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在非小细胞肺癌中急、慢性乏氧标记物HIF-1α、GLUT1表达的临床意义
目的:探讨急、慢性乏氧标记物(HIF-1α、GLUT1)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达,及其与NSCLC患者临床病理特征和预后的关系.方法:应用HIF-1α和GLUT1抗体对46例NSCLC组织进行免疫组化染色,检测两者表达水平,分析其与NSCLC患者临床病理特征和预后的关系.结果:HIF-1α与GLUT1在NSCLC中的阳性表达率分别为58.70%(27/46)和39.11%(18/46),r=0.492(P=0.001).HIF-1α表达与年龄、性别、肿瘤大小、分期、淋巴结转移、组织学类型和分化程度均无显著相关,而GLUT1与淋巴结转移(P=0.021)和鳞癌(P=0.001)密切相关.Kaplan-Meier生存分析,GLUT1阳性的NSCLC患者术后无病生存率低于阴性患者(P=0.039),而HIF-1α与总生存率、无病生存率均无关.结论:NSCLC患者肿瘤组织中同时存在急、慢性乏氧,其无病生存率主要与慢性乏氧有关.
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缺氧诱导因子活性的调节
缺氧诱导因子(HIF-1)是迄今为止发现的唯一的一个特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子,是专一调节氧稳态的关键介质.在缺氧条件下,HIF-1活化编码促红细胞生成素、血管内皮生成因子等基因的转录,这些基因的蛋白产物增加氧的运输及对缺氧的适应性反应.目前认为,HIF-1活化是细胞低氧应答的关键环节,受胞浆多种蛋白质的精细调节,HIF-1与这些蛋白质构成细胞内低氧应答系统.本文主要综述近两年在HIF-1活性调节方面的进展.
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去甲肾上腺素对缺氧心肌细胞钙通道的影响
目的:研究去甲肾上腺素(NE)对缺氧心肌细胞钙通道的影响.方法:运用全细胞膜片钳记录技术检测NE对缺氧豚鼠心肌细胞钙通道电流(ICa)的影响.结果:NE(1×10-8mol/L)可明显增加缺氧及缺氧/再灌注心肌细胞ICa(P＜0.01,＜0.05),使缺氧心肌细胞ICa电流-电压曲线下移;在缺氧状态及缺氧/再灌注状态下,NE对心肌细胞ICa的作用差异无显著性意义(P＞0.05).结论:NE增加心肌细胞ICa为其致缺血及缺血/再灌注性心律失常机制之一.
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体外转染GFP-Bcl-2基因对低氧条件下间充质干细胞细胞周期的影响
目的 探讨低氧条件下诱导骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)向目标细胞分化为相关疾病提供了潜在的临床治疗途径.方法 将表达GFP-Bcl-2的慢病毒载体转染大鼠骨髓MSCs使其过量表达(GFP-Bcl-2-MSCs).在低氧环境下诱导其分化并检测细胞凋亡和增殖.采用流式细胞术检测MSCs和GFP-Bcl-2-MSCs在低氧条件下MSCs细胞细胞周期分布.采用Western blot检测不同组细胞cyclinD1、cyclinE及PCNA表达变化.结果 在体外低氧诱导条件下,Bcl-2基因对MSCs有明显的抗凋亡功能.与空载体对照组相比:实验组(GFP-Bcl-2-MSCs)细胞凋亡率下降27%,细胞增殖率升高了58%.但细胞周期分布及cyclinD1、cyclinE、及PCNA的表达无明显差异.结论 研究证实了抗凋亡基因修饰的MSCs(GFP-Bcl-2-MSCs)在低氧环境下可抑制细胞凋亡,但细胞周期的相关机制需要进一步研究.
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转染血红素氧合酶—1基因减轻人肝细胞体外缺氧—复氧损伤
目的 探讨血红素氧合酶-1重组腺病毒载体(Ad-HO-1)体外转染人肝细胞的转染效果及其对肝细胞缺氧-复氧损伤的影响.方法 取人肝细胞系L-02细胞,滴加低温保存的Ad-HO-1,分别培养24 h、48 h和72 h(24 h组、48 h组和72 h组),并以加入空载体腺病毒共培养的L-02细胞为空白对照.采用逆转录聚合酶链反应法检测各组肝细胞HO-1 mRNA的表达水平;以间接免疫荧光标记法检测各组肝细胞的HO-1表达率;在倒置荧光显微镜下观察转染24 h和72 h的肝细胞中绿色荧光蛋白(EGFP)的表达.取空白对照组肝细胞(培养48 h)和48 h组肝细胞,缺氧培养4 h后再有氧培养8 h,采用四甲基偶氮唑盐法测定两组肝细胞存活率.结果 24 h组、48 h组和72 h组HO-1 mRNA表达水平明显高于空白对照组,且随着转染时间的延长,HO-1 mRNA的表达水平逐渐升高.空白对照组HO-1的表达率为2.0%,24 h组为29%,48 h组为85.6%,72 h组为84.6%.基因转染后24 h和72 h,可以观察到L-02细胞中EGFP的表达.经历缺氧-复氧实验后,空白对照组肝细胞的存活率为(37.7±3.5)%,48 h组肝细胞的存活率为(89.4±5.2)%,二者相比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 Ad-HO-1在体外能有效的转染人肝细胞;与未转染者相比,转染肝细胞的缺氧-复氧损伤程度较轻.
关键词： 血红素氧化酶(脱环) 腺病毒科 细胞低氧 再灌注损伤 肝细胞 -
缺氧、氧损伤对肾小管上皮细胞α3整合素表达及粘附性的影响
目的观察体外培养肾小管上皮细胞缺氧、氧损伤后细胞粘附性及α3整合素的改变,为细胞粘附性改变在急性缺血性肾功能衰竭发病机制中的作用提供理论依据.方法采用化学缺氧与氧损伤模型,免疫荧光激光共聚焦显微镜观察培养人肾小管上皮细胞α3整合素分子表达及分布的改变,微管吸吮法观察细胞与基质以及细胞间粘附力的改变.结果单纯氧损伤后肾小管上皮细胞α3整合素的表达无显著改变,缺氧损伤后其极性分布减弱,缺氧-氧损伤后极性分布改变显著,这种分布改变与细胞和基质间的粘附性减弱和细胞间粘附性增强显著相关.结论缺氧、氧损伤后肾小管上皮细胞α3整合素的极性分布改变对肾小管与基质和细胞间的粘附性均有显著影响,这种改变有可能在急性缺血性肾功能衰竭中发挥作用.
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神经母细胞瘤SK-N-SH细胞在氯化钴模拟缺氧后侧群细胞基因表达谱的变化
目的 探讨SK-N-SH神经母细胞瘤株在氯化钴模拟缺氧条件下侧群(side population,SP)细胞比例的变化及SP细胞基因表达谱的改变.方法 采用二氯化钴模拟缺氧条件,然后利用Hoechst 33342染料法,通过流式细胞仪紫外激光检测分选功能分选出缺氧及常氧SK-N-SH细胞中的SP细胞,利用Agilent 8×60K人(Human) G3表达谱芯片进行检测,并对基因芯片结果进行分析,以荧光定量PCR验证芯片结果.结果 SK-N-SH细胞株的SP细胞比例约为8.65％,缺氧后降至约2.08％;缺氧SP细胞和常氧SP细胞mRNA及lincRNA的表达谱存在明显差异.差异＞2倍的基因有5077 mRNA、1383 lincRNA、其中上调的有2550 mRNA、572 lincRNA,下调的有2527 mRNA、81 1 lincRNA.差异表达的基因主要涉及细胞周期、DNA复制、p53及MAPK信号通路等生物学过程.荧光定量PCR基因结果与芯片差异基因结果表达趋势一致.结论 缺氧使SP细胞比例下降,并使SP细胞mRNA和lincRNA的表达谱均发生显著改变,提示mRNA和lincRNA共同参与调节神经母细胞瘤SP细胞在缺氧环境中的生物学行为.
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~(99)Tc~m-HL91 SPECT乏氧显像在非小细胞肺癌放疗中的疗效评价
目的 探讨~(99)Tc~m-4,9-二氮-3,3,10,10-四甲基十二烷-2,11-二酮肟(HL91)乏氧显像对非小细胞肺癌放疗近期疗效的评价. 方法 31例拟接受三维适形放射治疗的非小细胞肺癌患者,在放疗前2天、后2天分别静脉注射~(99)Tc~m-HL91 740-925MBq后进行4 h及24 h SPECT断层显像,根据显像进行目测和半定量分析(T/N值,靶与非靶比值),根据放疗前24h显像T/N值将患者分为低摄取组(T/N<2.76,n=6)及高摄取组(T/N≥2.76,n=25),对两组放疗近期疗效进行比较. 结果 低摄取组放疗近期有效率为83.3%(1/6)高于高摄取组为44.0%(11/25),两组比较差异有统计学意义(P<0.05).两组24 h断层显像T/N比值下降率分别为30.3%和13.3%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05). 结论 ~(99)Tc~m-HL91非小细胞肺癌乏氧显像在预测放疗近期效果方面具有一定的临床价值.
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低氧对人单核细胞白血病细胞株U937细胞增殖的影响及其作用机制的初步研究
目的 初步探讨低氧对人单核细胞白血病细胞株U937细胞增殖目的影响和作用机制.方法 将培养目的细胞分为常氧对照组、低氧8 h组、低氧12 h组、低氧24 h组.MTT比色法检测细胞增殖率、RT-PCR和Western-blot方法分别检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)在mRNA和蛋白水平目的表达、激光共聚焦显微镜观察HIF-1α核转位现象.结果 ①相对于对照组,低氧8 h组、低氧12 h组和低氧24 h组细胞存活率明显下降(P<0.01),并且随着低氧时间目的延长存活率逐渐下降,各组之间目的差异有显著性(P<0.01); ②HIF-1α mRNA和蛋白在对照组有少量目的表达,随着低氧时间目的延长,其表达增加(P<0.05);③相对于对照组,低氧组细胞内HIF-1α目的表达增加,并且向核内转移,随着低氧时间目的延长核内HIF-1α逐渐增多.结论 低氧可通过影响HIF-1α目的表达和调节其活性而达到抑制U937细胞株增殖目的作用.HIF-1α介导目的信号传导通路在白血病细胞目的发生和增殖过程中可能起到关键目的调控作用.
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缺氧损伤对新生大鼠海马神经干细胞细胞活力及分化潜能的影响
[目的]通过建立缺氧损伤模型,观察缺氧损伤对神经干细胞活力及分化潜能的影响.[方法]采用机械吹打、无血清悬浮培养,95%N2、5%CO2比率的缺氧气体体外分离培养新生大鼠海马神经干细胞,建立缺氧模型,免疫细胞化学鉴定神经干细胞及其分化后的细胞类型,MTT、LDH等方法比较缺氧培养后神经干细胞的变化,并观察缺氧培养1、2、4、6、8 h后神经元分化的比率.[结果]新生大鼠海马可分离出的大量细胞Nestin染色阳性,证实为神经干细胞,分离出的神经干细胞可分化为神经元、胶质细胞等神经细胞类型;95%N2、5%CO2比率的缺氧气体培养6 h后神经干细胞MTT值由缺氧前0.368±0.104降至0.268±0.071(P＜0.05),LDH漏出量由缺氧前10.369±0.379 unit/(ml·min)增加到13.987±1.240 unit/(ml·min)(P＜0.05);神经元的分化比率稍增加,但无显著差异(P》0.05).[结论]新生大鼠海马内提取的细胞为神经干细胞,神经干细胞缺氧培养6 h后可以建立神经干细胞缺氧损伤模型,短时间缺氧培养对细胞分化的类型无明显改变.
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低氧对肝癌细胞上皮间质转化及侵袭转移能力的影响
目的:观察低氧环境下肝癌细胞上皮-间质转化(EMT)情况和侵袭转移能力的改变.方法:选取2种具有不同侵袭转移能力的人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2,通过1％ O2低氧培养建立人肝癌细胞物理缺氧模型.动态观察2种细胞在低氧环境中的形态学改变；应用Westernblot方法检测上皮细胞标志蛋白E-cadherin和间质细胞标志蛋白vimentin表达的变化；应用Transwell小室检测肝癌细胞迁移、侵袭能力.结果:低氧环境中,该2种肝癌细胞均由原来的紧密排列上午上皮样状态转为较松散的纺锤体样改变；Western blot检测显示,2种肝癌细胞株的E-cadherin表达量明显下降(均P＜0.01),而vimentin表达量明显升高(均P＜0.01)；Transwell迁移及侵袭实验显示,2种肝癌细胞的迁移及侵袭能力明显增强(均P＜0.01)；SMMC-7721细胞的上述变化均较HepG2细胞明显(均P＜0.01).结论:低氧环境可诱导肝癌细胞发生EMT,并增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力.
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利多卡因对缺氧/复氧后肝细胞钙超载和细胞凋亡的影响
目的:探讨利多卡因预处理对L02肝细胞缺氧/复氧后肝细胞内钙离子变化和细胞凋亡的影响.方法:选用L02肝细胞缺氧/复氧损伤模型,随机分为缺氧/复氧组(Ⅰ 组)、利多卡因预处理组(Ⅱ组)和正常对照组(Ⅲ组);检测肝细胞缺氧4 h,复氧后10 h 细胞培养基中谷丙转氨酶(ALT)浓度、谷草转氨酶(AST)浓度、肝细胞内钙离子浓度、肝细胞凋亡率以及细胞形态结构变化.结果:缺氧/复氧后肝细胞内钙离子浓度升高,且与细胞凋亡率呈正相关(P＜0.05);Ⅰ,Ⅱ组细胞复氧10 h后肝细胞培养液中ALT浓度、AST 浓度、肝细胞内钙离子浓度、细胞凋亡率较Ⅲ组均升高(P＜0.05),倒置显微镜和电子显微镜示肝细胞损伤,可见凋亡细胞;Ⅱ组细胞复氧10 h后肝细胞培养液中ALT浓度、AST浓度、肝细胞内钙离子浓度、细胞凋亡率均低于Ⅰ组(P＜0.05),倒置显微镜和电子显微镜结果也显示Ⅲ组肝细胞比Ⅰ组损伤轻微.结论:利多卡因预处理可以缓解缺氧/复氧损伤后肝细胞内钙超载,降低细胞凋亡率.
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线粒体缺氧损害机制研究进展
线粒体是细胞缺血缺氧损害的核心靶细胞,其损害是全身性缺血缺氧损害关键的环节.从而形成了以线粒体为中心,研究严重烧伤后缺血缺氧损害发生机制与防治策略的新思路[1].但至今有关烧伤后线粒体损害的具体途径和机制并不完全清楚.
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p38丝裂原活化蛋白激酶在低氧鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的表达
目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)在低氧引起的鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用.方法 采用细胞培养方法,免疫印迹技术,流式细胞仪方法测定在低氧情况下p38 MAPK的表达及其细胞周期的变化.结果 低氧情况下细胞中p38 MAPK表达增加,细胞呈现增殖性变化.结论 p38 MAPK在低氧情况下参与了鼠肺动脉平滑肌细胞增殖,具有重要的病理生理学意义.
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组胺对大鼠正常肝细胞及缺氧/复氧时肝细胞活力的影响
目的:评价组胺对大鼠正常肝细胞及缺氧/复氧时肝细胞活力的影响.方法:大鼠肝细胞株,调整细胞密度为1×107 cells/L,接种于培养孔中,每孔200 μL作为研究对象,本研究包括2个实验,各实验中研究对象随机分为7组.实验1:空白组和2×104 μg/L组各12孔,其它各组各6孔,空白组不做任何处理,10 μg/L组、102μg/L组、103 μg/L组、104 μg/L组、2×104 μg/L组和5×104 μg/L组分别加入相应浓度的组胺,孵育25 h,各组取6孔,测定肝细胞活力,取空白组和2×104 μg/L组的其它6孔,收集细胞培养上清液和细胞,分别用于测定谷丙转氨酶(ALT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,电镜观察细胞超微结构.实验2:分组方法同实验1,空白组和2×104 μg/L组各12孔,其它各组各6孔,空白组不做任何处理,加入相应浓度的组胺后立即进行缺氧1 h、复氧24 h, 各组取6孔,测定肝细胞活力, 取空白组和2×104 μg/L 的其它6孔,收集细胞培养上清液和细胞,分别用于测定ALT和SOD的活性,电镜观察细胞超微结构.结果:实验1:与空白组比较, 103 μg/L组-5×104 μg/L组肝细胞活力增加,且呈浓度依赖性,2×104 μg/L组SOD活性升高(P＜0.05),ALT活性差异无显著(P＞0.05);电镜下空白组和2×104 μg/L组肝细胞未见损伤.实验2:与空白组比较,102 μg/L组-5×104 μg/L组肝细胞活力降低,其中2×104 μg/L组和5×104 μg/L组肝细胞活力降低更明显,2×104 μg/L组ALT活性升高,SOD活性降低(P＜0.05),2×104 μg/L肝细胞损伤重于空白组.结论:组胺可增加大鼠正常肝细胞活力,且呈浓度依赖性,2×104 μg/L组胺可提高其抗氧化能力;组胺可降低缺氧/复氧时大鼠肝细胞活力,且与浓度有关,2×104 μg/L组胺可降低其抗氧化能力.
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一种用于定量研究细胞缺氧的简易模型
目的:建立一种可用于定量研究培养细胞缺氧的实验模型.方法:用厚有机玻璃制作一带有控制气体出入管道的缺氧箱;用混合气(94%N2+6%CO2)吸空箱内气体,然后注入一定体积的空气,以达到研究所需氧浓度.将A549肺癌细胞置缺氧箱内培养,检测不同缺氧时段箱内O2和CO2的浓度,以及不同氧浓度下细胞培养液的酸度变化和细胞存活分数.结果:应用该实验模型获得了预计的氧浓度;细胞培养结果表明,在细胞缺氧培养5 h以内箱内气体浓度无明显变化;细胞存活分数和培养液pH值随缺氧程度的加重和时间延长而下降.结论:该模型可应用于定量研究细胞缺氧,具有简便、实用、可靠等特点.
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低氧环境下低氧诱导因子2α对大鼠肾小球内皮细胞细胞间紧密连接蛋白表达和细胞通透性的影响
目的：探讨低氧环境下大鼠肾小球内皮细胞（rGENC）中低氧诱导因子2α（HIF?2α）对细胞间紧密连接蛋白闭合蛋白（occludin）、闭锁小带蛋白1（ZO?1）的表达和细胞通透性的影响。方法10%FBS的DMEM培养基37℃5%CO2体外培养rGENC ，待细胞生长达到80%时进行不同分组：（1）给予不同时间（0、12、24、48 h）低氧处理，即置于5%O2，5%CO2和90%N2低氧培养箱培养；（2）分为正常对照组、低氧组、阴性对照组（转染空载体+低氧）、低氧转染组（转染HIF?2αsiRNA+低氧）培养24 h。慢病毒转染空载体或HIF?2αsiRNA；Western印迹检测各组细胞中occludin、ZO?1和HIF?2α蛋白表达。电阻仪检测跨上皮细胞电阻（TEER）。结果随着缺氧时间的延长，低氧组细胞中HIF?2α表达逐渐增加，而occludin和ZO?1蛋白表达逐渐降低（与对照组比较，均P＜0.01），均呈时间依赖性。并且低氧组TEER低于正常对照组（P＜0.01），其细胞通透性增加。慢病毒转染后筛选出稳定抑制HIF?2α表达细胞株。与低氧组比较，低氧转染组细胞中HIF?2α表达降低，occludin和ZO?1蛋白表达增加，TEER升高（均P＜0.01）；阴性对照组上述各项目与低氧组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论低氧环境下rGENC通过上调HIF?2α表达来降低细胞间紧密连接蛋白occludin和ZO?1的表达，进而增加细胞通透性。
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低氧对钾-氯协同转运子1启动子的调控作用
目的通过观察低氧对钾-氯协同转运子1(KCC1)启动子的作用及对KCC1基因表达的影响,探索低氧诱导因子1a(HIF-1α)结合位点是否为真正的低氧诱导因子结合位点、在低氧环境中该位点的作用以及KCC与低氧间的关系.方法用KCC1野生型启动子和HIF-1α位点变异的KCC1启动子转染人胚胎肾上皮(HEK)293细胞.转染细胞分别在低氧条件下和正常培养条件下培养,用荧光素酶功能分析的方法观测低氧对KCC1启动子荧光素酶活性的影响;用RT-PCR方法比较两种培养条件下KCC1 mRNA表达水平的差异.结果低氧条件下野生型KCC1启动子荧光素酶活性为正常培养条件下的KCC1启动子荧光素酶活性的1.8倍,而变异的HIF-1α位点的KCC1启动子荧光素酶活性则在两种条件下差异无统计学意义.低氧条件下HEK293细胞的KCC1 mRNA表达水平是正常氧条件下表达量的2.65倍,差异有统计学意义.结论本研究发现了KCC1启动子中有HIF-1α结合位点,低氧可增强KCC1启动子的活性.该位点的变异与否决定了启动子活性是否受低氧的影响.该结果证实了KCC与低氧间的关系,为建立低氧-KCC1-肾小管间质损害之间的链接提供了实验依据.
关键词： 钠-钾-氯协同转运子 细胞低氧 低氧诱导因子1α 启动子 -
低氧诱导鼻咽癌细胞表达血管内皮生长因子
背景与目的:低氧是大多数实体瘤(包括鼻咽癌)肿瘤微环境中的一个普遍存在的现象.研究表明,低氧能诱导血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)在神经胶质瘤(C6)等细胞中的表达.本实验研究低氧对VEGF在体外培养的鼻咽癌细胞株(CNE-2Z)表达的影响,并探讨其与肿瘤转移的关系.方法:建立CNE-2Z细胞体外低氧细胞培养模型.在低氧处理24h后,分别以RT-PCR和Westernblot方法检测VEGF基因在mRNA和蛋白质水平的表达变化.结果:RT-PCR证实CNE-2Z细胞表达VEGF189,VEGF165,VEGF145和VEGF121等4种VEGFmRNA同工型.此四种mRNA同工型在低氧处理24h后均表达增加,分别是常氧对照组的(267±030)、(205±003)、(273±015)和(165±001)倍.Westernblot显示,低氧实验组VEGF蛋白表达是常氧对照组的(220±007)倍.结论:CNE-2Z细胞表达VEGF基因.体外低氧处理能使CNE-2Z细胞中VEGF表达增加.
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下丘脑神经元NMDA受体通道特性研究
目的通过对正常和缺氧条件下N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体通道特性进行研究,探讨下丘脑神经元缺氧损伤的机理,为临床防治脑缺血/缺氧损伤提供实验依据.方法取材于新生SD大鼠下丘脑视前区/下丘脑前区(PO/AH)神经元,应用膜片钳单通道记录技术对缺氧和非缺氧两种状态下NMDA受体特性进行研究,观察其在缺氧和非缺氧条件下的翻转电位、电流幅度、电导特性的变化.结果神经元缺氧后其通道内向电流幅值由平均(4.501±0.980)pA(n=20,40 mV)上升为(6.000±1.750)pA(n=16,40mV),优势电导由非缺氧组的(45.693±1.850)pS(n=16)上升为(60.206±1.750)pS(n=10),而翻电位极为接近.结论缺氧是使NMDA受体通道过度激活和Ca2+大量内流的一外因条件.神经元缺氧时,同一钳制电压下其内向电流幅度明显高于对照组,优势电导也有明显上升,可以解释为缺氧引起了神经元Ca2+超载,从而介导了细胞的损伤和死亡.
