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人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化及相关基因时序表达的影响
背景:大量有关动物的体内外研究表明,骨髓间充质干细胞在心肌微环境或模拟心肌微环境的作用下可分化为心肌细胞.然而,类似的人类研究报道较少,同时相关的分化机制也不甚清楚.目的:探讨人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响及相关基因的时序表达.方法:体外分离培养人类骨髓间充质干细胞,传至第4代加入自体心肌匀浆上清液诱导骨髓间充质干细胞,持续作用2周.相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态变化,免疫荧光方法鉴定心肌特征性肌动蛋白α和肌钙蛋白的表达,应用半定量RT-PCR技术分析Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC、肌钙蛋白等相关基因在分化过程中的动态时序表达.结果与结论:经心肌匀浆上清液诱导后,骨髓间充质干细胞体积变大,立体感增强,形态近似棒状.诱导2周时肌动蛋白α及肌钙蛋白阳性细胞比例分别为25.53%和23.48%.Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C基因在诱导后3 d表达开始增强, 其中GATA-4、MEF-2C诱导后5 d达高峰,以后维持在较高水平,Nkx-2.5则随诱导时间逐渐增强;α-MHC、肌钙蛋白基因诱导前无表达,于诱导第3天出现表达,以后维持在高水平.结果提示,心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞具有定向诱导作用,在此过程中,伴随着Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC和肌钙蛋白基因的时序表达变化.
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改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化培养大鼠嗅鞘细胞
背景:细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,嗅鞘细胞被认为是适合的种子细胞之一,但目前对其培养纯化的方法尚无公认标准.目的:运用改良差速贴壁法+含同源嗅鞘上清液的无血清条件培养液来纯化培养嗅鞘细胞,以期建立一种新颖、经济、简单、实用的纯化培养成年大鼠嗅鞘细胞的方法.设计、时间和地点:观察性对照实验.实验于2008-02/06在苏州大学干细胞与组织工程实验室完成.材料:健康成年SD大鼠6只.体质量150-180 g.方法:①无菌条件取大鼠嗅球组织,消化、离心去除上清液后,用含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬,稀释的单细胞混悬液均分成3份,分别用于单纯改良差速贴壁、单纯无血清条件培养液纯化和改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化的实验.②单纯改良差速贴壁:将单细胞混悬液以8000个/cm2密度种植于无包被的25 cm2培养瓶中.经12 h+24 h两次差速培养后,吸出细胞上悬液,计数板计算浓度后,按1×109L-1浓度重新种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中继续培养3周.⑧单纯无血清条件培养液纯化:将单细胞混悬液用预先收集并制备的含同源嗅鞘培养上清液的无血清条件培养液直接种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中,孵育两三天后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F12培养基继续培养3周.④改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化:经12 h+24 h两次差速纯化,吸出上悬液接种于培养皿中继续培养2.0~3.0 d后,改换成无血清条什培养液,孵育36~48 h后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F-12培养基继续培养.以后视情况每3~5 d半量换液1次,培养3周.主要观察指标:运用倒置显微镜观察各组不同时间的嗅鞘细胞生长状况和形态学特征.采用GFAP、NGFRp75和Hoechst33258等抗体,于分离培养14 d后进行细胞免疫荧光染色并检测嗅鞘细胞的纯度.结果:①倒置显微镜观察:差速后3 d内有大量细胞贴壁生长,细胞形态较混杂,辨认嗅鞘细胞较困难.差速后再运用无血清条件培养液2 d后,可见纯度较高的典型嗅鞘细胞形态,以双极梭形和多极为主,细胞突起细长.伴少量扁平状"油煎蛋样"细胞.继续培养至14 d可见细胞立体感及折光性佳,数量和纯度高.培养3周后3组细胞开始老化,活力明显下降,成纤维等杂细胞开始挤占原嗅鞘细胞生长空间.②免疫荧光染色显示嗅鞘细胞特异性表达GFAP和NGFRp75,单纯差速后嗅鞘细胞纯度仅有72%~75%,单纯无血清条件培养液纯化后仅为48%~52%,改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化组纯度可达88%~92%.结论:实验建立了完善的成年大鼠嗅鞘细胞培养纯化新方法.
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白介素6和白介素8对单核细胞组织因子表达的影响
白介素6(IL-6)是一种多功能的细胞因子,除涉及感染、炎症等急性期反应外,对T、B细胞的发育、骨髓造血细胞增殖均有很重要的作用[1]。自多发性骨髓瘤患者血浆IL-6水平增高被发现后,又发现IL-6血浆水平增高还见于弥散性血管内凝血(DIC),并且与DIC的严重程度、治疗反应和DIC是否伴有脏器损伤有关。IL-8属于α型趋化因子,在其多种生物特性中,有一种趋化中性粒细胞的功能。在整合素参与下,作用于血小板和内皮细胞,使CD16和CD18的表达和IL-6一样卷入凝血和血栓形成的过程。近又证实单核细胞表面可表达白介素6受体(IL-6R),单核细胞也可能受到IL-8的趋化作用。单核细胞是血液细胞中重要的组织因子(TF)来源的细胞,TF在DIC和其他血栓形成病变中的作用是不容置疑的[2]。本文就IL-6和IL-8对外周血单核细胞体外培养中TF表达的影响,研究IL-6、IL-8与单核细胞、TF在血栓形成中的相互关系。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 外周血单核细胞(PBMC) 取自10名正常健康志愿者外周血。1.1.2 试剂 rhIL-6、hIL-6 MoAb和rhIL-8、IL-8 Mo-Ab购自STAGO公司。TF ELISA检测试剂盒购自Immunotech公司。Ficoll液、Hypague液购于Sigma公司。RPMI1640培养液、NCS购于Sigma公司。1.2 方法1.2.1 外周血单核细胞分离 采用密度梯度离心法。1.2.2 外周血单核细胞原代培养 将2×105ml-1的外周血单核细胞悬浮于20%的NCS RPMI1640培养液中,以5%CO2 37℃培养24h。将PBMC培养液用水平离心机以3 000 r/min,离心10 min,取上清液待测。1.2.3 上清液TF抗原含量检测 以ELISA方法测定外周血单核细胞培养(加或不加rhII-6、hIL-6 MoAb和rhIL-8、IL-8 MoAb)上清液中的TF抗原含量。
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目的:研究sIL-2R和TNF-α在实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)免疫发病机制中的变化与作用.方法:应用豚鼠诱导EAE动物模型.在MBP+CFA免疫豚鼠的第8、15、22天处死动物,取脾细胞,加入ConA诱生培养,收集上清液,采用ELISA方法测定sIL-2R水平,采用生物活性测定法检测TNF-α水平.结果:EAE组的sIL-2R与TNF-α水平明显高于正常对照组.结论:sIL-2R及TNF-α在EAE免疫发病机制中具有重要作用.
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秦艽提取物对大鼠佐剂性关节炎作用的研究
1 实验材料1.1 试剂卡介苗:卫生部上海生物制品研究所生产,批号:20111112;角叉菜胶:辽宁省药物研究所生产,批号:201201006.1.2 药品及制备将秦艽药材粗粉用水提取后加适量75%乙醇沉淀,取上清液除醇浓缩.
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鲜地龙外敷抗炎作用的实验研究
1实验材料鲜地龙原液的制备:鲜地龙购于天津贾立明蚯蚓养殖场,为大平2号,取鲜地龙,吐泥,洗净泥沙,匀浆致细胞破碎(显微镜下判断),放置24h,离心,取上清液(鲜地龙原液).对照组药物:吲哚美辛,山西临汾云鹏药业有限公司生产,批号:20041101.试剂:二甲苯,哈尔滨化工化学试剂厂,批号:200410081.动物:雄性昆明种小鼠50只,体重(22±2)g,雄性Wistar大鼠50只,体重180~220g,均为佳木斯大学实验动物中心提供.
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瑞香狼毒提取物逆转人肝癌耐药细胞多药耐药的实验研究
1实验材料实验动物:Balb/c小鼠40只,体重18g~22g,SPF级,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供.瑞香狼毒水提物(SCLA)的制备:将瑞香狼毒(由内蒙医药公司提供,经鉴定为瑞香科狼毒)200g加水400mL,煮沸20min2次,上清液混合后过滤、浓缩,制成口服液,每毫升含生药1.0g.细胞系:人肝癌细胞系Bel-7402引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库.主要试剂及仪器:酶联免疫检测仪,南京华东电子管厂产品.
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鲜地龙外敷抑制瘢痕形成的实验研究
1 实验材料 动物:日本大耳白兔24只,4月龄,雌雄各半,体重2.0~2.5kg左右,由佳木斯大学实验动物中心提供.药品:积雪草甙霜软膏由上海现代制药股份有限公司生产,批号061004.鲜地龙原液制备:取鲜地龙,吐泥,洗净泥沙,匀浆致细胞破碎(显微镜下判断),放置24小时,离心,取上清液即为鲜地龙原液.
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平喘宁对哮喘豚鼠白细胞介素5等的影响
1材料与方法选用350~450g左右雄性豚鼠24只,随机分成正常对照组、哮喘组、平喘宁治疗组,每组8只,其中正常组用乌拉坦1.2g/kg麻醉后,从豚鼠颈动脉取血2ml,后给予豚鼠气管插管,用10ml生理盐水注入支气管肺组织内,反复抽吸3次,将抽取的肺泡灌洗液(BALF)放入离心管中,1000rpm,离心10min,取上清液-20℃保存,待测IL-5.
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清心饮Ⅱ号对病毒性心肌炎小鼠心肌穿孔素表达干预作用的研究
1实验材料1.1 药品清心饮Ⅱ号(由人参、丹参、苦参组成)高、中、低3个剂量组水煎醇提,由浙江中医学院制剂室提供,其中高剂量组生药含量为3g/ml,中剂量组为2g/ml,低剂量组为1g/ml.玉丹荣心丸,由上海黄山制药厂提供(生产批号为:20001001),取说明书成人剂量的30倍的药物,以蒸馏水充分溶解后超声萃取2h,取上清液浓缩而成.
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地塞米松对成人成骨细胞增殖和分化影响的实验研究
[杨林,陶天遵,刘枫晨,等.中华骨科杂志,2001,21(8):493]目的研究地塞米松对体外培养的成人成骨细胞增殖和分化的影响 .方法取成人的髂骨松质骨,采用胶原-胰蛋白酶消化法,获得松质骨中的成骨细胞,进行纯化和培养.在此基础上,添加1×10-8mol/L的地塞米松, 连续加药3d,置入CO2孵箱中培养,同时作不加药的空白对照.通过倒置相差显微镜和电镜观察增殖和分化情况,检测上清液中的碱性磷酸酶和骨钙素含量,并且对成骨细胞的凋亡情况进行测定.结果胶原-胰蛋白酶消化法得到的成人成骨细胞,生长情况良好 ,生化指标稳定可靠,细胞纯化效果佳,可以满足相关研究的需要.进一步研究结果显示, 在地塞米松浓度为1×10-8mol/L,成骨细胞密度为10 000/ml的条件下,上清液中碱性磷酸酶和骨钙素含量明显增高,骨结节形成加速,与未加药的对照组比较差异均有非常显著性意义,同时成骨细胞的凋亡情况无明显变化.结论地塞米松对体外培养的成人成骨细胞的增殖和分化有明显的促进作用,可以作为促进骨形成的阳性对照应用于抗骨质疏松和筛选研究.
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胆红素对尿八联分析仪检测尿胆原结果的影响
许多疾病可导致胆红素和尿胆原结果的异常,如肝炎、肝硬化、肝癌等.但胆红素、尿胆原易分解且对尿胆原检测有一定的干扰.我们比较了手工方法与尿液分析仪对各种肝胆等疾病尿胆素(BIL)和尿胆原(URO)检测结果,探讨尿液中胆红素对尿胆原测定的影响.1 材料与方法(1) 仪器试带条桂林市医疗电子仪器厂优利特200及其优利特8A尿试纸条.(2) 手工测定法试剂胆红素采用改良哈氏浓缩试剂,尿胆原采用欧氐试剂.(3) 标本采集采用本院病人标本,其中原发性肝癌110例,阻塞性黄疸48例,肝占位28例,胆管癌25例,胆结石19例,胆囊炎19例,其他33例.(4) 手工法①尿胆红素检测:取尿液约5ml,置于15×100mm试管中,约加其体积一半的100g/L,氯化钡溶液并混匀,以RCF1600g离心3~5min,轻轻将上清液弃去,于管内沉淀上加氧化剂2-3滴,放置片刻,观察结果.②尿胆原检测:如尿内含胆红素,应先取尿液5份,加100g/L氯化钦1份,混匀离心沉淀除去胆红素,取上清液1ml,放入10×75mm试管内,加入欧氏试剂0.1ml混匀,静置10min,在白色背影下观察结果.(5) 仪器法按照尿八联分析仪检测要求检测.
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实验教学中寄生虫虫卵标本的回收再利用
寄生虫学实验教学标本日趋匮乏.1983年以来,我们将实验教学用的虫卵封片标本改为直接滴片观察,用后将虫卵回收再利用,获得较满意的效果,也有利于培养学生的动手能力.材料与方法将收集的虫卵用10%甲醛固定,加少量甘油(约2%),再以5%甲醛置换后于4℃冰箱保存备用.学生实验用过的含虫卵的载玻片,置于盛有5%甲醛的广口容器中涮洗,待沉淀后去上清液,用100目网筛过滤后倒入三角量杯中自然沉淀,倾去上清液,再置换于含适量甘油的5%甲醛中,保存于4℃冰箱内.
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含A蛋白金黄色葡萄球菌吸收试验用于乙型脑炎血清学诊断的初步探讨
自发现含A蛋白金黄色葡萄球菌(SPA)能与人的免疫球蛋白G(IgG)Fc段发生非特异性结合后[1],即有作者[2]根据已结合IgG的SPA,经离心后取被检血清上清液检出IgM和IgA的原理,首次用于风疹病毒感染的血清学诊断,并为病毒血清学试验区分IgM与IgG抗体提供了新的简便方法.
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谷草转氨酶线粒体同工酶在各型病毒性肝炎的检测及临床意义
谷草转氨酶(GOT)的同工酶有来自胞浆上清液的GOTs(sobuble GOT)和来自线粒体的GOTm(mitocheon-drial GOT)两种.
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毛细支气管炎患儿外周血单个核细胞诱生IL-4、IL-6、IFN-γ和总IgE的水平及意义
武汉市儿童医院呼吸科 RSV是引起小儿病毒性肺部感染常见的病原之一,近十年来RSV毛细支气管炎(简称毛支)占我国婴幼儿病毒性肺部感染第一位[1]。为了解RSV感染后细胞因子水平与临床症状相关互系,我们于1998年12月~1999年3月对30例临床确诊毛支住院患儿进行病原学和部分细胞因子与血浆总IgE水平测定,现报告如下。对象与方法 一、 对象 1998年12月~1999年3月住我科30例患儿,均符合毛支诊断标准[2]。自发病至纳入研究时间均在48小时内,平均住院2周。其年龄小47天,大2岁3月,小于6月龄者有23例(79%)。对照组为门诊健康体检者20例,近期无特别疾病史。 二、 方法 鼻咽分泌物RSV检测:对新住院入选研究对象,次日清晨,负压吸引鼻咽分泌物1.5ml,放置0.01 M PBS中,加入抗粘液剂3滴,反复震打使粘液稀薄,离心沉淀,弃上清液,重复沉淀2次,取沉淀细胞涂片,碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法(APAA)检测,试剂盒由北京元康医学实用技术有限公司提供,按说明书步骤进行操作。测PBMC诱生细胞因子的研究对象入院次日晨静脉采血2ml,肝素抗凝,常规分离PBMC(沉淀1×106/ml)加植物血凝素(PHA终浓度100 mg/ml),37℃ 5%CO2温箱培养48小时,收集上清液待测,IL-4、IL-6、IFN-γ及血浆中总IgE采用ELISA法,试剂盒均由海南华美生物有限公司提供,按说明书进行操作。
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多功能沉淀罐的设计
本文主要是对多功能沉淀罐的结构和工作原理以及特点作一论述.
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免疫抑制剂对白细胞糖皮质激素受体的调节作用
1 材料和方法1.1 材料取女性献血员静脉血200 ml,肝素抗凝,弃血浆,加2倍体积的PBS、1.5倍体积的DextranT500混匀静置15 min,上清液2 000 r/min离心5 min,取沉渣加Tris-NH4Cl溶液37℃温育10 min,使残余的红细胞破裂,2 000 r/min离心5 min,取沉淀物,用PBS洗2次,即可得到白细胞悬液.1.2 方法 Dex、CTX、CsA均设有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/ml共6种浓度,选择三药单用及三药合用,分别加入上述白细胞悬液中作用一定时间后进行白细胞GR特异结合测定,采用放射配体结合法,3H-Dex(1.78 TBq/mmol,英国放化中心产品)浓度为15 nmol/L,用一点分析法.
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复方黑故纸酒剂治疗白癜风32例临床疗效观察
方法:黑故纸60g,紫草20g,加60度白酒至1000mL浸泡2周,取上清液,压榨残渣,压出液与上清液合并滤过,置密闭容器中备用.用时取储备液100mL置外用药瓶中,涂于患处,每日3~5次.疗程为3个月.
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骨髓间充质干细胞培养上清液在未成熟鼠脑损伤中的免疫调节作用
目的:观察骨髓间充质干细胞上清液对未成熟鼠脑损伤模型炎症因子白细胞介素-6(IL-6)及转化生长因子-β(TGF-β)的影响,探讨骨髓间充质干细胞旁分泌作用干预未成熟鼠脑损伤的机制.方法:采用健康SD大鼠的24只新生3d乳鼠建立早产儿脑损伤模型,分为对照组、磷酸缓冲溶液(PBS)干预组和细胞培养上清液干预组.模型制作成功后,各组侧脑室立体定向移植PBS及上清液,制备侧脑室HE染色病理切片,采用酶联免疫吸附测定法检测各组1、3、5 d IL-6及TGF-β的分泌趋势及分泌浓度.结果:早产儿脑损伤模型分泌IL-6随天数递增而增多,上清液干预组分泌IL-6的量明显少于对照组及PBS干预组,分泌TGF-β的量明显高于对照组及PBS干预组.结论:骨髓间充质干细胞上清液可以改善未成熟鼠脑损伤的预后,降低促炎因子,增加保护性因子的分泌量.