gp相关性研究
本研究旨在探讨胃癌新鲜组织对化疗药物内在耐药性(intrinsic drug resistance,IDR)的产生与MDR1基因产物P-gp表达的相关性,以及探讨P-gp对临床选用化疗药物的参考价值.
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贲门癌与P53、P21、NDPK、CD44的相关性及临床意义
肿瘤浸润和转移与基因表达有较大的联系,单基因与肿瘤的浸润和转移的关系已有较多的文献报道,但肿瘤浸润和转移并非是单基因的问题.我们采用LSAB免疫组化法对60例贲门癌患者进行P53,Ki-ras,nm23-H1和CD44s其基因产物 P53,P21-ras,NDPK,CD44s蛋白检测,旨在明确这4种基因在肿瘤分化、浸润及转移和预后上的关系.
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生物信息学(5):药物设计与生物信息学
生物信息学、基因组学、蛋白质组学与药物设计基因药物是直接以DNA或RNA为靶标的药物或以DNA或RNA自身作为药物.1993年美国政府以立法的形式准许开展基因治疗,基因药物的研究将是未来新药研究的热点.目前已有3类基因药物用于临床试验:①"反义"寡核苷酸:可抑制基因的转录或阻止mRNA翻译产生蛋白质;②肽核酸:可与基因的启动因子结合从而调节基因转录;③多氨基化合物:可阻断基因产物的生成.DNA疫苗是以DNA或RNA自身作为药物的基因药物,近年来已成为基因药物研究的热点.如对导致腺鼠疫的耶森菌400多万个碱基对的测序后,通过生物信息学分辨各个基因的作用,在此基础上,计划研制新型腺鼠疫DNA疫苗.随着人类基因组计划和生物信息学的发展,将会涌现更多的基因药物.
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生物信息学(2):基因工程技术简介
基因工程的特点与基本步骤基因工程通常称为重组DNA技术(recombinant DNA technique),又称为基因克隆(gene cloning)或分子克隆(molecular cloning),是用人工方法将外源基因与DNA载体结合形成重组DNA,然后引入某一受体细胞中,使外源基因复制并产生相应的基因产物,从而获得生物新品种的一种崭新育种技术.
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叶酸诱导人肝癌细胞凋亡及其机制的研究
目的研究叶酸诱导人肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法应用叶酸连续处理体外培养的人肝癌细胞(SMMC-7721)，4天后光镜及电镜观察细胞形态改变，细胞计数测定细胞生长及增殖情况，DNA凝胶电泳分析DNA改变，流式细胞仪检测细胞周期分布、细胞凋亡指数及凋亡相关基因及其表达的改变。结果 10 μg/ml叶酸可诱导SMMC-7721细胞出现凋亡特征性形态改变，其细胞DNA电泳呈现"梯状"断裂现象，细胞凋亡指数为16.8％(空白对照组为6.9％)，S期细胞减少，细胞生长和增殖被明显抑制，且凋亡相关基因fas和p53表达增加，而bcl-2和TGF-β1表达降低。结论叶酸具有诱导人肝癌细胞凋亡的作用，其机制可能与调控细胞凋亡相关基因的表达有关。
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叶酸诱导人肝癌细胞凋亡及其机制的研究
目的研究叶酸诱导人肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法应用叶酸连续处理体外培养的人肝癌细胞(SMMC-7721)，4天后光镜及电镜观察细胞形态改变，细胞计数测定细胞生长及增殖情况，DNA凝胶电泳分析DNA改变，流式细胞仪检测细胞周期分布、细胞凋亡指数及凋亡相关基因及其表达的改变。结果 10 μg/ml叶酸可诱导SMMC-7721细胞出现凋亡特征性形态改变，其细胞DNA电泳呈现"梯状"断裂现象，细胞凋亡指数为16.8％(空白对照组为6.9％)，S期细胞减少，细胞生长和增殖被明显抑制，且凋亡相关基因fas和p53表达增加，而bcl-2和TGF-β1表达降低。结论叶酸具有诱导人肝癌细胞凋亡的作用，其机制可能与调控细胞凋亡相关基因的表达有关。
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叶酸诱导人肝癌细胞凋亡及其机制的研究
目的研究叶酸诱导人肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法应用叶酸连续处理体外培养的人肝癌细胞(SMMC-7721)，4天后光镜及电镜观察细胞形态改变，细胞计数测定细胞生长及增殖情况，DNA凝胶电泳分析DNA改变，流式细胞仪检测细胞周期分布、细胞凋亡指数及凋亡相关基因及其表达的改变。结果 10 μg/ml叶酸可诱导SMMC-7721细胞出现凋亡特征性形态改变，其细胞DNA电泳呈现"梯状"断裂现象，细胞凋亡指数为16.8％(空白对照组为6.9％)，S期细胞减少，细胞生长和增殖被明显抑制，且凋亡相关基因fas和p53表达增加，而bcl-2和TGF-β1表达降低。结论叶酸具有诱导人肝癌细胞凋亡的作用，其机制可能与调控细胞凋亡相关基因的表达有关。
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叶酸诱导人肝癌细胞凋亡及其机制的研究
目的研究叶酸诱导人肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法应用叶酸连续处理体外培养的人肝癌细胞(SMMC-7721)，4天后光镜及电镜观察细胞形态改变，细胞计数测定细胞生长及增殖情况，DNA凝胶电泳分析DNA改变，流式细胞仪检测细胞周期分布、细胞凋亡指数及凋亡相关基因及其表达的改变。结果 10 μg/ml叶酸可诱导SMMC-7721细胞出现凋亡特征性形态改变，其细胞DNA电泳呈现"梯状"断裂现象，细胞凋亡指数为16.8％(空白对照组为6.9％)，S期细胞减少，细胞生长和增殖被明显抑制，且凋亡相关基因fas和p53表达增加，而bcl-2和TGF-β1表达降低。结论叶酸具有诱导人肝癌细胞凋亡的作用，其机制可能与调控细胞凋亡相关基因的表达有关。
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三氧化二砷对恶性淋巴瘤细胞株凋亡的研究
目的研究不同浓度的三氧化二砷对恶性淋巴瘤细胞株的影响。方法采用细胞染色方法观察细胞凋亡的形态，原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞，流式细胞仪检测细胞的DNA含量的形态，原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞，流式细胞仪检测细胞的DNA含量和bcl-2蛋白的表达。结果 0.5 μmol/L～2.0 μmol/L三氧化二砷抑制B淋巴瘤细胞株Raji细胞生长，出现细胞凋亡的形态学改变，流式细胞仪检测Raji细胞亚G1期细胞明显增多，bcl-2蛋白的表达明显降低，呈现剂量时间依赖效应。0.5 μmol/L～4.0 μmol/L三氧化二砷对T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞无明显作用。结论三氧化二砷有明显抑制恶性B淋巴瘤细胞生长和促进细胞凋亡的作用。
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肝细胞肝癌p21WAF1与p53的表达及其意义
目的探讨HCC中p21WAF1与p53的表达及其意义。方法应用免疫组化法检测38例手术切取的HCC及其配对癌旁肝组织、5例正常肝组织中p21WAF1和p53的表达，并分析它们与病理形态的关系。结果 p21WAF1、p53在HCC中的表达明显高于癌旁肝组织，p21WAF1阳性14例(36.8 %)，p53阳性28例(73.7 %)，其中两者表达一致(均阳或均阴)的18例，表达不一致的20例。癌旁肝组织1例(2.6 %)、正常肝组织2例p21WAF1呈阳性表达，所有癌旁及正常肝组织中均未见p53表达。HCC中p21WAF1表达与p53表达无明显关系(P＞0.05)。在不同组织学分级、有无肝内转移或门脉癌栓之间p21WAF1、p53表达差异均无显著性(P＞0.05)。结论p21WAF1与p53在癌内表达均高于癌旁，但两者间并无相关性，提示p21WAF1表达可能受p53依赖和p53非依赖性两种途径调节。
