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DSPP基因启动子不同片段启动活性的对比分析
目的:对比分析牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因启动子不同片段的启动活性.方法:选择小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞,利用含DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体,采用报告基因方法观察DSPP基因启动子不同片段的启动活性.结果:在MDPC-23细胞中,DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体均不同程度地表现了启动活性.其启动活性有差异(P＜0.01).结论:DSPP基因启动子不同片段的启动活性有差异,其活性变化反映位于-95 bp～54 bp、-410 bp～-195 bp、-1243 bp～-791 bp、-1447 bp～-1243 bp、-3519 bp～-2475bp区存在潜在的增强子;-195 bp～-95 bp、-670 bp～-410 bp、-2475 bp～-1447 bp区存在潜在的抑制子.进一步明确了DSPP基因启动子的结构,为今后研究DSPP基因的特异性表达奠定基础.
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不同细胞类型对cbf α1调控DSPP基因转录的影响
目的:观察核心结合因子α1(core binding factor α1,cbf α1)对不同细胞中牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)基因转录调控的影响.方法:选择Hela和小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞;DSPP基因上游2.6 kb片段为启动子.采用瞬时转染、报告基因等方法观察在两种细胞中,cbf α1对DSPP基因启动子启动活性的影响.结果:在MDPC-23及Hela细胞中,pGL3-Enhancer-2.6K与pcDNA3-cbf α1共转染组荧光素酶的表达量均小于pGL3-Enhancer-2.6K与pcDNA3共转染组(P＜0.01);在MDPC-23细胞中变化更为明显.结论:cbf α1对DSPP基因的转录调控作用受细胞类型的影响.
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丁型肝炎病毒复制包装载体的构建
目的 构建一种可以实现丁型肝炎病毒(HDV)复制包装的HDV转座子载体.方法 采用分子克隆方法构建含HDV复制子和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)表达框的转座子(PB)载体PB126I3,将构建好的载体转染HuH-7细胞,转染48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,转染48 h后收集细胞上清用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HBsAg的表达,质粒转染细胞8.5 d后提取病毒用逆转录荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测HDV核糖核酸(RNA)的含量;同时细胞上清病毒浓缩后感染HBV受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(Na+/NTCP)稳定转染的HepG2.N9细胞系并于感染后第7天用免疫荧光检测细胞内HDVδ抗原的表达.结果 HDV复制包装载体PB126I3瞬时转染HuH-7后细胞上清可检测到HBsAg的表达和较高滴度的HDV颗粒,并且该病毒颗粒感染HepG2.N9细胞7 d后细胞内可检测到HDVδ抗原.结论HDV复制包装转座子载体构建成功,为未来HDV的大规模复制包装以及尝试建立HDV稳定转染细胞系提供前期基础.
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糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α功能的影响及其意义
目的:通过研究糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α功能的影响,探讨糖皮质激素受体β可能存在的生物学意义.方法:(1)用瞬时转染技术将GRβ和报告基因cat共转染HOS-8603细胞,激素处理后,研究GRβ对糖皮质激素诱导GRα外源性靶基因cat表达的影响;(2)GRβ真核表达载体的构建及GRβ在HOS-8603细胞中的稳定过度表达;(3)用定量RT-PCR和Western印迹法检测糖皮质激素对HOS-8603细胞p21表达的诱导及GRβ的稳定表达对GRα内源性靶基因p21表达的影响;(4)用MPT法检测GRβ的稳定过度表达对糖皮质激素抑制HOS-8603细胞增殖作用的影响;(5)GRβ对糖皮质激素诱导HOS-8603细胞AKP(成骨细胞分化标志酶)活性的影响.结果:(1)GRβ抑制GRα外源性靶基因cat的表达,且具有剂量依赖性特点;(2)GRβ抑制GRα内源性靶基因p21的表达;(3)GRβ的稳定过度表达降低糖皮质激素抑制HOS-8603细胞增殖的作用;(4)GRβ的稳定过度表达抑制糖皮质激素对HOS-8603细胞AKP活性的诱导.结论:糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α的功能有抑制作用,糖皮质激素受体β可能是糖皮质激素受体α的内源性抑制因子.
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siRNA干扰IL－13Rα2表达对人肺成纤维细胞TGF－β表达的影响
目的：比较观察siRNA沉默IL－13Rα2基因前后人肺成纤维细胞（ HFL） IL－13Rα1、IL－13Rα2和TGF－β的表达情况，探讨IL－13Rα2与TGF－β和纤维化之间的关系。方法：不同浓度的IL－13外源性刺激HFL细胞，real－time PCR检测siRNA瞬时转染沉默IL－13Rα2基因前后IL－13Rα1、IL－13Rα2和TGF－β的mRNA表达量的变化；细胞免疫荧光标记观察IL－13Rα2和TGF－β的荧光蛋白的表达水平。结果：IL－13外源性刺激能增强HFL细胞IL－13Rα2的表达，其表达量随IL－13浓度的增加而增高，但IL－13Rα1和TGF－β的表达量则无明显变化；siRNA干扰后IL－13Rα2 mRNA的表达量显著下降，TGF－β的表达量明显增高（ P＜0．05）；细胞免疫荧光标记亦显示，沉默后IL－13Rα2蛋白表达显著降低，而TGF－β的表达量升高。结论： IL－13Rα2很可能通过竞争性抑制IL－13Rα1与IL－13结合，进而抑制IL－13所致的纤维化作用。
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AMP－AMPK－AS160信号通路在黄芪多糖刺激L6成肌细胞葡萄糖摄取中的作用
目的：探讨黄芪多糖（ APS）对L6成肌细胞葡萄糖摄取的刺激作用及其机制。方法：培养L6成肌细胞，采用2－脱氧－［3 H］－D－葡萄糖法检测细胞的葡萄糖摄取，高效液相色谱法检测细胞内的AMP含量， Western blotting法检测腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和160 kD的Akt底物（AS160）的磷酸化水平；脂质体法瞬时转染4P突变型AS160（AS160－4P）质粒。结果：APS呈时间和浓度依赖性地刺激L6成肌细胞葡萄糖摄取，但可被AMPK抑制剂Compound C或转染AS160－4P质粒所抑制；APS可以提高细胞内的AMP含量；APS可以提高AS160的磷酸化水平，且这一作用可被Compound C抑制。结论：APS可以刺激L6成肌细胞的葡萄糖摄取，其机制可能与活化AMP－AMPK－AS160信号通路有关。
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不同tau亚型对神经细胞增殖的影响及机制研究
目的：研究了不同tau亚型对神经细胞增殖的影响及机制。方法：采用脂质体法分别将6种表达tau亚型的质粒瞬时转染N2a细胞，pEGFP空载体为对照。48 h后Western blot检测转染效率。48 h后用CCK－8检测细胞活性，BrdU掺入法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期。结果：与对照质粒比，表达1N3R－tau降低细胞活性，其BrdU阳性细胞数显著减少，提示1N3R－tau亚型可抑制细胞增殖。进一步的研究显示，表达1N3R－tau亚型诱导细胞周期S期阻滞，促使Cyclin E从胞核向胞浆转移。结论：过表达1N3R－tau亚型通过诱导cyclin E从胞核向胞浆转移，使细胞出现S期阻滞，从而抑制细胞增殖。
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IL－37抑制缺氧诱导的细胞凋亡的研究
目的：IL－37是白细胞介素－1家族成员，可调节血管生成，抑制肿瘤生长，对I／R损伤、炎症性肠道疾病和类风湿性关节炎等有保护作用。由于炎症反应能导致组织氧供应失衡，使局部组织细胞处在缺氧的微环境，因而，本实验主要针对IL－37是否在缺氧环境中发挥细胞保护作用进行研究。方法：分别给予1％和21％ O2培养上皮细胞。通过瞬时转染使细胞过表达IL－37，24 h后提取RNA和蛋白质。利用RT－PCR检测IL－37、TNF－α、IL－1、IL－6和CXCL2 mRNA的表达；利用Western blot 检测PARP的总蛋白和剪切蛋白的表达量。利用流式细胞术检测细胞凋亡。结果：缺氧时，细胞凋亡增加1．63倍，内源性IL－37和促炎因子mRNA水平的表达均显著增加，PARP总蛋白表达增加2．1倍。 IL－37可显著抑制缺氧诱导的细胞凋亡，并显著降低IL－6和CXCL2的mRNA水平，但其对可以修复DNA的PARP总蛋白的表达在缺氧时无明显作用， caspase－3剪切的PARP也无显著差异。结论：在缺氧环境中，IL－37作为固有免疫调节因子，可以通过抑制细胞凋亡，炎性因子IL－6和CXCL2的表达抑制局部的过度炎症反应。但TNF－αmRNA的表达和caspase－3剪切底物PARP的剪切蛋白无显著变化，提示IL－37不是通过减
少TNF－α的表达、进而减少FADD和caspase－8的募集、再减少活化caspase－3的途径抑制细胞凋亡的。其具体抑制凋亡的机制有待进一步研究。 -
黄芩总黄酮对甲型流感病毒核蛋白表达的影响
目的 探讨黄芩总黄酮(Total flavonoids of Scutellaria baicalensis Georgi,TFSB)对甲型流感病毒核蛋白(NP)的干预作用.方法 本实验设HeLa细胞组、pcDNA3.1(+)空载体组、pcDNA3.1(+)、NP组、TFSB组,其中pcDNA3.1(+)空载体组、pcDNA3.1(+)/NP组分别通过瞬时转染将重组质粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)/NP转染到HeLa细胞中；TFSB组在将重组质粒pcDNA3.1(+)、NP转染到HeLa细胞的同时使用TFSB进行药物干预.转染48 h后,采用胶体金免疫层析试纸法测维持液中NP的表达,荧光定量RT-PCR测NP基因起始核酸量.结果 胶体金免疫层析试纸法测NP表达示:pcDNA3.1(+)/NP组、TFSB组为阳性；荧光定量RT-PCR示:pcDNA3.1(+)/NP组和TFSB组NP基因起始拷贝数分别为(8.90±2.53)×106 copies/μ1、(6.15±1.49)×106 copies/μl,采用t检验进行统计学分析:差异无统计学意义(P＞0.05).结论 黄芩总黄酮对甲型流感病毒NP基因和NP的表达没有影响.
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NF-κB信号通路在七方胃痛颗粒调控H.pylori感染人胃腺癌细胞TFF1表达中的作用
目的:探讨核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路在七方胃痛颗粒对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染人胃腺癌细胞(human gastric cancer cells,AGS)三叶肽因子1(trefoil factor family 1,TFF1)表达中的作用.方法:采用实时荧光定量PCR观察H.pylori感染AGS TFF1 mRNA的表达;双荧光报告基因系统检测质粒载体TFF1(Wt)野生株和多个变异株报告基因瞬时转染AGS,TFF1基因转录情况及七方胃痛颗粒的干预效果,并分析TFF1启动子区NF-κB蛋白结合位点碱基序列区间;凝胶阻滞电泳(EMSA)确定TFF1启动子区NF-κB蛋白结合位点和七方胃痛颗粒对其的作用.结果:药物血清组TFF1mRNA表达及TFF1表达与其它组比较差异有统计学意义(P<0.05),TFF1(Wt)野生株和变异株基因转录表达较空白组均显著增加(P<0.01),TFF1(A)变异株基因表达显著低于Wt株(P<0.01),和其他TFF1变异株相比,差异有统计学意义(P<0.05),变异株之间比较差异无统计学意义(P>0.05);七方胃痛颗粒可降低NF-κB的DNA活性.结论:七方胃痛颗粒上调H.pylori感染AGS TFF1的表达,可能是通过NF-κB信号通路实现的.
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特异siRNA沉默Slug基因抑制体外胰腺癌AsPC-1细胞生长的实验研究
目的:研究Slug基因沉默对胰腺癌AsPC-1细胞增殖、凋亡的影响.方法:构建靶向抑制Slug的siRNA表达载体,瞬时转染AsPC-1细胞.采用RT-PCR和Westernblot法检测细胞Slug蛋白,MTT.检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI了解细胞凋亡的变化.结果:成功构建了pGenesil-l-Slug-siRNA(pSlug-siRNA)和pCenesil-l-Neg-siRNA(pNeg-siRNA)表达质粒.pSlug-siRNA瞬时转染AsPC-1细胞72 h后,细胞slug表达及生长受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加.结论:Slug-siRNA抑制Slug表达,促进As-PC-1细胞凋亡并抑制细胞的增殖.
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乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达
目的:构建乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)相关抗原基因真核表达载体,检测各抗原基因在体外真核细胞中的表达情况.方法:以含有1.3倍的HBV全基因组序列的质粒PcDNA3.1-HBV为模板,PCR扩增HBV的各抗原基因片段,通过连接至中间克隆载体Peasy-T1-Simple,酶切及测序鉴定正确后,再将目的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建包含HBV抗原基因的重组表达质粒pcDNA3.1(+)-HBs,pcDNA3.1(+)-HBe,pcDNA3.1(+)-HBc.阳性克隆用限制性内切酶酶切鉴定正确后用脂质体2000分别瞬时转染HepG2细胞,同时转染LO2细胞作为对照,Western blot和免疫荧光技术分别检测各抗原基因产物在细胞内的表达.结果:成功扩增出HBV各抗原基因片段,通过酶切测序鉴定证明成功构建了包含HBV抗原基因的重组表达质粒pcDNA3.1(+)-HBs,pcDNA3.1(+)-HBe,pcDNA3.1(+)-HBc,Western blot和免疫荧光检测到目的蛋白在转染细胞中的正确表达.结论:本实验成功构建包含HBV抗原基因的真核表达载体,并能在体外真核细胞中表达相关抗原蛋白,为进一步研究各抗原的生物学功能奠定了实验基础.
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磷脂酶Cβ1过表达对葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响
目的 观察过表达磷脂酶Cβ1(phospholipaae C β1,PLCβ1)对葡萄糖刺激胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)的影响.方法 ①设定葡萄糖浓度梯度:10、20、40、80、100 mmol/L,分别刺激INS-1细胞40 min,检测细胞培养上清液中胰岛素含量,确定适的葡萄糖刺激浓度;设定时间梯度:20、40、60、80、120 min,以适葡萄糖浓度刺激,检测胰岛素含量,确定适的刺激时间.②以适葡萄糖浓度刺激INS-1细胞适当时间后,RT-PCR检测PLCβ1表达变化.③构建PLCβ1真核表达载体(PCMV-HA-PLCβ1),转染INS-1细胞,Western blot检测INS-1细胞中PLCβ1蛋白的表达.④收集转染后INS-1细胞培养上清液,检测胰岛素含量.结果 用40 mmol/L葡萄糖刺激60 min,INS-1细胞的胰岛素分泌量大;RT-PCR观察刺激后PLCβ1表达显著升高;过表达PLCβ1的INS-1细胞培养上清液中胰岛素含量为(1.906±0.080)ng/ml,较转染PCMV-HA载体的对照组(0.740±0.091)ng/ml显著升高(P<0.01).结论 过表达PLCβ1显著增加INS-1细胞的胰岛素分泌,提示PLCβ1可能参与GSIS信息传递.
关键词： 磷脂酶Cβ1 葡萄糖刺激胰岛素分泌 过表达 胰岛素 瞬时转染 -
多聚嘧啶序列结合蛋白抑制HBV转录后调节元件的功能
目的 探讨多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB)对乙型肝炎病毒转录后调节元件(HBV posttranscriptional regulatory element,HPRE)功能的影响.方法 采用pDM138-HPRE CAT(chloramphenicol acetyl transferase)报告体系,通过质粒瞬时转染细胞的方式来探讨PTB对HPRE功能的影响.结果 CAT活性检测表明:PTB的过表达使HPRE介导的CAT表达活性下降,并且呈剂量依赖性.当去除质粒上游剪接供体位点时,PTB仍然可以降低CAT的活性.结论 PTB抑制HPRE的功能,并且这种抑制作用不依赖于上游剪接供体位点.
关键词： 乙型肝炎病毒 多聚嘧啶序列结合蛋白 HBV转录后调节元件 CAT检测 瞬时转染 -
诱导型一氧化氮合酶基因转染兔牙周膜细胞的瞬时表达检测
目的 检测含有人诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的重组质粒pEGFP-iNOS体外转染兔牙周膜细胞后的瞬时表达情况,为动物牙周局部导入外源性iNOS基因奠定实验基础.方法 通过脂质体介导将重组真核质粒pEGFP-iNOS转染兔牙周膜细胞,在荧光显微镜下观察瞬时转染情况.并在转染后12 h与48 h,应用实时定量PCR检测iNOS基因的转录,Western免疫印迹技术检测iNOS蛋白表达.设空质粒转染组和空白组为对照.结果 重组质粒转染后12 h即可观察到荧光蛋白的表达,pEGFP-iNOS转染组细胞中有iNOS mRNA转录及iNOS蛋白的表达.结论 iNOS基因成功导入兔牙周膜细胞,瞬时转染后可在基因和蛋白水平检测到外源性基因的表达.在兔牙周组织导入iNOS基因从而诱导NO生成是具有可行性的.
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阳离子脂质体介导BEL-7402、QBC、BXPC-3瞬时转染率比较
目的: 探讨阳离子脂质体瞬时转染消化道肿瘤细胞的差异.方法: 采用pEGFP-N1质粒为报告基因,流式细胞仪技术(FACS)来分析阳离子脂质体介导3种细胞的瞬时转染率,设立裸质粒的转染为空白对照组,将转染的细胞在倒置荧光显微镜下观察并摄像;采用MTT法检测3种细胞的倍增时间,并绘制细胞生长曲线;分析细胞倍增时间和阳离子脂质体介导的转染之间的联系.结果: BEL-7402,QBC,BXPC3 3系细胞阳离子脂质体介导的瞬时转染率分别为26.99%、2.25%和30.36%,BEL-7402和BXPC-3同QBC细胞有显著差异(P＜0.05);3个细胞系裸质粒的转染率分别为0.22%、0.29%和0.18%,3者之间差异无显著性(P＞0.05);BEL-7402、QBC、BXPC-3的倍增时间分别是34.48 h、64.94 h和26.29 h,QBC细胞同BEL-7402及BXPC-3相比差异有显著性(P＜0.05).结论: 阳离子脂质体对高度恶性的消化道肿瘤细胞有更好的转染效率.
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IL-12基因不同亚基真核表达载体的构建及表达
目的: 克隆并构建含人白介素12(hIL-12)基因p35、 p40不同亚基的真核表达载体, 瞬时转染真核细胞并诱导IL-12的表达.方法: 人单核细胞白血病细胞株(THP-1)和人白血病细胞株(HL-60), 经DMSO、 IFN-γ和LPS诱导后, 用RT-PCR及SOE PCR扩增IL-12 p40、 p35及p40-p35融合基因; 并构建pcDNA-p35、 pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达载体.以3种重组质粒分别瞬时转染COS-7细胞后, 通过RT-PCR及ELISA法检测目的基因的表达.结果: 经诱导后, 从HL-60细胞中扩增到IL-12 p40和p35基因片段; 但从THP-1细胞中只扩增到p35基因片段, 未能扩增到p40基因片段; 经酶切鉴定、 PCR扩增及序列测定表明pcDNA-p35、 pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达质粒构建成功; 并在COS-7细胞中可检测到IL-12的表达.结论: 含hIL-12基因不同亚基的真核表达质粒的成功构建, 对进一步研究IL-12在免疫应答中的调节作用以及作为免疫佐剂改善BCG免疫保护效果的研究奠定了基础.
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Red蛋白抗血清的制备及其亚细胞定位研究
目的:在大肠杆菌中分别表达3种Red蛋白,并制备兔抗Red蛋白的抗体.方法:从λ噬菌体基因组中,通过PCR分别扩增gam、bet和exo DNA的全长序列.将PCR产物克隆入非融合表达载体pDH2中,构建Red蛋白的高表达工程菌.通过温敏诱导表达3种Red蛋白(Bet、Exo和Gam),用PACTE薄层扫描检测目的蛋白含量.用3种Red蛋白分别免疫家兔制备抗血清,并以Western blot鉴定抗体的效价和特异性.结果:大肠杆菌中表达的Bet、Exo和Gam蛋白,分别占菌体总蛋白量的40.3%、49.2%和73.4%.3种抗血清的效价约为1:2000.Western blot分析显示抗血清具有较好的特异性.结论:成功地获得Bet、Exo和Gam3种蛋白,并分别制备了相应的抗血清.使用这3种抗血清,检测了3种蛋白在真核细胞中的表达和定位,为研究Red蛋白的同源重组奠定了基础.
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RNA干涉法观察成纤维细胞生长因子18对成牙本质样细胞涎磷蛋白表达的影响
目的:通过RNA干涉的方法研究成纤维细胞生长因子18(Fibroblast Growth Factor18 ,FGF18)对成牙本质样细胞中牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)表达的影响.方法:RNA干涉质粒pH1-siFGF18瞬时转染成牙本质样细胞MDPC-23,RT-PCR检测FGF18和DSPP的表达,观察FGF18低表达对DSPP表达的影响.结果:瞬时转染RNA干涉质粒后,MDPC-23细胞内FGF18表达明显减少,与此同时DSPP的表达量也明显减少.结论:FGF18可以调控DSPP的表达,影响成牙本质细胞的分化.
关键词： 成纤维细胞生长因子18 牙本质涎磷蛋白 MDPC-23 RNA干涉 瞬时转染 -
同源异型盒基因msx1 cDNA表达型质粒的构建及其表达
目的:克隆小鼠同源异型盒基因msx1 cDNA,构建msx1真核表达载体,并在细胞内瞬时表达.方法:应用PCR克隆技术,克隆小鼠msx1全编码序列;利用基因重组技术,将msx1全编码cDNA序列导入pEGFP-N1绿色荧光蛋白表达型质粒.将构建好的表达型质粒转染入MDPC-23细胞内瞬时表达.结果:成功克隆Balb/c胎鼠msxI全编码cDNA序列,并将其成功地导入pEGFP-M表达型质粒;经测序分析,msx1全编码序列与GenBank中的相应序列一致;所构建质粒在MDPC-23细胞内成功表达,BMP2刺激后MSX1的表达部位由胞浆转至胞核.结论:成功克隆小鼠msx1 cDNA序列,所构建的msx1-pEGFP-M质粒在成牙本质细胞内成功表达MSX1.
