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小鼠腔前卵泡不同分离方法的比较
目的 探讨小鼠腔前卵泡的佳分离方法.方法 取性未成熟小鼠的卵巢,按照不同分离方法,单纯机械法与酶解法分离腔前卵泡,并用基础培养基进行培养,比较不同分离方法获得的卵泡数量、形态,及对其早期生长发育的影响.结果 2 mg/mL的胶原酶可获得大量基底膜完整的腔前卵泡及裸卵(P<0.01);体外培养2d后,酶解组卵泡生长直径大(P<0.05)、GVBD率、放出第一极体率和7d生存率无明显差异(P>0.05).结论 胶原酶酶解法较单纯机械法更易获得大量高质量腔前卵泡,且对其早期发育无明显影响.
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两种不同方法分离脐血造血干细胞实验研究
目的比较两种不同方法分离脐血造血干细胞的结果.方法采用Ficoll法、HES法分离脐血单个核细胞,比较两种方法优点.结果HES法所得MNC产率(79.31±2.68)%、GM-CFU数(60.92±9.49)均明显高于Ficoll分离法所得MNC产率(41.72±4.19)%、GM-CFU数(31.17±5.26)(P＜0.01).该研究采用HES法分离脐血造血干细胞对HLA相合的相关脐血移植已成功重建造血.结论HES分离法病原菌污染机会少,且单个核细胞、造血干/祖细胞的回收率较高,对重建造血无不良影响,是一种较好的分离方法.
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广州管圆线虫一期幼虫的分离纯化及其抗原分析
目的 建立广州管圆线虫一期幼虫的分离纯化方法,分析其抗原特性及血清学诊断价值.方法 分别用贝尔曼漏斗法、蔗糖离心浮选法及改良贝尔曼法联合胰酶消化法从大鼠粪便中分离纯化一期幼虫;用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白潜与抗原谱分析;分别用一期幼虫和成虫抗原包被ELISA反应板,间接法检测不同样本中相应抗体.结果 3种方法分离效率分别为50.1%、33.6%和19.7%;联合法获得的纯度高,凡90%以上的幼虫有活力;贝尔曼漏斗法分离的幼虫99%以上具有活力但纯度低;蔗精离心浮选法分离的绝大多数虫体失去活力.一期幼虫104 000 Mr与广州管圆线虫感染2 周的大鼠血清出现强反应,32 000 Mr和31 000 Mr与感染6周的大鼠血清、32 000 Mr与广州管圆线虫病患者血清均出现较强反应,与对照血清均未出现明显的反应;在ELISA检测中,一期幼虫抗原对广州管圆线虫病患者血清和感染大鼠血清的检出率与成虫抗原无统计学筹异.结论 改良贝尔曼法联合胰酶消化法可从大鼠的粪便中分离高纯度且具有活力的一期幼虫,一期幼虫104 000 Mr、32 000 Mr和31 000 Mr具有潜在的诊断价值,可望从大鼠粪便中分离一期幼虫开发诊断性抗原.
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应用激光微分离系统分析老年大鼠肾小球、肾小管及小动脉转化生长因子β1的基因表达变化
为了对肾脏不同组成部分进行精细研究,早在80年代人们即开始研究各种微分离方法,90年代激光微分离技术逐渐成熟,特别是90年代后期自动激光微分离系统的问世[1,2],大大推动了对各种疾病发病机制的精细研究,肾脏病的研究也在不断应用此项技术[3,4].
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SP技术在肿瘤干细胞研究中的应用
肿瘤干细胞是肿瘤形成和进展的根源[1],其基因具有不稳定性,可通过环境选择产生恶性程度更高的肿瘤干细胞,如具有转移能力的肿瘤干细胞[2].要特异地探讨肿瘤干细胞,首要解决的问题就是分离.目前用于分离的方法有多种[3],其中常用的分离方法为根据肿瘤干细胞外排染料的特性分离side population(SP细胞群)[4],因此本文综述SP技术在肿瘤干细胞分离中的应用.
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体外原代肝细胞分离培养方法的比较
肝细胞是高度分化的细胞,具有丰富的酶系及多种特异性功能,被广泛用于生物化学、实验性肝损伤、药代动力学、毒理学和致癌作用等研究;而原代培养的肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的佳生物材料[1].目前制备离体肝细胞常用的方法有非酶分离细胞法、离体肝脏酶消化分离法以及在体肝脏酶灌注法[2].这些分离培养肝细胞的技术均被广泛采用,但各种技术间缺乏系统的归类.本文对体外肝细胞来源、各种分离方法和笔者的一些实际工作体会做一综述.
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肿瘤干细胞分离方法的研究进展
随着现代科学技术的发展,近年来许多学者经过大量研究后提出来肿瘤干细胞学说,认为在几乎所有的癌症中都存在极少的肿瘤干细胞,这些肿瘤干细胞可以自我更新,无限增殖,多向分化和在体内形成癌症,在肿瘤发生、发展、转移、复发过程中起关键作用[1].目前一些实体瘤的肿瘤干细胞或者干细胞样细胞已被分离鉴定出来,主要的分选方法有:荧光激活细胞分选法(也称为流式细胞分选术),带有抗体的磁珠激活细胞分选法,无血清方式培养.荧光活化细胞分选系统和磁性活化细胞分选系统,这两种分离技术均有赖于肿瘤干细胞表面标记物的识别[2].本文对上述分选方法综述如下.
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孕妇外周血中胎儿红细胞分离方法研究进展
孕妇外周血中分离胎儿细胞进行基因分析是目前创伤性小的方法,随着物理学、遗传学、免疫学和分子生物学理论技术的发展及应用,对胎儿红细胞标志物的认识能力显著提高,分离胎儿细胞的方法明显改善,可望将少量的胎儿细胞从大量的孕妇外周血细胞中高纯度地分离出,用于非创伤性的产前基因诊断.
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脂肪源性干细胞无酶分离培养方法的研究
目的：探索适合临床治疗应用的脂肪源性干细胞（ADSCs）分离培养方法。方法分别采用无酶分离法和胶原酶消化法从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养细胞，对比分析分离的间充质干细胞特性。结果无酶分离法所需时间仅为胶原酶消化法的1/3，分离的细胞在细胞形态学、增殖能力、免疫表型、分化潜能等特性与胶原酶消化法分离培养的细胞一致。结论无酶分离法能够从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养出ADSCs ，是一种安全可靠、适合临床应用的ADSCs分离培养方法。
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人心房肌细胞分离方法的改良研究
目的 探索改良的人心房肌细胞分离方法.方法 采用两步酶消化法急性分离人心房肌细胞,采用膜片钳全细胞记录技术记录小电导钙激活钾通道.结果 该分离方法可获得数量较多的心房肌细胞,窦性心律患者可获得完整有横纹细胞320±30,慢性房颤患者可获得完整有横纹细胞230±20,比较差异有统计学意义(P<0.01).该方法可获得大量形态完整,横纹清晰的单个人心房肌细胞,且能在所分离的心房肌细胞上记录到典型的小电导钙激活钾通道电流.结论 该试验所采用的分离方法简便,稳定有效,可获得细胞数量多和细胞质量好的单个人心房肌细胞.
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兔蛛网膜下腔出血后基底动脉平滑肌细胞的分离方法研究
目的 建立一种快速、有效的分离兔蛛网膜下腔出血(SAH)后基底动脉平滑肌细胞(BASMCs)的方法.方法 采用木瓜蛋白酶、二硫赤藓糖醇(DTE)、胶原酶(Ⅺ型)两步法急性分离兔SAH后BASMCs.利用倒置显微镜观察细胞数量及形态,台盼蓝法测定BASMCs成活率.结果 分离出BASMCs的数量(40.33±10.18)个/200倍视野,镜下观察绝大多数平滑肌细胞呈长梭形,包膜完整光滑,细胞成活率为80％.结论 该方法能快速、有效地分离BASMCs,并获得足够数量的细胞,为SAH后脑血管痉挛(CVS) BASMCs上离子通道的膜片钳研究创建了条件.
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从医院污水中省内首次检出1株Ⅱ沙门氏菌
污水中含有多种肠道致病菌,是造成人畜感染的重要因素.我们从医院污水中分离出1 株省内首次检出的Ⅱ沙门氏菌,分离方法和鉴定结果如下:
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用于膜片钳实验的大鼠心室肌细胞分离方法
目的:研究用于膜片钳实验的SD大鼠心室肌细胞的分离技术,并记录心室肌细胞L型钙通道的电流.方法:采用改进的Langendorff酶液灌流技术分离获得单个心室肌细胞;采用全细胞膜片钳技术记录L型钙通道电流.结果:分离所得70%～80%的存活心肌细胞中有60%～70%左右的耐钙心肌细胞;并记录到典型的L型钙通道电流,其激活电位为-30mv,大激活电压为0mv.结论:该方法能够分离出足量的可以进行膜片钳实验的心室肌细胞.
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免疫磁技术在分离人外周血树突状细胞中的应用
免疫磁珠技术(Immuno-magnetic bead metho d,IMBM)是70年代起步,80年代兴起的,在国内、外应用较多的一种新型细胞分离技术.该项技术以免疫学为基础,渗透到病理学等各个领域,应用日趋广泛.尤其是在细胞分离等方面取得巨大进展.本文就IMBM及其在树突状细胞(dendritic c ell简称DC)分离纯化中的应用进行简单介绍.一、IMBM简介:1.免疫磁珠是一种直径数微米、大小均匀的球形结构,由三部构成. 其核心是金属小颗粒铁;核心周围均匀地包裹着一层高分子材料,可防止金属微粒漏出;外层为功能团,可结合特异性单克隆抗体.2.该技术的功能原理是:其表面被覆的特异性单克隆抗体或第二抗体可分别与特异性靶细胞结合,形成磁珠-抗体-抗原复合物;再用磁铁吸引复合物,使之与其他物质相分离.当磁珠-抗体-抗原复合物离开磁场,靶细胞得以收集.3.该分离方法可分为直接法和间接法;两种方法又均可存在阳性选择或阴性选择两种方式.二、IMBM在人外周血树突状细胞分离中的应用:DC具有呈递抗原,参与机体肿瘤免疫的重要作用,但其在外周血液中的含量仅占1%.用常规分离方法获取DC十分繁琐,耗时长、收获少、纯度低,且对细胞的损伤也较大.我室将IMBM应用于人外周血DC的分离 ,获得较好效果,现简介如下:首先用Ficoll密度梯度离心技术从人外周血中获得单个核细胞,再通过二步来分离DC.第一步:用标记的CD3、CD11b、CD16的混合性抗体与单个核细胞共孵育;清洗,然后再与磁珠标记的抗半抗原抗体共孵育.孵育后的细胞悬液在通过磁场时,磁珠标记的CD3+、CD11b+、CD16+的细胞则被吸附在阴性选择柱中,而未与磁珠标记的抗体相结合的细胞从磁场中流出被收集,即为富含DC的细胞悬液.第二步:将富含DC的细胞悬液与磁珠标记的CD4单克隆抗体共孵育 .则CD4+ DC在通过磁场时被吸附,从而使之被收集到阳性选择柱中.将分离柱移离磁场,冲出柱内细胞,清洗后,从而使被收集到阳性选择柱中.将分离柱移离磁场,冲出柱内细胞,清洗后,荧光抗体检验DC纯度为95%.三、讨论:在细胞分离时,应尽量使用人新鲜抗凝血,整个操作过程动作要轻柔.与磁珠标记的抗体孵育时间和温度可根据细胞数量的多少适当调整;孵育过程中,要不断地轻轻地摇动,以使细胞与抗体充分结合;冲洗细胞时,离心的速度和时间不宜过快和过长.细胞过柱前要用300目的尼龙网过滤,以免分离柱被成团细胞阻塞,影响分离效果.
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Tricine-SDS-PAGE法分析腮腺唾液蛋白
多种口腔疾病或系统性疾病的发生、发展过程中,唾液成分的质和量都可能发生改变[1].唾液蛋白作为唾液的主要有机成分,与唾液的多种生理功能密切相关[2].因此研究唾液蛋白对于了解机体的生理及病理状况具有重要意义.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是常用的唾液蛋白的分离方法.传统的SDS-PAGE系统由Laemmli建立,该系统对分子量在20 kD以下的蛋白分离欠佳[3],需通过繁琐的操作制备梯度凝胶.而腮腺唾液的主要成分富脯蛋白和富组蛋白的分子量为10～40 kD和3～5 kD,故分析腮腺唾液蛋白需要对Laemmli的方法进行改进.既往研究发现经SDS-PAGE电泳后,唾液富脯蛋白难以着色.但可去除乙酸脱色液中的其他有机溶剂成分,使富脯蛋白发生变色效应呈紫红色,与其它蛋白区分[4].
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鼠肾近曲小管微分离技术
分离动物肾脏单独的肾小管节段,可以为肾脏的基础和临床研究搭建一个平台,自从上世纪60年代以来,人们就不断探索这项实验技术.目前虽然已建立起几种肾小管微分离方法,但因其配置昂贵或操作繁琐,国内一直研究及使用得很少.我们结合国内实际,从经济实用、操作方便角度出发,在显微解剖分离法的技术基础上,经过长期大量的动物实验,摸索出一套较完善的显微微分离单独肾近曲小管节段的技术方法.此方法相对具有配置低廉、步骤简单、成功率高、可操作性强、易于推广等特点,是分离肾脏单独近曲小管节段较理想的技术方法.
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内皮祖细胞与心血管危险因素研究进展
1 内皮祖细胞的来源、表面标志、分离方法内皮组细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的来源主要包括人脐静脉血、成人外周血、骨髓,并且发现外周血中的EPCs起源于骨髓,而脐血中的EPCs起源于胎儿的肝脏.迄今为止,EPCs尚无统一的鉴定标准,一般将表达CD34/CD133/KDR (VEGFR2或Flk(1))这3种基因标志物的细胞定义为EPCs.EPCs的分离方法很多,常见的有密度梯度离心法配合直接贴壁筛选法,除此以外还有细胞分离装置、免疫磁珠分选法、双色荧光流式细胞仪分离法、生物素二抗生物素亲和吸附法、单克隆抗体铺展贴壁细胞分离法等[1].
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两种分离人胎盘组织单个核细胞方法的比较
目的探讨从人胎盘组织制备高丰度单个核细胞(MNC)的方法.方法采用机械法加胶原酶消化法制备人胎盘组织单个细胞悬液,再分别用羟乙基淀粉(6%HES)和Ficoll分离其中的MNC,并对分离效果进行比较.结果胎盘组织单个细胞悬液经6%HES分离后MNC的回收率为(45.3±11.7)%,而经Ficoll分离为(24.1±5.5)%,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01),前者分离MNC的回收率明显高于后者.结论 6%HES分离法优于Ficoll法,其可从胎盘组织获得高丰度的MNC.
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贵州产黄珠子草总黄酮毒性及抗CCl4、AAP中毒小鼠肝损伤实验
黄珠子草为大戟科叶下珠属(Phyllanthus)植物,贵州产叶下珠属植物黄珠子草(Phyllanthus Virgatus Forst.f.)广泛分布于兴义、兴仁、织金、贞丰等地[1].我们采用贵州产黄珠子草已进行其总黄酮的提取分离方法与含量测定[2],但资料查新未见有关贵州产黄珠子草总黄酮毒性与抗肝损伤等方面的研究报道.为此我们特进行了贵州产黄珠子草总黄酮毒性及抗CCl4、AAP中毒小鼠肝损伤实验,现将其研究结果报告如下.
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混合斑中精子细胞的分离方法研究进展
混合斑中的精子细胞的分离一直是性犯罪案件侦破的关键点和难点,就各种常见的精子分离方法、优缺点及研究进展进行概述.
