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APP5肽类似物P165对糖尿病脑病小鼠海马胰岛素受体、胰岛素受体底物-1的影响
糖尿病大鼠存在学习记忆功能障碍和神经元信号转导通路相关蛋白表达异常,APP17肽(amyloid protein precusor319-335 peptide)能够使这些异常改变恢复或接近恢复至正常水平[1~3].APP5肽是APP17肽的活性序列,其类似物P165具有抗酶解能力.本研究观察糖尿病小鼠海马神经元胰岛素受体(insulin receptor,IR)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)的变化及P165对上述变化的影响.
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新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法改良研究
目的:探讨改良的新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法,为新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病研究奠定基础。方法采用本研究自行设计的改良新生大鼠海马神经元细胞的体外培养方法,进行新生大鼠海马神经元细胞的体外培养。判断新生大鼠原代海马神经元细胞体外培养成功的标准为:荧光显微镜下,可见微管相关蛋白(MAP)2在海马神经元细胞体和树突中表达。该改良方法具体为:①以 L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为神经元细胞体外培养的生长基质,分离出生24 h 内新生 SD 大鼠海马结构。将其运用单一胰蛋白酶水浴振荡消化后,吹打成细胞悬液,将海马神经元细胞以适当的密度种植于含10%胎牛血清 DMEM 培养基中,贴壁培养4 h 后,更换为Neurobasal 维持培养基继续培养,以后每3 d 更换1/2培养液。②采用抗 MAP2-5-异硫氰酸荧光素(anti-MAP2-FITC)免疫荧光法,对所获得的海马神经元细胞进行鉴定。结果①新生大鼠海马神经元细胞的体外培养结果显示,新生大鼠海马神经元细胞于培养30 min 时,大部分细胞贴壁生长,培养2 h 后,细胞贴壁明显,少数细胞开始长出突起。于培养5 d 后,神经元突起进一步增多,并形成神经细胞网络,培养7 d 后,神经元细胞分化更加成熟,神经元细胞之间的突起联系更加紧密,可见密集的神经细胞网络。海马神经元细胞体外培养至第21天后,神经元细胞开始退化、变性,细胞体皱缩,残留细胞体痕迹,周围光晕消失,折光性减弱,突起融合而粗大杂乱,神经细胞网络粗大老化。②anti-MAP2-FITC免疫荧光法对所获得的海马神经元细胞进行鉴定的结果显示,在所有细胞中,免疫荧光染色 MAP2阳性新生大鼠海马神经元细胞纯度达96.3%。结论通过上述改良方法培养获得的新生大鼠海马神经元细胞生长状态良好,并具有较高的纯度,可为进一步进行新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病的研究提供实验条件。
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围生期甲状腺功能低下对仔鼠运动与学习记忆的影响
甲状腺激素对中枢神经系统的发育至关重要,人类围生期甲状腺功能低下引起智力、神经功能及代谢过程的永久性改变.本课题组前期研究发现围生期甲状腺功能低下仔鼠海马神经元凋亡增加[1],由于海马结构是调节行为、学习记忆的重要神经解剖学基础.因而,进一步对21及50日龄甲低仔鼠运动、行为情感及学习记忆的改变进行了探讨.
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缺氧预处理对缺氧缺血性新生鼠脑缺氧诱导因子-1α的影响
经缺氧预处理( HPC)的脑组织能对随后的严重缺氧缺血耐受性明显增强.离体研究表明[1],HPC可以增强体外培养的海马神经元的耐缺氧能力,同时可以减少缺氧-复氧后的神经元凋亡;整体动物研究表明,新生大鼠缺氧预处理可以减轻随后严重缺氧缺血所致的脑损伤[2],但其作用机理尚不清楚.缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)可能是HPC过程适应反应的重要组成部分,又是缺氧诱导细胞凋亡的重要介质.为此,我们推测,HPC保护新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的机制可能与抑制HIF-1α诱导的凋亡有关.我们以往的研究表明[3],新生鼠脑缺氧缺血后HIF-1α基因表达改变可能导致细胞凋亡的发生,那么,新生大鼠HPC是否可以减少缺氧缺血后HIF-1α的表达,减少其后续细胞凋亡相关基因如Ninteen KD interacting protein 3 (NiP3)的转录,从而减轻缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后的神经元凋亡?
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缺氧-复氧对大鼠海马培养神经元Bcl-2、Bax表达和神经元凋亡的影响
目的观察缺氧-复氧对体外培养海马神经元Bcl-2和Bax表达和神经元凋亡的影响.方法取培养12d的海马神经元,置于恒温(36℃)密闭容器内,连续充以无氧气体[90%(体积分数)N2、10%(体积分数)CO2],在缺氧条件下继续培养4 h后,再于常氧培养箱内复氧培养24 h和72 h.于不同时间观察神经元存活数,并分别用抗Bcl-2和Bax抗血清进行免疫组织化学染色,观察缺氧-复氧后大鼠海马培养神经元Bcl-2和Bax表达.并用原位末端标记(TUNEL)法和流式细胞术分别检测缺氧-复氧对体外培养海马神经元凋亡的影响.结果缺氧-复氧后24~72 h,海马神经元对Bcl-2的表达逐渐减弱,对Bax的表达逐渐增强,Bax/Bcl-2比值逐渐增大,凋亡神经元百分率逐渐增多.结论缺氧-复氧后24~72 h神经元凋亡的发生与神经元Bcl-2表达逐渐减弱,Bax表达逐渐增强,Bax/Bcl-2比值逐渐增大有关.
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低氧预处理对大鼠海马神经元缺氧耐受性和IL-6免疫反应的影响
目的观察低氧预处理对大鼠海马神经元缺氧耐受性和IL-6免疫反应的影响.方法取培养12 d的两组(对照组和低氧预处理组)培养神经元,同时置于缺氧环境(0.9 L/LN2、0.1 L/L CO2)中培养2、4、8和12h.分别观察它们的形态变化和神经元存活数,并用抗rhIL-6单克隆抗体进行免疫组化染色,观察缺氧对大鼠海马培养神经元IL-6免疫反应的影响.结果低氧预处理可增强海马神经元对rhIL-6的免疫反应,经低氧预处理的海马神经元缺氧后神经元存活数和对rhIL-6的免疫反应均明显高于对照组.结论低氧预处理可使体外培养的海马神经元对缺氧产生耐受,其中rhIL-6的免疫反应增加可能是海马神经元对缺氧的一种适应性变化,提示IL-6可能参与脑缺氧耐受性的形成,并在海马神经元缺氧损伤的调控中起重要作用.
关键词: 低氧预处理 人重组白细胞介素-6 海马神经元 免疫组织化学 -
阿托伐他汀对淀粉样β蛋白诱导大鼠原代海马神经元损伤保护作用的研究
目的 探讨阿托伐他汀(atorvastatin,Ato)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的体外培养原代海马神经元损伤保护作用.方法 选用出生0~24 h Sprague-Dawley大鼠乳鼠,解剖显微镜下分离海马,进行海马神经元体外培养,培养l0d后用于实验.将培养的海马神经元分为3组:(1)正常对照组:加入含有1%(质量浓度)DMSO培养基;(2)Aβ142组:加入1.25 μmol/L Aβ;(3)Aβ(1.25 μmol/L)+不同浓度阿托伐他汀组(0.1、0.5、1、2.5 μmol/L).应用CellTiter-GloTM荧光细胞活性试剂盒检测培养海马神经元ATP含量,用以反映神经元活力;通过CytoTox-ONETM试剂盒测定培养细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用以测定神经元细胞膜的损伤程度;应用免疫荧光染色观察神经元突触素(SYP)、突触后致密蛋白95(PSD-95)、bassoon蛋白表达.Western印迹法半定量检测海马神经元突触蛋白SYP、PSD-95、bassoon的改变.结果 与正常对照组比较,培养10 d海马神经元经1.25 μmol/L Aβ142作用48 h后,其ATP和LDH水平均明显降低(均P<0.01),而0.5、1.0、2.5 μmol/L Ato组能够明显抑制Aβ1-42引起的ATP和LDH水平降低(P<0.01).免疫荧光及Western blot结果显示,1.25 μmol/L Aβ1-42可使海马神经元SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达明显降低,而Ato能够明显抑制Aβ1-42引起的SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达降低.结论 Ato对Aβ诱导的体外培养海马神经元毒性有保护作用,这种保护作用可能与Ato对抗Aβ1-42引起的海马神经元SYP、PSD-95、bassoon表达降低有关.
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骨髓间充质干细胞对酒精诱导海马神经元损伤的作用研究
目的 通过体外观察骨髓间充质干细胞(BMMSC)对酒精诱导海马神经元损伤的作用,初步探讨BMMSC治疗酒精性痴呆(AAD)的可行性.方法 取胎鼠海马进行原代神经元培养并进行神经元纯度鉴定.酒精组给予100 mol/L酒精37℃培养24h,建立酒精诱导海马神经元损伤模型;BMMSC+酒精组在其培养液中同时加入BMMSC条件培养液(终浓度为50%)及100 mol/L酒精,37℃培养24 h;另设相同浓度的BMMSC条件培养液对照组(BMMSC组)及空白对照组(对照组).采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活率,以碘化丙啶(PI)/Hoechst33342染色观察细胞形态及凋亡情况.结果 原代培养的海马神经元高表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),低表达神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP),提示成功培养了纯度较高的原代海马神经元.酒精组细胞存活率(0.80±0.09)低于对照组(1.00±0.11;t=4.128,P<0.01)及BMMSC组(1.04±0.07;t=-6.052,P<0.01);BMMSC+酒精组细胞存活率(0.92±0.11)高于酒精组(t=2.555,P<0.05).BMMSC组及BMMSC+酒精组细胞存活率与对照组比较差异无统计学意义(均P>0.05).酒精组可见较多的细胞核呈致密浓染及核碎裂的凋亡细胞,BMMSC+酒精组的凋亡细胞数量明显减少.结论 BMMSC可抑制酒精诱导的海马神经元凋亡发生,提示BMMSC移植治疗AAD可能具有一定可行性.
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促红细胞生成素对低氧培养的海马神经元凋亡的影响
目的 探讨促红细胞生成素(EPO)对低氧条件下原代培养的海马神经元凋亡的影响及其可能机制.方法 培养7 d的大鼠海马神经元随机分为常氧对照组、低氧对照组和重组人促红细胞生成素(rHuEPO)低氧处理组(简称rHuEPO处理组,又分100 IU/mL、150 IU/mL两亚组),以四唑盐(MTT)比色法测定培养12、24、36 h的细胞存活率,以Western blot蛋白印迹法测定上述时间点B细胞白血病-淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达.结果 EPO可明显增加低氧培养的海马神经元存活能力(P<0.01),但两剂量组之间差异无统计学意义;rHuEPO处理组神经元Bcl-2表达比同时间点低氧对照组明显增多(P<0.05),而Bax表达比低氧对照组明显减少(均P<0.01).结论 EPO可明显增加低氧培养的海马神经元存活能力,其作用机制可能通过调控Bcl-2和Bax表达实现.
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癫痫持续发作对大鼠海马神经元的影响
目的研究实验性癫痫大鼠在癫痫发作持续不同时间对海马神经元的影响.方法24只SD大鼠随机分成4组:诱发大鼠癫痫持续状态(status epilcpticus,SE)<10、10~30、>30 min组及正常对照组.于电镜下观察各组海马神经元超微结构变化;采用免疫组化方法检测凋亡相关基因bcl-2、bax的蛋白表达及通过流式细胞技术检测细胞凋亡情况.结果SE<10 min组海马神经元所受影响不大,SE 10~30 min组海马神经元具有明显凋亡特征,SE>30 min组多数海马神经元呈坏死性改变.结论大鼠SE对海马神经元损伤有凋亡和坏死两种不同形式,这与癫痫发作的持续时间密切相关.
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培养的海马神经元致癎模型中钙离子的动力学研究
以往的研究证实,癫(疒间)发作中存在神经元内钙离子(Ca2+)超载现象,这种异常的Ca2+内流是神经元同步化放电的先决条件,同时也能触发神经元一系列病理生理改变,导致神经元损伤和可塑性的改变.我们利用培养的海马神经元致(疒间)模型,对神经元内游离钙离子([Ca2+]i)的时空分布和动力学进行研究,以探讨[Ca2+]i在NFDA4性活动中的作用.
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碱性成纤维细胞生长因子对β-淀粉样蛋白和H2O2致培养海马神经元损伤的保护作用研究
探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对β-淀粉样蛋白(Aβ1-40)和过氧化氢(H2O2)致海马神经元损伤的保护作用和机制,我们对培养的海马神经元分别施加损伤或保护因素后,检测神经元的存活率和细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i).
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超氧化物歧化酶基因突变子对阿尔茨海默病转基因小鼠β-淀粉样蛋白表达影响的实验研究
β-淀粉样蛋白(Aβ)在阿尔茨海默病(AD)发病过程中起关键作用已被研究证实.本研究应用Aβ在海马神经元表达的转β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP-C100)基因小鼠,转入铜/锌超氧化物歧化酶(G93A SOD1)基因来探讨SOD1基因表达对Aβ代谢的影响.
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小牛血清去蛋白注射液对血管性痴呆小鼠海马神经元凋亡相关蛋白Bcl-2、BaX和Caspase-3蛋白表达的影响
血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由各种脑血管病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征 [1].许多VD动物模型实验表明,基因及其表达与脑细胞凋亡有着密切的关系.以往的实验证明,小牛血清去蛋白制剂对局灶性脑缺血模型脑缺血诱导神经细胞凋亡和脑部缺血性损害所引起的神经功能缺损有保护作用 [2-3].我们旨在对小牛血清去蛋白注射液(DCSI)的VD脑保护作用机制做进一步探讨,为临床应用提供更深层次的理论依据.
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过度运动对海马神经元形态及脑源性神经营养因子表达的影响
目的:观察过度运动后海马神经元形态及其脑源性神经营养因子表达的变化,探讨过度运动导致海马组织学与超微结构改变及其脑源性神经营养因子表达的变化与运动性中枢疲劳的关系.方法:采用过度运动大鼠为实验对象,用HE染色、甲苯胺蓝染色观察海马神经元形态变化,用透射电镜观察海马神经元超微结构变化.采用SABC免疫组织化学染色方法观察脑源性神经营养因子的变化.结果:过度运动可导致海马神经元组织学与细胞超微结构改变,使海马神经元排列松散、紊乱,并且与周围神经元联络减少.部分神经元细胞体固缩、细胞核内陷、染色质聚集、线粒体肿胀或其内部出现空泡.过度运动后发生组织学形态改变的海马神经元脑源性神经营养因子表达增加,而没有组织形态改变的海马神经元脑源神经营养因子表达无变化.
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运动与中枢海马神经元再生研究进展
近年来,我国神经系统和精神疾病发病率逐年上升,已引起广泛关注.体育运动作为强身健体的有效途径,其对中枢神经系统的影响及其与脑健康之间的关系已逐渐引起人们关注,如运动可改善动物和人脑的认知功能,提高学习和记忆能力[1-3];运动能够防止衰老时突触素的丢失和促进突触素的生物合成[4];运动具有减缓慢性应激对海马损伤的作用[5,6];运动可减轻帕金森病动物模型的症状,促进帕金森病患者的康复,有效改善老年性痴呆患者的病情等[7-9].
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促肾上腺皮质激素释放因子对海马神经元树突生长发育的影响
应激对于认知和情感有重要影响,促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)作为应激反应的主要调节器,通过调控下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能,协调机体对应激的反应。近年研究表明,应激可导致小鼠海马神经元树突分支异常,树突棘缺失,而促肾上腺皮质激素释放因子受体-1(CRFR1)缺失小鼠或在CRFR1拮抗剂存在下则表现出正常的树突分支。另外,CRFR1作为G蛋白偶联受体(GPCR),可通过不同的信号通路影响海马神经元结构及相关因子的表达。目前,CRF对海马神经元损伤的分子机制仍不明确,本文就应激下CRF及其受体信号通路对海马神经元生长发育影响的研究进展做一综述。
关键词: 应激 促肾上腺皮质激素释放因子 促肾上腺皮质激素释放因子受体 海马神经元 树突 -
抑郁平胶囊对CUMS模型大鼠海马神经元细胞凋亡和BDNF表达的影响
目的 研究抑郁平胶囊对慢性不可预知性抑郁模型大鼠行为及海马神经元细胞凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2的相关X蛋白(Bax)以及脑源性神经营养因子蛋白表达的影响.方法 采用SPF级Wistar雌性大鼠,随机分为空白组、模型组、阳性药物组、抑郁平低、中、高(125、250、500 mg ·kg-1)剂量组.采用Willner慢性轻度不可预知性应激方法建立抑郁模型,观察各组大鼠行为学及海马神经元Bcl 2、Bax和脑源性神经营养因子的蛋白表达情况.结果 经过21d慢性不可预知性应激后,各组大鼠体质量、糖水偏嗜度和旷场得分明显低于空白组(P <0.05,P<0.01),而药物干预组大鼠上述3项指标明显高于模型组(P<0.01);与空白组相比,模型组Bax的表达均显著升高(P<0.05),Bcl-2和脑源性神经营养因子的表达则显著降低;与模型组相比,各给药组Bax的表达均显著降低(P<0.05),Bcl-2和脑源性神经营养因子(除低剂量组外)显著升高;以高中剂量组及阳性药组变化明显.结论 抑郁平胶囊可以改善大鼠抑郁行为,保护海马神经元,抑制或逆转慢性应激造成的大鼠海马神经元细胞凋亡,对抗慢性应激引起的海马脑源性神经营养因子减少.
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慢性孵育β-淀粉样肽(25-35)对培养大鼠海马神经元外向钾电流的影响
目的研究慢性孵育β-淀粉样肽(25-35)(β-AP25-35)对海马神经元上瞬时外向钾电流(IA)和延迟整流钾电流(IK)的影响.方法在培养的大鼠海马神经元上用膜片钳全细胞记录钾通道电流.结果β-AP25-35 3 μmol·L-1孵育细胞24 h,IK电流幅度增加(44.3 ±5.4)%,电流密度由(30.4±6.4) pA·PF-1增加至(43.8±4.7) pA·PF -1;β-AP25-35 10 μmol·L-1孵育12 h,IK电流幅度增加(69.8±4.1)%,电流密度增加至(51.6±7.9) pA·PF-1,呈浓度依赖性;β -AP25-35引起的IK增加对TEA 5 mmol·L-1敏感;β-AP25-35 上调IK的作用主要发生在β-AP25-35用药后48 h内.β-AP25-35对 IA无显著性影响.结论β-AP25-35选择性地增加海马神经元上IK,这一作用可能与β-AP的神经毒性有关.
关键词: β-淀粉样肽(25-35) 钾通道 膜片钳技术 海马神经元 -
慢性孵育β淀粉样肽25-35对培养大鼠海马神经元电压依赖性外向钾通道亚型mRNA表达的影响
目的研究慢性孵育β淀粉样肽25-35(β-AP25-35)对海马神经元电压依赖性外向钾通道亚型mRNA表达的影响.方法用RT-PCR方法检测mRNA的表达,用光密度扫描法半定量测定表达变化.结果在正常培养的海马神经元上延迟整流(Kv2.1,Kv1.5),瞬间外向(A型)(Kv4.2,Kv1.4),钙激活的大电导(rSlo)钾通道亚型均有表达.β-AP25-35 3 μmol*L-1孵育细胞24 h后,Kv2.1 mRNA的表达明显上调,其它亚型则无显著性变化;β-AP25-35上调Kv2.1 mRNA的作用主要发生在β-AP25-35应用后48 h内;60 h后Kv2.1 mRNA表达水平显著下调.结论 Kv2.1转录水平的上调可能参与β-AP25-35选择性地增加海马神经元上延迟整流钾电流(IK)的作用.
关键词: RT-PCR 淀粉样β肽25-35 电压依赖性外向钾通道 海马神经元