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突变体富集聚合酶链反应检测胰腺癌K-ras基因突变的研究
胰腺癌是一种恶性程度极高,早期难以诊断,预后极差的恶性肿瘤,临床确诊者大多属于晚期癌,5年生存率总体低于5%.我们采用突变体富集聚合酶链反应(PCR)检测胰腺癌细胞系K-ras基因点突变,以期为早期诊断胰腺癌提供一种简便、灵敏而有效的检验方法.
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雷帕霉素靶蛋白在中枢神经损伤修复中的作用研究进展
轴突再生受限有内外两方面因素,针对外部生长环境的研究已有很多探索,包括减弱髓磷脂相关神经生长抑制因子的抑制作用,减少炎症介质的释放等改善轴突再生微环境,但治疗效果有限.近年来,轴突再生的内在限制备受关注.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,于1991年由Heitman等[1]在分析不同啤酒酵母突变体对雷帕霉素抵抗作用的差异时发现,它属于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白家族,在调节细胞生长、增殖、细胞周期等多个方面起到重要作用.
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含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽的白细胞介素-24突变体真核表达载体的构建及其体外抗肝癌作用
目的 构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽的白细胞介素(IL)-24突变体(RGD-IL-24)真核表达质粒,观察其对肝癌细胞的抑制作用.方法 利用重叠PCR技术在IL-24cDNA中插入GGT三个碱基,获得RGD-IL-24 cDNA.将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1/RGD-IL-24.将pcDNA3-1/RGD-IL-24及作为对照的pcDNA3.1/IL-24转染肝癌细胞HepG2,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-24 mRNA表达;Western blot检测IL-24蛋白表达;噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖;FITC-Annexin V染色检测细胞凋亡;Western blot检测bax、bcl-2表达.结果 测序证明pcDNA3.1/RGD-IL-24构建成功.RT-PCR、Western blot证实转染pcDNA3.1/RGD-IL-24的肝癌HepG2细胞表达IL-24.pcDNA3.1/RGD-IL-24、pcDNA3.1/IL-24处理组HepG2细胞存活率分别为(0.382±0.064、0.563±0.038),凋亡细胞阳性率分别为(0.346±0.049、0.163±0.087),两组差异均有统计学意义.Western blot证实pcDNA3.1/RGD-IL-24促进bax表达、抑制bcl-2表达作用强于pcDNA3.1/IL-24.结论 RGD-IL-24真核表达质粒不仅不影响IL-24表达,且能显著增强IL-24诱导肝癌细胞凋亡及抑制肿瘤生长作用.
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CX26不同结构域错义突变体的表达和定位
目的 探讨 CX26蛋白质的9个结构域上的不同错义突变体在细胞内的表达及功能改变的异同,初步研究CX26不同错义突变体的致聋机理.方法 在CX26的9个结构域中各选择1个致聋的错义突变(p.S19T、p.R32H、p.E47K、p.V84L、p.V95M、p.R143W、p.R165W、p.S199F、p.L214P),应用重叠区扩增基因拼接法和长引物快速法,构建成与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的载体,野生型CX26-EGFP作对照,脂质体转染HeLa细胞,Western blot分析蛋白的表达,共聚焦显微镜下观察各突变体在细胞膜上有无间隙连接斑形成.结果CX26的9个结构域上的各1个错义突变体在HeLa细胞中均有表达,其中p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M和p.vRl65W突变体能在细胞膜上表达并形成间隙连接斑,p.R32H、p.R143W、p.S199F和p.L214P突变体在细胞浆中表达,在细胞膜无表达,无间隙连接斑形成.结论 CX26的p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M和p.R165W突变体在细胞内能被转运到细胞膜并形成间隙连接,而p.R32H,p.R143W、p.S199F和p.L214P突变体失去被转运到细胞膜的功能,不能形成间隙连接.CX26的不同错义突变的致聋机制可能不同,与突变点所在的结构域可能没有相关性.
关键词： 连接蛋白26(CX26) 突变体 表达 间隙连接 -
新型组织型纤溶酶原激活药的研究进展
综述新型组织型纤溶酶原激活药的研究进展,主要介绍野生型组织型纤溶酶原激活药的突变体、嵌合体以及抗体连接物等.临床结果表明,它们在延长体内半衰期、增强对血纤维蛋白的选择性和溶栓效力等方面均有较大改进.新型组织型纤溶酶原激活药的研制开发,为血栓类疾病的治疗开辟了更广阔的前景.
关键词： 组织型纤溶酶原激活药 突变体 嵌合体 -
流动状态下ADAMTS13羧基端的功能研究
目的 研究ADAMTS13及其突变体于体外流动状态下裂解血管性血友病因子(VWF),降低血小板粘附形成血栓能力的差异.方法 将全长ADAMTS13(FL)及缺失TSP2-8CUB1+2(MDTCS)和缺失CUB1+2(delCUB)cDNA质粒瞬时转染COS7细胞,Western blot检测各瞬时表达细胞分泌的蛋白.利用流体力学装置平板流动小室(Flow Chamber)培养人脐静脉内皮细胞,并通过蠕动泵加压流动培养液模拟人体血管内流动状态,荧光显微镜观测加入ADAMTS13或其突变体蛋白后荧光标记的血小板聚集状态的差异.结果 成功在真核表达细胞内瞬时表达ADAMTS13及其突变体蛋白,简单纯化并经Western blot检测各表达蛋白相对分子量与预期一致.Flow Chamber模拟人体血管内剪切力作用下,FL蛋白和MDTCS蛋白可以不同程度地抑制血小板凝集,delCUB蛋白抑制血小板凝集的能力显著下降.结论 成功瞬时表达全长ADAMTS13及其突变体蛋白.初步证实流动状态下ADAMTS13羧基端是参与裂解VWF以抑制血小板凝集的主要区域.
关键词： 血管性血友病因子裂解酶 突变体 剪切力 流动小室 -
重组人生长激素受体胞外段及其突变体S201C
目的 研究重组人生长激素受体胞外段(rhGHRECD)与人生长激素(hGH)结合动力学.方法 用定点诱变PCR法获得rhGHRECD突变体S201C碱基序列.将测序正确的质粒pET20b(+)-hGHRECD、rhGHRECD(S201C)转入BL21(DE3)表达,纯化得到蛋白.采用放免分析法测定rhGHRECD、rhGHRECD(S201C)蛋白与hGH的结合解离常数(Kd);采用BIAcore检测rhGHRECD(S201C)与hGH的结合动力学.结果 放免测得KdWT=1.879×10-10 M、KdS201C=1.937×10-10 M;BIAcore 测得结合速度(Kon)= 3.2 ×105 (M-1·s-1), 解离速度(Koff)= 3.9 ×10-5 (s-1),Kd=1.220 ×10-10M.结论 rhGHRECD、rhGHRECD(S201C)与商品化的hGH具有极高的结合能力;rhGHRECD、rhGHRECD(S201C)与hGH结合,具有同样高的亲和力;rhGHRECD(S201C)可锚定于BIAcore芯片上,实时检测重组的hGH Site1与受体结合的动力学变化.
关键词： 人生长激素受体细胞外段 人生长激素 突变体 表达 纯化 -
pcDNA3.1/NT-GFP小凹蛋白1及突变体表达载体的构建及功能分析
目的 构建pcDNA3.1/NT-GFP小凹蛋白1及对突变体表达载体及表达蛋白生物活性进行分析.方法 采用硫化修饰引物与Pfu酶结合的高度保真性聚合酶链反应体系,自行设计多对引物,分别扩增带His标签的小凹蛋白1全长目的片段、小凹蛋白1(缺失81～101位氨基酸)突变体1片段及小凹蛋白1(缺失143～156位氨基酸)突变体2片段;分别亚克隆入pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO真核表达载体,转化TOP10 E.coli大肠杆菌,在含氨苄的固体LB培养基上随机挑取6个克隆,分别提取质粒后,用PCR法筛选含正确插入阅读框的阳性克隆子并测序鉴定.用脂质体介导法瞬时转染入HepG2细胞,用MTT法、Western blot法初步鉴定GFP-His小凹蛋白1及突变体重组融合蛋白的生物学活性.结果 筛选得到正确pcDNA3.1/NT-GFP-His小凹蛋白1及突变体表达载体,测序结果无碱基突变及阅读框移码,GFP-His小凹蛋白1及突变体重组融合蛋白具有天然表达蛋白相似的生物学活性.结论 成功构建具有生物学活性的pcDNA3.1/NT-GFP小凹蛋白1及突变体表达载体,为小凹蛋白1的功能研究奠定基础.
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结核分枝杆菌活性减毒突变体——新型抗结核分枝杆菌候选疫苗
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是已经发现的为重要的传染性病原体之一.其影响到了世界人口的1/3,导致每年300万人死亡;尽管有效的化疗和适度保护性疫苗的使用,但由于艾滋病的流行和MTB耐多药菌株的出现,结核仍然是目前发病率和死亡率占第1位的传染性疾病[1].
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WISP3基因突变体的构建及在COS-7细胞中的表达
目的:通过构建晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病(spondyloepiphyseal dysplasia tarda with progressive arthropathy,SEDT-PA)致病型(1000T/C,840 delT)Wnt诱导分泌蛋白3(wnt-inducible secreted protein 3,WISP3)的真核表达载体,并将其表达于真核表达系统COS-7细胞系,为研究WISP3突变致SEDT-PA的机制奠定基础.方法:从正常人软骨细胞获得野生型WISP3基因的全长cDNA(WT-WISP3):用定点突变方法构建携带WISP3基因致病型的重组真核表达质粒MUT1000T/C/pcDNA3.1(+)和MUT840delT/pcDNA3.1(+);以空白载体pcDNA3.1(+)为对照,脂质体转染法将重组质粒瞬时转染COS-7细胞,48 h后提取转染细胞的总RNA和总蛋白;半定量RT-PCR和免疫印迹方法检测WISP3基因的表达.结果:经测序证实,构建的野生型和突变型WISP3基因的全长cDNA序列分别与文献及前期报道的SEDT-PA患者WISP3基因突变类型一致;酶切鉴定证实,成功构建了3个重组真核表达质粒[WT-WISP3/pcDNA3.1(+),MUT1000T/C/pcDNA3.1(+)及MUT840delT/pcDNA3.1(+)];半定量RT-PCR和免疫印迹示,重组质粒在COS-7细胞中均高效表达.结论:成功构建了SEDT-PA致病基因WISP3的突变体并在COS-7细胞中得到表达,为进一步探讨SEDT-PA的发病机制创造了条件.
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乙肝病毒HBx-d382与HBx-d431突变体特异性抗体检测方法的建立及临床应用
目的建立检测乙肝病毒X基因突变体HBx-d382和HBx-d431特异性抗体的方法，探讨其在诊断HBV相关性肝细胞癌中的应用价值。方法通过生物信息和多肽合成的方法，制备HBx-d382和HBx-d431特异性多肽抗原。采用间接ELISA法对正常人和慢性乙肝病毒感染者和肝细胞癌病人血清中抗HBx-d382和抗HBx-d431特异性抗体进行检测。结果肝细胞癌病人血清中抗HBx-d382和抗HBx-d431抗体的阳性率均高于正常人、慢性乙肝病毒感染者(P<0.05)，慢性乙肝病毒感染者抗HBx-d382和抗HBx-d431抗体的阳性率高于正常人(P<0.05)。慢性乙肝病毒感染者HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式抗HBx-d382阳性率明显低于HBsAg (+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)模式和HBsAg(+)/HBcAb(+)模式(P<0.05)，而抗HBx-d431和抗HBxP阳性率在这些血清学模式之间无显著性差异(P>0.05)。结论抗HBx-d382和抗HBx-d431是乙肝病毒感染的一种特异性抗体，可以用于HBV携带者及慢性乙肝病人的监测，对预测肝细胞癌的发生有一定的意义。
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组织型纤溶酶原激活物突变体对鼠急性脑梗死及脑组织保护作用实验研究
目的 评价新型组织型纤溶酶原激活物突变体(t-PAm)对鼠急性脑梗死溶栓作用及脑组织保护作用.方法 84只成年Wistar大鼠随机分为对照组、组织型纤溶酶原激活物组(t-PA)、低剂量组织型纤溶酶原激活物突变体组(低剂量t-PAm组)及常规剂量组织型纤溶酶原激活物突变体组(常规剂量t-PAm组),大脑中动脉血栓形成3 h后进行相应治疗.观察溶栓24 h后脑梗死面积、神经损伤评分、脑出血的情况,并通过中性粒细胞浸润及蛋白酶激活受体1(PAR-1)浓度的变化了解t-PAm对脑组织的保护作用.结果 梗死后应用低剂量t-PAm[(108.5±27.3)mm3]及常规剂量t-PAm[(68.3±17.2)mm3]组梗死面积均较对照组降低,同时梗死面积与神经评分有明确的相关性(r=0.613,P=0.000),且低剂量t-PAm在溶栓的同时没有明显增加脑出血的概率.t-PAm还减少髓过氧化物酶的生成,并与t-PA组相比减少PAR-1的生成(P<0.001).结论 新型组织型纤溶酶原激活物突变体有较好的溶栓作用,同时对缺血脑组织有明显的保护作用.
关键词： 尿激酶 血栓 组织型纤溶酶原激活物 突变体 -
细胞信号转导、基因表达、DNA复制保真度与哺乳细胞非定标性突变--致癌物诱发基因突变分子机制研究
本实验室曾应用一携带SupF tRNA 基因的穿梭质粒pZ189,转染在24h前经受半寿期仅1.1h的烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝胍(MNNG)攻击的vero细胞,从回收的在细胞中进行过复制的质粒中选出了靶基因SupF tRNA的突变体,并有突变发生的序列特异性,由此证明烷化剂MNNG攻击后可在非损伤碱基部位诱发突变(非定标性突变).对其发生机制进行了系统研究.主要结果如下:
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浅谈溶栓药的特点及应用
在1959年已经用链激酶(SK)治疗心肌梗死,在80年代前可供使用的溶栓药除SK外还有尿激酶(UK),80年代以来,先后有基因重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)及其突变体、TNKt-PA前尿激酶(Pro-UK)和葡激酶(SAK).
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HERG基因G572R突变体表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立
目的：构建HERG基因G572R突变体表达载体并建立其稳定转染HEK293的细胞系。方法应用重叠延伸PCR构建HERG-G572R突变体表达载体，经G418筛选稳定转染细胞系，通过Real-Time PCR，Western blot及测序鉴定稳定转染细胞系。结果经序列比对，证明HEK-HERG-G572R突变体表达载体构建成功，Real-Time PCR，Western blot及测序证明稳定转染细胞系构建成功。结论该方法可成功构建的HKE-HERG-G572R细胞株，为药物个体化治疗提供工具。
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氧浓度和钙离子对野生型及突变型低氧诱导因子-1α基因真核表达的影响
目的 对已构建的突变型人低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala(单突变)和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala(双突变)进行进一步的功能鉴定.方法 将pcDNA3.1+/HIF-1α、pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala分别用脂质体法短暂转染人胚肾上皮细胞(human embryo kidney 293,HEK293);Western blotting法检测正常氧、低氧无钙离子或有钙离子条件下各组转染细胞HIF-1α蛋白水平:RT-PCR法检测正常氧条件各组转染细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达.结果 正常氧条件下,转染突变体的细胞较转染野生型HIF-1α载体的细胞HIF-1α蛋白和VEGFmRNA水平增高;低氧条件下,转染野生型HIF-1α载体的HEK293细胞HIF-1α蛋白水平增高:Ca~(2+)刺激减少低氧时转染野生型HIF-1α载体细胞HIF-1α蛋白水平,但对转染突变体细胞HIF-1α蛋白水平无明显影响.结论 pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala两种突变体产物在蛋白水平上具耐氧和耐蛋白酶降解的特性.
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Raf-1蛋白突变体的原核表达、纯化及活性鉴定
目的:将Raf-1蛋白259位丝氨酸(Ser,S)突变成天冬氨酸(Asp,D),构建突变型GST-Raf-1220-268S259D原核表达载体,表达和纯化融合蛋白及鉴定其生物学活性.方法:以pGE X-4T-1-Raf-1220-268为模板,运用PCR定点突变技术扩增出Raf-1220-268S259D基因序列,插入原核表达载体pGEX-6P-1,表达和纯化重组蛋白,GST沉降实验鉴定蛋白的生物学活性.结果:重组质粒测序结果正确,获得模拟磷酸化GST-Raf-1220-268蛋白.GST沉降实验检测到目的蛋白和14-3-3蛋白具有体外特异性结合活性.结论:成功构建GST-Raf-1220-268S259D原核表达载体,并表达及纯化了有生物学活性的融合蛋白,为进一步针对Raf-1的研究提供实验依据.
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CYP2C9基因多态性与合理用药研究
细胞色素P4502C9(Cytochrome P4502C9,CYP2C9)基因编码蛋白在人类肝细胞微粒体中含量丰富,约占CYP总量的20%,仅次于CYP3A.CYP2C9能代谢许多不同性质的药物,并在前致癌物、前毒物和致突变剂的活化中也起到一定作用.1993年,国外从一个S-美芬妥英强代谢个体中分离出CYP2C9基因并发现CYP2C9基因含有9个外显子和8个内含子,全长约为55kb[1].其中,CYP2C9有多于50种单核苷酸多态性,主要的有3种,即野生型CYP2C9*1、突变体CYP2C9*2和突变体CYP2C9*3.
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P364L突变降低UGT1A1酶对非结合胆红素的催化活性
目的 研究尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1的P364L突变型(e.1091 C＞T)对催化非结合胆红素葡糖醛酸化的影响.方法 构建含有UGT1A1编码序列的野生型和P364L突变型质粒,转染HEK293细胞,表达野生型与突变型蛋白;Western blot验证野生型和P364L突变型蛋白表达情况;超声裂解细胞提取表达蛋白;设计两组反应,野生型为对照组,P364L突变型为实验组,分别催化非结合胆红素反应,HPLC定量检测两组中非结合胆红素浓度变化情况.结果 对照组中非结合胆红素的浓度随着时间的延长呈逐渐下降的趋势,而结合胆红素的浓度随时间延长逐渐升高;实验组中非结合胆红素浓度下降程度远小于对照组,未见明显的结合胆红素峰值;反应30 min时计算酶的活性P364L突变型为野生型的14.2％.结论 突变酶UGT1A1-P364L催化非结合胆红素能力较野生型明显降低.
关键词： 尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1A1 胆红素 葡糖醛酸化 突变体 -
HP0318基因在幽门螺杆菌适应性定植中的作用研究
目的 通过构建幽门螺杆菌(Hp) HP0318缺失突变株,初步探明该基因在Hp适应性定植中的作用.方法 通过基因克隆和重组技术在HP0318基因上下游片段之间连入氯霉素抗性基因(catGC)作为筛选标记,并克隆到质粒pBluescript SK中构建成缺失突变的打靶载体,将其转化沙鼠适应株M13,经过同源重组,对出发菌的HP0318基因进行置换突变,然后用经氯霉素抗性筛选的突变菌株感染蒙古沙鼠,观察其与未突变的M13出发菌在定植能力和致病性上的差异.结果 经PCR鉴定成功构建1株缺失HP0318基因的Hp菌株.突变株与非突变株对蒙古沙鼠的感染率相差显著(P＜0.05),2个菌株在胃内的定植密度有显著性差异(P＜0.05),突变株定植密度有约5倍的减少.结论 HP0318基因在Hp的沙鼠适应性定植过程中发挥了重要的作用.
