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脂多糖诱导牛肾细胞β-防御素-5 mRNA表达的可能机制
β-防御素是可被炎性因子和细菌产物诱导产生的天然抗菌肽,对细菌、真菌、支原体、衣原体、螺旋体及病毒等微生物均有很强的杀伤活性[1].脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,是诱发炎症的主要致病因子,细菌在生长繁殖过程中和死亡后均可释放LPS,激发机体非特异性免疫[2,3].研究发现,β-防御素-5(BNBD5)在患子宫内膜炎的奶牛子宫内膜组织中表达显著升高,可能是LPS诱导机体免疫应答,并促进了机体BNBD5的表达.尚无证据表明,BNBD5是否通过TLR4/NF-κB信号通路表达.因此,我们有必要对LPS诱导细胞BNBD5表达的信号通路进行研究.为探索BNBD5表达的分子调控机制提供理论基础.
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根皮素对人γδT细胞杀伤胃癌SGC-7901细胞的影响及机制探讨
目的:探讨根皮素对人γδT细胞杀伤胃癌SGC-7901细胞的影响及其机制.方法:IPP法扩增人外周血γδT细胞,不同浓度的根皮素作用于γδT细胞及胃癌SGC-7901细胞48小时后,MTT法检测γδT细胞及SGC-7901细胞的生长曲线,FCM检测γδT细胞PFP及GraB的表达;LDH释放法检测γδT细胞对SGC-7901细胞的杀伤活性;Western blot检测γδT细胞中Wnt3a的表达情况.结果:IPP作用10天后,γδT细胞比例由3.12%增加到79.6%.与对照组比较,浓度2.35～18.75 μg/ml的根皮素作用后γδT细胞的增殖率显著提高(P＜0.05),75 μg/ml根皮素对SGC-7901细胞生长抑制率显著提高(P＜0.05),且2 35～75 μg/ml根皮素作用后的γδT细胞对SGC-7901细胞的杀伤活性明显增强(P＜0.05),γδT细胞中PFP、GraB及Wnt3a的表达较对照组显著增加(P＜0.05).结论:根皮素能够增强γδT细胞对SGC-7901细胞的杀伤作用,其机制可能与根皮素促进γδT细胞的增殖,提高γδT细胞PFP、GraB表达及活化Wnt信号通路有关.
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NK细胞的高效扩增及其对体外肿瘤模型的杀伤效果研究
目的:高效扩增NK细胞,并确定其对不同肿瘤的杀伤作用,为临床应用提供参考.方法:从成人外周血中分离PBMCs并利用表面表达4-1BBL、IL-15和IL-21的K562滋养细胞对其进行共刺激培养,15 d后计数并检测CD3-CD56+细胞纯度;利用间接免疫荧光及Real-time PCR方法检测NK细胞Granzyme B及Perforin 表达变化的同时检测其对肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌的杀伤作用,确定其对不同肿瘤的杀伤效果.结果:扩增15 d后,细胞数量高于110亿,CD3-CD56+比例达95%以上;培养后的NK细胞高表达Granzyme B、Perforin,且对A549的杀伤效果(E∶T=10∶1)约为90%,同时对其他肿瘤细胞(E∶T=10∶1)的杀伤效果由强到弱的顺序为:胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、肝癌(P<0.05);NK细胞对宫颈癌、肝癌、胰腺癌的杀伤效果呈现一定的时间依赖性.结论:此方法可以扩增出高数量、高纯度的NK细胞,同时该NK细胞具有高效杀伤多种肿瘤细胞的能力.
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γδT细胞对肝癌细胞杀伤作用的实验研究
目的:探讨体外诱导培养的γδT细胞对人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用.方法:分离人外周血淋巴细胞,用anti-human TCRγ/δ、IL-2等诱导γδT细胞,培养5天时在实验组γδT细胞中加入肿瘤抗原HSP70,再培养1天后,用流式细胞仪检测γδT细胞表型,然后分别与人肝癌细胞SMMC-7721共同培养,用MTT法检测其对SMMC-7721的杀伤活性.结果:培养6d的γδT细胞表达率62.10％,与肿瘤抗原HSP70共同培养的γδT细胞表达率为71.10％,这两组γδT细胞与肝癌细胞SMMC-7721按50:1培养24h后,杀伤活性分别达到(82.68 ±8.68)％和(90.99±3.09)％,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:用anti-human TCRγδ、IL-2诱导培养的γδT细胞对肝癌细胞SMMC-7721有显著的杀伤作用,加入肿瘤抗原HSP70培养后的γδT细胞具有更强的杀伤活性.
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抗原负载的DC及CIK对结肠癌细胞SW1116杀伤活性的比较研究
目的 探讨树突状细胞(dendritic cells,DCs)以及CIK(cytokine induced cells)细胞对结肠癌细胞SW1116的体外杀伤作用,为结肠癌的治疗提供新的治疗手段.方法 用IL-4、GM-CSF、TNFα等细胞因子诱导培养DC细胞,并用抗原进行负载;用CD3Ab、IFNγ、IL -2、IL-1α等诱导培养CIK细胞,分别用抗原负载的DC、CIK细胞对人结肠癌细胞SW1116进行体外杀伤活性实验,比较两者对SW1116的杀伤效果.结果 抗原负载的DC和CIK对SW1116均有较强的杀伤效果,分别达到64.10%和67.70%.结论 抗原负载的DC及CIK对人结肠癌细胞SW1116在体外具有较强的杀伤作用.
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杀伤细胞受体KIRs的研究进展
自然杀伤(Natural killer,NK)细胞是骨髓来源的大颗粒淋巴细胞,NK细胞不同于T、B淋巴细胞,它不表达抗原特异性受体,其功能的发挥主要依赖于NK细胞能够表达多种能与MHC或非MHC配体结合的免疫球蛋白样受体(Killerim munoglobulin-like receptors,KIRs)KIRs为免疫球蛋白超家族成员,表达于NK细胞和某些T细胞亚群.KIRs包括抑制型和激活型受体,其通过识别表达于靶细胞上的人类白细胞抗原1(MHC-1)类分子,调节NK细胞的杀伤活性,在自身免疫性疾病、妊娠、移植、肿瘤免疫等生理病理过程中起重要的作用.
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树突状细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞增殖和抗白血病作用影响的研究
目的 探讨树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平以及抗白血病细胞作用的影响.方法 健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照.用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)的水平.结果 DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P＜0.05);DC、CIK细胞共培养后,CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P＜0.05);共培养3d,DC-CIK细胞上清液中IL-12、INF-γ分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P＜0.01,P＜0.05);在5:1-40:1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P＜0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关.结论 DC增加CIK细胞的增殖能力和抗白血病活性.可作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略.
关键词： 树突状细胞 细胞因子诱导的杀伤细胞 共培养 白血病 杀伤活性 -
枸杞多糖在白血病患者中的应用及对HL-60和NK细胞杀伤活性的影响
目的 探讨枸杞多糖在白血病患者中的应用及对人前髓细胞HL-60表面靶细胞表面相应配体(MICA)蛋白表达水平和自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响及机制.方法 取白血病患者HL-60细胞,随机分为观察1组、观察2组及观察3组,分别放入浓度为6、8、10 mg/ml枸杞多糖共同培养,未经枸杞多糖作用的30例白血病患者HL-60细胞为对照组,采用流式细胞仪测定4组细胞表面MICA蛋白表达水平.将4组获得的溶液与NK细胞相互混合,20 h后采用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测NK细胞对4组HL-60细胞的杀伤活性进行测定.结果 观察1组MICA表达率显著低于观察2组、观察3组(P<0.05);观察1组、观察2组、观察3组MICA表达率高于对照组(P<0.05);随着靶细胞、效应细胞比的不断增加,4组NK细胞杀伤活性均出现上升趋势;观察1组、观察2组及观察3组NK细胞杀伤活性高于对照组(P<0.05);观察3组NK细胞杀伤活性,高于观察1组、观察2组(P<0.05).结论 白血病患者体内HL-60细胞在枸杞多糖的孵育下能提高细胞MICA表达率,且呈浓度正相关性.同时,枸杞多糖能提高机体内NK细胞的杀伤活性,能清除微小病灶.
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细胞因子对人食道鳞癌细胞的体外杀伤作用
目的 探讨细胞因子活化杀伤(CIK)细胞对人食道鳞癌细胞(ESCC) Ecap-109的体外杀伤作用.方法 先用细胞因子诱导CIK细胞的生成并进行表型鉴定,后与人食道鳞癌细胞Ecap-109按不同比例进行共同培养,MTT法测定CIK对Ecap-109的杀伤活性.结果 不同比例的CIK细胞对Ecap-109均有明显的杀伤效果,高可达94.8％.结论 CIK细胞对人食道鳞癌细胞Ecap-109具有明显的杀伤作用.
关键词： 细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞 食道癌细胞 杀伤活性 -
流式细胞术检测CIK的免疫表型和体外杀伤活性
目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)的免疫表型和体外杀伤活性.方法:从健康人外周血分离淋巴细胞,经过IFNγ、CD3McAb、IL-2诱导并培养,获得大量的CIK.采用流式细胞术检测CIK的表型;以CFSE标记靶细胞来区分效应细胞,再以PI染色,用FACS检测靶细胞的死亡率.结果:CIK于第22天达到增殖高峰,并高度表达CD3、CD11a、CD54和HLA-DR;中度表达CD3/CD56、CD25、CD28、CD69和FasL;CD16表达不增加.CIK对肿瘤细胞K562、 HL-60、Hela、SMMC7721和A375均表现出杀伤活性,其中对K562、HL-60、Hela 3种细胞的杀伤作用较强;而对SMMC7721、A375的作用不明显.结论:细胞因子IFNγ、CD3McAb和IL-2体外诱导的单个核细胞具有强大的增殖力和杀伤活性.
关键词： 细胞因子诱导的杀伤细胞 免疫表型 杀伤活性 流式细胞术 -
激活骨髓和淋巴因子激活的杀伤细胞生物活性的实验研究
目的:证实激活骨髓(Activated bode marrow,ABM)具有与淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞不同的生物学效应.方法:应用重组白细胞介素-2(rIL-2)、抗CD3单抗体外激活骨髓和外周血单个核细胞,以MTT比色分析法测定ABM、LAK细胞的杀伤活性,采用甲基纤维素半固体培养法进行粒-巨噬细胞系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(BFU-E)培养.结果:rIL-2+抗CD3单抗激活的ABM组杀伤活性强(65.8±9.2)%,rIL-2激活的ABM组次之为(56.3±7.9)%,活性强于相同条件下的LAK组,两组差异具有显著性(P＜0.01).增殖倍数与相同条件下的LAK细胞相比差异亦具有显著性.体外激活3～5 d的ABM与同期培养的未激活的骨髓细胞相比BFU-E、CFU-GM形成率差异无显著性(P＞0.05),LAK细胞则不具有造血祖细胞活性.结论:ABM的杀伤活性和增殖效应明显强于LAK细胞,且能保持造血祖细胞活性,抗CD3单抗能够促进rIL-2诱导的ABM抗肿瘤活性和增殖效应,不损伤造血祖细胞活性,是优于LAK细胞的过继免疫疗法.
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表达HIV-1结构蛋白靶细胞的制备及鉴定
Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)疫苗的研究是当前控制艾滋病广泛流行的主要任务.大量的临床研究表明,除了中和抗体外,细胞毒性T淋巴细胞(GTL)杀伤活性是防止HIV-1感染的一个重要的保护性免疫参数,也是衡量疫苗免疫效果的一个极其重要的指标.
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金丝桃苷增强共刺激细胞杀伤胃癌细胞MKN-45的研究
目的 探讨金丝桃苷对共刺激细胞杀伤胃癌细胞MKN-45的影响及可能机制.方法 健康者外周血单个核细胞(PBMC)在体外诱导为共刺激细胞,常规传代培养胃癌细胞MKN-45.给予不同浓度金丝桃苷诱导24h、48 h、72 h,CCK8法和MTT法分别检测人共刺激细胞和胃癌细胞MKN-45增殖情况;诱导72 h,乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定共刺激细胞杀伤胃癌细胞株MKN-45的活性;流式细胞术(FCM)检测共刺激细胞穿孔素、颗粒酶B(Grab)、CD107a、IFN-γ的表达变化;Western blot检测共刺激细胞信号调节蛋白(Bcl-2、p-AKT、p-ERK 1/2、β-catenin)的表达变化.结果 培养10天共刺激细胞表达率达到38.85％;低浓度金丝桃苷促进共刺激细胞生长并呈时间依赖性,其中金丝桃苷浓度为0.8tμg/mL诱导72 h增殖率达到(43.73±2.99)％,与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);浓度＞25 μg/mL对MKN45有剂量依赖性抑制作用,抑制率高达57.3％,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05);金丝桃苷诱导72 h,浓度在0.8μg/mL时对MKN-45的杀伤活性增强作用大,杀伤活性为(48.13±2.02)％,共刺激细胞穿孔素、Grab、CD107a和IFN-γ的表达明显增加,表达率分别为(85.74±2.89)％、(87.56±3.23)％、(89.66±2.42)％和(82.29±3.95)％,信号调节蛋白Bcl-2、p-AKT、p-ERK1/2、β-catenin的表达也不同程度的增加,灰度值计算表达率分别为(71.86±1.16)％、(14.62±0.84)％、(17.44±1.51)％、(15.12±1.55)％,与对照组比较均具有统计学意义(P＜0.05).结论 金丝桃苷在一定浓度范围内能促进共刺激细胞增殖、抑制胃癌细胞MKN-45的生长,并增强共刺激细胞对胃癌细胞MKN-45的杀伤活性,其机制可能与活化Bcl-2、p-AKT、p-ERK1/2、β-catenin,上调共刺激细胞穿孔素、GraB、CD107a、IFN-γ的表达有关.
关键词： 金丝桃苷 共刺激细胞 胃癌细胞MKN-45 杀伤活性 -
重组人纤维连接蛋白对CIK细胞增殖和杀伤活性的影响
目的：研究并探讨重组人纤维连接蛋白（ RetroNectin ， RN ）对细胞因子诱导的杀伤细胞（ CIK）增殖、免疫特性及对人类K562、LOVO细胞杀伤活性的影响。方法提取患者外周血单个核细胞，标本分为四组，对照组（ CIK组）：按常规方法诱导CIK增殖；C－CIK组：提前通过CD3 Ab包被诱导；R－CIK组：提前通过RetroNectin包被诱导；R＋C－CIK组：提前通过RetroNectin及CD3 Ab包被诱导，记录各组免疫效应细胞不同时间段的增殖情况。流式细胞术检测各组细胞不同时间段的免疫表型变化；并用LDH法检测各组细胞对肿瘤细胞K562、LOVO杀伤活性。结果 R＋C－CIK组细胞增殖倍数高于其他三组，差异有统计学意义（ P＜0．05）；R＋C－CIK组及R－CIK组的CD3＋CD56＋双阳性细胞所占百分比较C－CIK及CIK组高，d12和d15时有统计学差异（P＜0．05）；在效靶比20∶1和40∶1时，R＋C－CIK及R－CIK组对K562的杀伤活性高于C－CIK及CIK组，杀伤活性有统计学差异（P＜0．05），R＋C－CIK组、R－CIK组及C－CIK组细胞对结肠癌细胞系LOVO的杀伤活性高于CIK 组，有统计学差异（ P＜0．05）。结论 RetroNectin联合抗CD3MAb包被技术应用于CIK体外培养可以获得增殖率和活性更高的免疫活性细胞，是值得临床推荐的一种有效的培养方法。
关键词： 重组人纤维连接蛋白 细胞因子诱导的杀伤细胞 增殖 杀伤活性 -
水飞蓟宾增强人CIK细胞杀伤胃癌细胞株BCG-823的体外研究
为探讨水飞蓟宾对人CIK细胞杀伤胃癌细胞株BCG-823的影响及作用机制,分离健康志愿者外周血单个核细胞,体外诱导培养成人CIK细胞;收集培养扩增7d的CIK细胞,将其用不同浓度的水飞蓟宾诱导24 h、48 h、72 h,CCK-8法检测其增殖情况;流式细胞术检测CIK细胞穿孔素、颗粒酶B、CD107a和IFN-γ的表达变化及水飞蓟宾对其凋亡的影响;LDH法检测CIK细胞对胃癌细胞株BCG-823的杀伤活性.结果显示,与对照组相比,浓度为(1.6～50) μg/mL的水飞蓟宾作用CIK细胞72 h后,增殖率较对照组显著增加(P＜0.05);穿孔素、颗粒酶B、CD107a和IFN-γ的表达以及活细胞率均不同程度增加(P＜0.05);且对胃癌细胞BGC 823的杀伤活性显著增强(P＜0.05).以上实验结果提示一定浓度的水飞蓟宾对CIK细胞有促增殖作用,且能增强其对胃癌细胞株BCG-823的杀伤活性.
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水飞蓟宾对γδT细胞杀伤胃癌细胞SG-7901的影响及其机制初探
探讨水飞蓟宾对人γδT细胞杀伤胃癌细胞SGC-7901的影响及其作用机制.分离健康志愿者外周血单个核细胞,体外经多种细胞因子诱导培养为γδT细胞;收集培养、扩增7d后的γδT细胞,将其用不同浓度的水飞蓟宾诱导24 h、48 h及72 h,CCK-8法检测γδT细胞增殖情况;流式细胞术(FCM)检测γδT穿孔素(perforin,PFP)、细胞颗粒酶B(Granzyme B,Gran B)及CD107a的表达;western-blot法检测γδT细胞P-ERK1/2、Bcl 2、P-AKT、β catenin的表达;乳酸脱氢酶(LDH)法检测γδT细胞对胃癌细胞SGC-7901的杀伤活性.结果发现浓度在1.6～ 100 μg/ml的水飞蓟宾作用γδT细胞72 h后,γδT细胞增殖率较对照组显著增加(P＜0.05),且在25 μg/ml时达到高峰;将6.25～ 100 μg/ ml水飞蓟宾诱导γδT细胞72 h后,γδT细胞的PFP、Gran B及CD107a的表达以及P-ERK 1/2、Bcl 2、P-AKT、β-catenin的表达与对照组比较均不同程度增加(P＜0.05),且对胃癌细胞SGC-7901的杀伤活性显著增强(P＜0.05).以上实验结果提示一定浓度的水飞蓟宾对γεT细胞具有促进增殖作用,其机制可能与激活P-ERK1/2、Bcl 2、P-AKT及β-catenin信号通路有关.一定浓度的水飞蓟宾能够增加γδT细胞对胃癌细胞的杀伤活性,其作用机制可能与水飞蓟宾能够增加γδT细胞的穿孔素、Gran B 及CDl07a的表达有关.
关键词： 水飞蓟宾 γδT细胞 胃癌细胞SGC-7901 杀伤活性 -
白藜芦醇增强人NK细胞杀伤肺癌细胞株A-549的体外研究
研究白藜芦醇对人NK细胞体外增殖及杀伤肺癌细胞A-549的影响.用SCGM培养基体外扩增人NK细胞,10 d后用不同浓度的白藜芦醇作用于NK细胞48 h后,MTT法测生长曲线,流式细胞仪检测NK细胞表面穿孑L素、颗粒酶B及CD107a的表达;LDH法检测NK细胞对肺癌细胞株A-549的杀伤活性.结果发现,培养10d后NK细胞纯度达到68％左右,不同浓度白藜芦醇处理NK细胞48 h后,白藜芦醇在浓度0.05-12.5 μmol/L可以促进NK细胞的生长,并增加NK细胞表面颗粒酶B、穿孔素及CD107a的表达,对肺癌A-549细胞的杀伤活性在白藜芦醇浓度为0.75 μmol/L显著高于对照组.以上实验结果提示,白藜芦醇在一定浓度下能促进NK细胞的生长,且增加对肺癌细胞株A-549的杀伤活性.
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聚肌胞苷酸对肺癌细胞A549生长和功能影响
探讨聚肌胞苷酸(polyI:C)对肺腺癌细胞(A549)增殖、周期、凋亡及γδT细胞对其杀伤活性的影响.用MTT法检测经polyI:C处理后的γδT细胞和A549的生长抑制率；流式细胞仪检测经polyI:C处理后A549 TLR3变化及对细胞周期和凋亡的影响；用乳酸脱氢酶释放法测定γδT细胞对经polyI:C诱导后的A549杀伤活性.肺癌细胞株A549经25μmol/L polyI:C诱导24 h后细胞凋亡率为(39.44%±4.11%),明显高于对照组凋亡率(28.72%±1.41%)(P＜0.05)；细胞周期有一定的改变；肿瘤细胞上TLR3表达没有明显变化.A549在25 μmol/L PolyI:C处理后,其与γδT细胞在效靶比为1∶80时杀伤活性明显高于对照组.polyI:C能抑制A549细胞生长,增加γδT细胞对诱导后的A549细胞杀伤敏感性.
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γ氨基丁酸对人IL-2和IFN-γ诱导的杀伤细胞的作用研究
为研究γ氨基丁酸(GABA)及A受体激动剂(THIP)对人细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)的增殖、T细胞亚群和杀瘤活性的影响和作用机制;在体外用不同浓度的GABA和THIP与人CIK细胞作用后,用MTT比色法和流式细胞仪(FCM)以及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测人CIK细胞的增殖能力、T细胞亚群和杀伤活性的变化.结果显示,GABA能显著的抑制CIK细胞的生长(P＜0.01),并具有浓度依赖性,THIP对GABA的抑制细胞增殖有明显促进作用;GABA显著降低CIK细胞表面分子CD28分子的表达,降低CD8+T细胞的百分比,抑制CIK细胞对人结肠癌细胞株SW480的杀伤活性,THIP能够增强GABA的作用.上述结果提示,GABA能显著抑制CIK细胞的增殖,降低其细胞表面CD28分子的表达,降低CD8+T细胞的百分比,抑制CIK细胞的杀伤活性,这些作用主要是通过T淋巴细胞上的GABAA受体介导.
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雷公藤内酯醇对小鼠腹腔巨噬细胞杀伤活性的影响
雷公藤内酯醇(triptolide,TP)是从卫矛科雷公藤属木质藤本植物雷公藤(tri-pterygium wilfordii hookf)中分离到的二萜内酯化合物,又称雷公藤甲素.近年的研究相继发现TP有抗炎、抗生育、抗肿瘤、抗菌免疫抑制活性[1].但其在免疫抑制过程中对巨噬细胞杀伤活性的影响却未见报道.本文以小鼠腹腔巨噬细胞为细胞模型,观察了TP对其杀伤活性的影响,旨在为进一步研究TP的药理作用提供实验基础.
