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pUHD10-3-p53质粒的扩增及分离纯化
目的:建立一种确实有效的pUHD10-3-p53质粒提取方法,为科学研究制备高纯度pUHD10-3-p53质粒奠定基础.方法:将克隆有Wt-p53基因的eDNA质粒(pUHD10-3-p53)转染感受态细菌E.coli DH5a菌株.经扩增,用小量碱裂解法提取质粒DNA,再纯化后,用紫外分光光度计测定其含量,并进行酶切电泳鉴定.结果:pUHD10-3-p53质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切后在1.5%琼脂糖凝胶中电泳,可观察到3.15、1.8 kb两条区带.结论:用小量碱裂解法提取pUHD10-3-p53质粒,效率高,质量稳定,得到的质粒DNA的质量与纯度均符合实验要求.
关键词： pUHD10-3-p53质粒 提取 纯化 酶切 -
3种PCR产物纯化方法的比较
PCR产物中一般都含有过量的引物及核苷酸,这些成分将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程,因此有必要去除.目前核酸的纯化方法很多,但往往因需时较长或回收率太低而影响下一步的操作.近年来,商品化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变为简便快捷,但因价格高昂而令多数实验室难以承受.本研究选择3种具有代表性的常用方法对HLA-DQA1基因第二外显子的PCR产物进行纯化比较,现报道如下.
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骨肉瘤基因组DNA的提取及部分酶切分析
目的比较提取骨肉瘤基因组DNA,建立基因组DNA的佳部分酶切条件并制备其部分酶切产物.方法采用经典的基因组DNA提取法和改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA,以限制内切酶Sau3A I部分酶切,采用玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒与蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA.结果提取基因组DNA片段大于150 kb,37℃,Sau3AI 1:4(u/μg)部分酶切骨肉瘤基因组DNA 30 min获得18 kb ～23kb基因片段的富集,制备目的片段DNA.结论经改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA具有纯度、产量高,方法简单,无蛋白和RNA污染,片段足够长,可被Sau3AI部分酶切,玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒和蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA纯度高,无小的DNA片段混入,可满足构建入噬菌体载体(EMBL3)基因组文库.为构建骨肉瘤的入EMBL3载体基因组文库做好了前期工作.
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基因工程在医学上应用
基因工程是指不同生物体的脱氧核糖核酸在体外经过酶切和连接,构成重组脱氧核糖核酸分子,然后转入受体细胞,使外源基因在受体细胞中表达.
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微滴数字PCR检测含有目的基因的PUC57质粒问题分析
目的 探讨微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)检测含有目的基因的PUC57质粒过程中出现的问题及解决方法.方法 用ECORⅠ酶37℃孵育含有目的基因的PUC57质粒2 h和4 h,然后65℃孵育20 min,灭活ECORⅠ酶.用伯乐QX200TM微滴式数字PCR分别检测PUC57质粒和经ECORⅠ酶酶切后的PUC57质粒,同时对酶切后的PUC57质粒分多天进行检测,对检测结果进行比较.结果 含有目的基因的PUC57质粒经ECORⅠ酶酶切2 h和4 h后的检测值与质粒理论值之间差异无统计学意义(t=-0.192、-0.403,P>0.05),同时酶切与没有酶切的PUC57质粒检测值之间差异有统计学意义(Z=-4.194,P<0.05).酶切后的检测值与PUC57质粒理论值相符合.酶切后的PUC57质粒随着放置时间的延长,检测值逐渐降低.结论 用伯乐QX200TM微滴式数字PCR检测含有目的基因的PUC57质粒时要先酶切再检测,酶切时间只需2 h即可将质粒酶切完全,同时酶切的PUC57质粒要尽快检测.
关键词： 微滴数字聚合酶链反应 PUC57质粒 酶切 -
HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达
1. 材料与方法：乳哺动物细胞表达载体pBK-CMV，长约4.5kb，带有T7公用序列。pCP10是pBR322 EcoRI位点中插入双拷贝头尾相接的HBV ayw亚型全基因HBV DNA重组质粒。PCR引物XI1：1428-1448 nt 5′CGT CCC GTC GGC GCT GAA TCC 3′，XI2：1672-1653 nt 5′AGT CCA AGA GTC CTC TTA AG 3′。人肝癌细胞系SMMC-7721，由上海细胞所提供。将EcoRⅠ酶切后回收的全基因HBV片段，在T4 DNA连接酶作用下，与EcoRⅠ酶切后的pBK-CMV粘端连接。利用pBK-CMV具有T7公用序列，选用XI2、T7作为引物，PCR出现1.7kb阳性条带为反接，并命名为pBK-AHBV。用FUGENETM6转染试剂转染SMMC-7721细胞。在含10%FCS的RPMI 1640（pH7.4）培养基中培养至60h后，用总RNA抽提试剂（Trizol Reagent）提取转染的SMMC-7721细胞，依次获得总RNA、DNA。
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一种改良的质粒DNA的快速提取方法技术方法
目的:建立一种确实有效的更实用的小量质粒DNA的提取方法.方法:将一含有目的质粒的大肠杆菌扩增后采用改良后的方法提取质粒DNA,然后采用紫外分光光度计测定含量,并且进行酶切.结果:每毫升原细菌培养物质粒DNA的产量明显增高,且酶切效果极好.结论:改良后的质粒DNA提取法具有速度快、收获量多、纯度高、经济又方便等优点,适合于应用与推广.
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大鼠黏蛋白rMuc3酶切保守基序对其蛋白酶切的影响
目的 探讨大鼠黏蛋白rMuc3酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸对其蛋白酶切的影响.方法 采用定点突变技术,设计相应突变引物,以p20为模板,基于PCR扩增得到突变体,并经测序验证.然后通过Western Blot检测各突变体的表达,并分析未酶切部分所占比例.结果 细胞裂解物经Western Blot免疫印迹实验,证实在55kd处存在未酶切的部分,在30kd处存在可被抗V5抗体检测的N端部分,经过Quantity one分析后发现,S2/A完全抑制了酶切的发生,G/A抑制了绝大部分的酶切(未酶切部分占79%),L/A、I/A、V1/A、V2/A均对酶切产生了不同程度的抑制,未酶切部分分别为22%、39%、14%和17%,而K/A和S2/A几乎对酶切没有影响,其未酶切部分分别为6%和3%,酶切效率与p20(未酶切部分占4%)几乎一样.结论 酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸对其蛋白酶切的发生是很重要的,其机制可能是因为此保守基序位于β2和β3片层之间的环状区,其上的氨基酸对于维持黏蛋白的构象是必须的.在S1上可能有O型糖链的存在,并且去除此O型糖链不影响酶切保守基序LS1KGS2IV1V2的酶切.
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原癌基因Bcl-2重组腺病毒的构建及表达
目的:构建Bcl -2的正义和反义重组腺病毒载体,以研究Bcl-2过度表达对周围神经损伤后,脊髓前角运动神经元抗凋亡能力和轴突再生的影响.方法:用EcoRI酶切pB4,0.8%琼脂糖凝胶电泳回收0.91kp片段,将该片段克隆到pcDNA3.1质粒的EcoRI 位点,分别用EcoRI和BamHI酶切重组pcDNA/Bcl-2质粒以鉴定插入片段的大小和方向,正向插入被BamHI切出260bp片段,命名为pcDNA/sen se-Bcl-2;反向插入被切入650bp的片段,命名为pcDNA/antise nse-Bcl-2.用Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ双酶切重组的正、反质粒,回收0.9 1kb DNA片段并克隆到腺病毒穿梭质粒pAdCMV-Linker的HindⅠⅡ和EcoR Ⅴ位点,即得到pAdCMV/sense-Bcl-2和pAdCMV/a ntisense-Bcl-2.pAdCMV/s-Bcl-2、pAdCMV/as- Bcl-2分别和pJM17质粒混合,由脂质DOTAP介导共转染80%成片的293细胞 ,共转染7天后可见圆形细胞呈葡萄串状丛集分布于正常的293细胞上,并出现病毒空斑,离心收集上清,并将细胞在-20℃及37℃反复冻融3次,离心收集上清,感染正常293 细胞,培养48小时后分别进行Bcl-2 cRNA原位杂交和Bcl-2免疫组化染色鉴定阳性腺病毒.阳性的重组腺病毒大量扩增,经CsCl超速离心纯化病毒,所得腺病毒分别为AdCMV/sense-Bcl-2和AdCMV/antisense-Bcl -2.结果:Bcl-2cRNA探针原位杂交、Bcl-2单克隆抗体免疫组化的方法从感染AdCMV/sense-Bcl-2重组腺病毒的293细胞中检测到Bcl-2的表达.结论:重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内进行有效复制.成功构建了B cl-2重组腺病毒,为进一步研究Bcl-2重组腺病毒的功能提供了条件.
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用于慢病毒包装的高纯度质粒DNA的大量制备和应用
目的:建立简便易行、成本低廉和安全可靠的高纯度质粒大量制备方法,探讨其在分子生物学研究中的应用.方法:培养含目的质粒的菌株,运用改良后的碱裂解法大量提取质粒DNA并进行纯化,微量核酸仪测定质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、限制性核酸内切酶酶切、转染哺乳动物细胞和慢病毒包装,鉴定质粒DNA的质量及转染效率.结果:本质粒提取方法获得质粒DNA产量为2.5 mg/L菌液,OD260/OD280=1.91;以超螺旋质粒DNA为主;限制性核酸内切酶可完全酶切;哺乳动物细胞转染效率在85％以上;可用于慢病毒包装.结论:本方法抽提质粒DNA操作简单、经济实用,可替代质粒大量提取试剂盒获得高产优质的质粒DNA,充分满足了分子生物学实验的要求.
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门冬胰岛素原的酶切及产物分离纯化方法
目的 建立门冬胰岛素原的酶切及纯化方法,获得高纯度的活性门冬胰岛素.方法 以大肠杆菌制备含有前导肽和折叠伴侣C肽的门冬胰岛素原为底物,采用胰蛋白酶和羧肽酶B对门冬胰岛素原进行酶切同时去除前导肽及C肽,酶切条件:酶与门冬胰岛素原的质量比为1∶1000,室温反应30min.利用SPFF层析柱纯化酶切产物,获得高纯度的门冬胰岛素.结果 电泳结果显示酶切产物与门冬胰岛素分子量相似,离子交换纯化可以分开门冬胰岛素及酶切的多余肽段.高效凝胶过滤层析分析洗脱峰纯度大于95％,蛋白收率为30％.MALDI-TOF检测纯化产物的分子量与门冬胰岛素的理论分子量完全一致.结论 建立门冬胰岛素原酶切及分离纯化工艺可用于指导门冬胰岛素的规模制备.
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从贵州白纹伊蚊体内分离到一株2型登革病毒
从贵州省独山县麻尾镇白纹伊蚊标本中分离到一株病毒,用抗DEN1-4型单克隆抗体经间接免疫荧光法和RT-PCR产物酶切分型鉴定为DEN-2,并对其NS1和E基因RT-PCR产物进行部分基因序列测定,与DEN-2NGC株比较,麻尾株的NS1基因区有7个碱基发生点突变,E基因区有1个碱基的插入,两个序列被GenBank收录,编号分别为AY277402、AY278226;麻尾分离株与其他9株DEN-2型病毒进行系统发育关系的分析,结果显示与D2-43株系统进化关系近;证明贵州省存在DEN感染的自然循环.
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人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究
目的 环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之 一. 本研究旨在获得hCOX-2 编码基因序列，构建其正、反义真核表达载体，并用反义重组载体转染COX-2高表达的胃癌 细胞，以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制. 方法 按文献报道的hCOX-2 核苷酸序列设计合成PCR引物，利用总RNA抽取试剂盒从COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系 SGC 7901中提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再用PCR方法扩增目的基因序列. PCR产物经DNA序 列测定证实后，利用引物5端引入的EcoRⅠ, XbaⅠ酶切位点，通过粘端连接，将 所获目的 基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1中. 对两种重组质粒分别进 行相应的酶切鉴定. 采用脂质体介导的方法用COX-2反义核酸转染SGC7901细胞，经G418筛 选 后，随机挑选细胞克隆. 通过RT-PCR检测COX-2 mRNA水平的变化. 结果 应用RT-PCR反应扩 增获得大小约1.9 kb的特异性片段. 经DNA序列分析，证实与文献报道的hCOX-2编码区序列 一致. 重组正义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(+)用EcoRⅠ，XbaⅠ双酶切后，产生大 小约5.4 kb，1.9 kb的片段；重组反义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(-)通过PstⅠ酶切， 产 生大小约4.5 kb, 1.5 kb与1.3 kb的片段，与预期结果相符. 转染细胞经筛选后，随机挑选 、扩增了3个细 胞克隆，其中1个细胞克隆稳定表达COX-2反义核酸，RT-PCR提示其COX-2 mRNA水平显著 下 降. 结论 成功克降了hCOX-2编码基因序列，并构建了其正、反义真核表 达载体. 反转录PC R是克隆基因的简便、有效方法. 为扩增高GC含量的cDNA模板，可在PCR引物中加入限制性内 切酶位点，可以方便地实现基因的定向克隆. COX-2反义核酸在胃癌细胞系SGC7901中得到 稳定转染，转染细胞COX-2 mRNA表达显著受抑制.
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一种改良式质粒DNA提取方法的建立与应用
目的 建立一种稳定、可靠的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值.方法 将含有目的 质粒的菌株扩增后,运用改良后的碱裂解法进行质粒DNA小量提取,微量核酸仪测定提取质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、内切酶酶切及质粒转染真核细胞鉴定提取质粒DNA的质量及转染效率.结果 改良式质粒提取方法获得质粒DNA产量为3.2 mg/L菌液,A260/280=1.91;内切酶酶切完全;质粒DNA以超螺旋结构为主;真核细胞转染效率为20%左右.结论 改良式质粒DNA抽提方法操作简单、实用,获得质粒DNA产量多、质量高,能达到分子生物学常规实验的要求.
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Bad真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建促凋亡基因Bad真核表达载体并鉴定其在人食管鳞癌细胞ECA109和KYSE450细胞中的表达.方法 设计Bad基因引物,通过PCR扩增获得其cDNA片段,经双酶切后,将此片段克隆至真核表达载体GV142中,转入DH5α,获得重组质粒GV142-Bad;PCR扩增、酶切及测序验证后,将其及对照空载体转染人食管鳞癌ECA109和KYSE450细胞,转染后24 h,通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光信号的表达情况,提取总RNA,使用qPCR检测Bad在转录水平的表达.结果 成功构建Bad真核表达载体,PCR扩增出长为545 bp的特异性片段,经克隆至真核表达载体GV142后酶切及测序鉴定准确.重组质粒GV142-Bad成功转染食管鳞癌细胞并在荧光倒置显微镜下观察到不同强度的绿色荧光信号.应用qPCR检测重组质粒GV142-Bad转染ECA109和KYSE450细胞的Bad基因mRNA表达水平上调,与空载体转染组和空白组比较差异有统计学意义 (P <0.05).结论 本研究成功构建Bad真核表达载体,用电转染法成功转染食管鳞癌ECA109和KYSE-450细胞,获得高表达并上调Bad基因mRNA的水平,为进一步研究Bad基因的功能奠定了基础.
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慢性肝病患者Ⅲ型前胶原氨基端肽测定及临床意义
Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)是Ⅲ型胶原在细胞外形成原胶原前,被相关酶切下后进入血液中的氨基端肽,与肝组织炎症和肝细胞损伤呈一定关系,被认为是肝纤维化的良好血清学指标[1].我们应用放射免疫法检测220例慢性肝炎患者血清中PⅢNP水平,以评估其价值.
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影响PCR-RFLP的相关因素
限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, PCR-RFLP)是一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术,又称无细胞分子克隆技术.它以待扩增的两条DNA链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸作为介导,通过DNA聚合酶反应,在体外进行特异DNA序列扩增.扩增后,将PCR产物直接酶切、电泳、显色,即可对目的基因进行分类分型.现将我做PCR-RFLP的体会简要陈述如下.
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哺乳动物卵透明带蛋白中C端furin位点存在的意义
根据已克隆的各哺乳动物物种卵透明带(ZP)三种蛋白质的cDNA序列推断,在它们编码的蛋白C端跨膜区上游几乎都存在RXK/RR基序.先前报道存在于许多蛋白C端的这一基序是furin蛋白酶的一个酶切位点.因此,为了阐明各ZP蛋白组份在分泌组装成ZP带时,是否在此furin位点经历了加工处理,以致丢弃它们C端的疏水性跨膜区,几个实验室相继从不同角度用不同方法进行了探讨.从目前的大多数实验结果来看,三个ZP组成蛋白分泌前在它们C端跨膜区上游的furin位点被切割的证据是充分的.当然也有相反的实验证明,即各ZP蛋白不经历此位点切割也能被分泌并进行ZP组装和扩张.对此截然相反的研究结果,一个可能的解释,也许是重组小鼠ZP3中分别选用了不同的表位标签和插入位置以及使用了不同的转染细胞株.
