荧光定量PCR检测食品中沙门氏菌研究

实时荧光定量PCR技术（FQ-PCR）实现了PCR从定性到定量的飞跃，可对目标DNA分子起始拷贝数精确定量。因其检测方法精确、灵敏、污染途径少，已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法，在食品中安全微生物的鉴定也有重要应用[1]。沙门氏菌是引起食物中毒为常见的致病菌，因此，建立食品中沙门氏菌中荧光定量PCR检测方法有重要的研究意义。材料与方法?1菌株：鼠伤寒沙门氏菌(C77-31)有中科院微生物所提供，肉类、奶制品等产品均购于农产品市场。2主要试剂和设备：DNA提取试剂购买于美国Invitrogen公司；Taq酶和缓冲液购买于日本TaKara；opction2荧光定量PCR购买于美国MJ公司；超速离心机购买于Eppendorf；细菌鉴定仪；所用的常规试剂均为分析纯，购买于国药化学试剂有限公司；方法，将标准菌株在XLD、三糖铁斜面和肉汤培养基上培养，从肉汤培养基中取一定量的菌液装入EP管中，离心，去上清，加入双蒸水，沸水浴、冰水浴，离心，取上清。食品样品采用沙门氏菌国标检测法(GB?4789.4-2010)中BPW前增菌之后的培养液装入EP管中，进行相同的操作。引物探针设计，在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象，然后用PrimerPremier5搜索引物和用Oligo验证评估引物。经过筛选进行特异性和灵敏度的实验。

XW630对大鼠成骨细胞雌激素受体mRNA表达的调控研究

目的:探讨抗骨质疏松新化合物XW630促进成骨作用的机理.方法:从SD大鼠颅骨中分离培养成骨细胞,首次采用具有较高灵敏度的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术直接从大鼠成骨细胞中检测雌激素受体mRNA的表达.结果:XW630具有促进成骨细胞ERmRNA表达的作用,且呈时间依赖性.在相同浓度(106mol/L)条件下,XW630作用强于四环素加哌嗪雌酮及单纯雌酚酮(P<0.05).结论:XW630能有效地促进成骨细胞ERmRNA的表达,并可能通过ER在骨代谢中起作用.

蓝谱环介导等温扩增试剂盒（通用型）

环介导等温扩增（LAMP?）方法采用4条引物来识别目的基因上的6个特异区域，利用具有链置换特性的DNA聚合酶，在恒温（60~65?C）条件下进行扩增，15~60m i n内的扩增效率可达109~1010倍，对仪器设备要求低，水浴锅或恒温箱即可，反应结果可通过肉眼直接观察。DNA样本或RNA样本均可直接使用试剂盒进行反应。

蓝谱Loopamp?军团菌检测试剂盒

本试剂盒可快速、简单、高灵敏度、高特异性的检测出环境水样中的军团菌属，针对军团菌属保守的16SsRNA基因设计特异性LAPM?反应引物。该试剂盒包含前处理试剂，经过简单的核酸提取即可用于LAMP?反应，能在1小时内完成检测，反应结果无需电泳，加入荧光染料即可通过肉眼直接观察反应结果。

逆转录聚合酶链反应在轮状病毒肠炎诊断中的应用研究

1.材料与方法:150份粪便标本于1999年11月至2000年2月取自本院住院的急性腹泻患儿.150例患儿年龄为40天龄～2岁;病程1～14天.收集每例腹泻患儿的新鲜粪便标本2份,1份立即进行乳胶凝集试验,1份置于-20℃冰箱待行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测.RT-PCR参照Taniguchi等[1]的方法抽提RNA并做HRV RT-PCR反应,引物由上海生工合成.

浙江省检出四株新的HIV-1 B/C重组毒株

HIV具有高度的遗传多样性和变异性,由于其颗粒基因组的独特构成(两个拷贝基因组)和引物模板“跳跃”基因复制机制等特征,造成HIV具有较高频率的基因重组发生.

丙型肝炎病毒西安株2a型包膜蛋白E区部分cDNA的分析

丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白区（E区）基因是HCV基因组中变异大的部位，不同分离株的核苷酸差异可达40%左右［1］。作者对陕西省HCV地方株的全部E1，部分E2/ NSI区进行了序列测定，并与已发表的多个株做同源性比较。 1.材料和方法：HCV血清取自西京医院丙型肝炎患者，血清经5′非编码区通用引物RT-PCR确认HCV RNA阳性，引物参照HC-J6设计［2］。序列分别为：R1（+）GTGGGTAA-GGTCATCGAT(695～712)，R2（+）GCCGACCTCATGGGGTAC-(731～748)，R3（-）ACCTAGTGCCAACTGCCATTGGT(1 586～1 603)，R4（-）GTTGATGTGCCAACTGCC(1 592～1 609)。 用异硫氢酸胍-冷酚法一步提取HCV RNA，反转录成cDNA，用R1/R4，R2/R3进行套式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定，产物纯化、回收，与PGEM-T载体连接，克隆并测序。 2．结果：将所分离毒株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与已报道的HC-J6，HC-J1，BEBE1，HC-J8，HCV-H，HCV-HB，HCV-T的相应序列进行比较。从表1可见，在核苷酸水平上分离株E区与HC-J6相应序列的同源性为78.2%，与其他几株的同源性相对要低一些，与中国河北株HCV-HB的同源性低；在氨基酸水平上分离株E区与HC-J6相应序列的同源性为75.7%，与其他株的同源性低，与中国河北株HCV-HB的同源性低。 3.讨论：HCV 核酸存在广泛的异质性，其中E区不断发生变异，可能是使病毒在体内持续存在的原因，其变异亦可能与疾病程度、对干扰与治疗的抵抗、引起慢性化及肝细胞癌等有一定相关，赵小宁等［3］已经用RT-PCR法从1例陕西地区丙型肝炎患者血清中扩增并克隆和测定了5′NCR，C区的基因序列，分析同源性为2a型，本次研究用同一份血清，测定了全部E1区，部分E2/NSI区共878 bp的核苷酸序列，将所得序列与已报道的几株HCV序列比较后发现，我们的分离株同HC-J6的同源性大，同属于2a亚型。我国已有完整克隆的河北株、北京株和台湾株，但都属于HCV-1b型，本次对2a型的实验克隆对全面了解HCV基因组的结构及其变异，对HCV的基础及临床研究都具有重要意义。

应用改进的聚合酶链反应快速检测水中的肠道病毒

近年来，聚合酶链式反应(PCR)技术由于特异性强、操作简便已广泛用于环境中肠道病毒的检测。常规PCR 1次只能检测1种病毒，而水中病毒有多种，因而不能满足实际应用的需要。Tsai等［1］用多重PCR1次检测脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒和轮状病毒3种病毒，这种方法需要引物较多，引物之间易相互干扰，检测3种以上病毒就比较困难。Zoll等［2］采用通用引物PCR技术检测肠道病毒，但是这种方法只能证明有无肠道病毒的存在，不能鉴别病毒种类。我们首次将通用引物PCR和多重PCR相结合用于肠道病毒检测，兼顾了两者的优点，克服了各自的不足。

284 有助于鉴别人参优选品种Aizu K-111的RAPD引物及其扩增序列

川芎内生细菌DGGE分析条件的筛选与优化

目的:针对川芎内生细菌16S rDNA序列进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)适宜序列的筛选与电泳条件优化.方法:川芎内生细菌16S rDNA的V3区及V6 ～ V8区分别进行聚合酶链反应(PCR)及巢式PCR以获得各菌种的目标DNA序列.采用DGGE垂直电泳法优化凝胶变性梯度,时间间隔法优化电泳时间,并根据电泳效果对电压和电泳时间组合进行修正.结果:川芎内生细菌16S rDNA V6 ～V8区序列更能有效排除宿主植物DNA的干扰,获得更加丰富的内生细菌DNA序列.针对该区的DGGE佳分析条件为变性剂梯度55％ ～70％ (Gel 6％),电泳温度60℃,电压50 V,电泳时间16h.结论:利用该优化条件能有效分离川芎各内生细菌16S rDNA V6～V8区序列,为川芎内生细菌的群落结构PCR-DGGE分析提供可靠的技术基础,为其他药用植物内生细菌的菌群多样性分析提供参考.

应用PCR和ELISA法检测血清HBV的结果分析

在1985年美国Cetus公司遗传部Mullis等发现聚合酶链反应(PCR)技术并用其可检测到fg水平后,从基因测得了HBV DNA与HBV血清学标志物的相互关系.本文对本地区1368例(名)各类患者及正常人血清HBV DNA、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb进行了检测,现将其结果报道如下. 材料与方法 1 HBVDNAPCR检测采用美国MJ公司生产的PTC-100型DNA扩增仪,PCR引物由上海复生生物工程研究所提供,严格按说明书操作.

PPARγ在大鼠肝纤维化形成过程中的动态变化

研究表明,PPARγ在肝脏代谢功能方面发挥重要调节作用,其功能改变与一些肝脏疾病的发生发展有某种相关性[1].本研究针对大鼠正常肝组织及不同程度的肝纤维化组织中PPARγ的表达进行观察,旨在进一步研究PPARγ与肝纤维化发生机制的关系.1 材料与方法1.1 主要试剂:兔抗鼠PPARγ多抗和抗α-SMA单抗(Santa Cruz公司),Trizol及RT-PCR试剂盒(北京中山生物技术有限公司),PCR引物由上海生工生物工程技术公司合成.

瘦素及Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白在肝纤维化大鼠肝组织中的变化

瘦素(Leptin)足一种由肥胖基因编码的分泌型蛋白质,其与肝病的关系受到关注[1].本实验研究了大鼠肝纤维化发生发展Leptin及Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的变化.1 材料方法1.1 试剂:RT-PCR两步法试剂盒(上海捷瑞),引物(上海生工).兔抗大鼠Leptin与Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体(武汉博士德).

用RAPD技术分析中国嗜人按蚊种型

目的鉴别中国不同地区嗜人按蚊,特别是海南岛与内陆嗜人按蚊间有无种型差异. 方法海南、四川、江苏三地收集嗜人按蚊标本,通过对蚊基因组DNA的提取纯化及RAPD-PCR扩增和产物检测,终筛选出3条引物并制定出稳定的RAPD图谱. 结果三地嗜人按蚊绝大部分谱带完全相同,但又有明显不同的谱带存在. 结论中国不同地区嗜人按蚊存在一定的种型差异,并为解释海南岛与内陆嗜人按蚊在生态习性和传疟作用方面的不同提供了科学依据.

不同引物检测甲型H1N1流感病毒的比较研究

目的 筛选灵敏、特异的甲型H1N1流感病毒核酸检测方法.方法 采用国家流感中心推荐的甲型流感病毒(H1N1)核酸引物和1对自行设计的引物,同时选择市售荧光定量PCR试剂盒,分别对不同浓度的流感病毒进行RT-PCR或荧光定量PCR扩增,比较其检测的灵敏度和特异性.结果 荧光定量PCR检测H1N1病毒核酸的灵敏度为10-5(病毒稀释度),高于普通RT-PCR的灵敏度10-3～10-4;RT-PCR扩增甲型流感病毒(H1N1)核酸时,自行设计引物的灵敏度为10-4,高于中国CDC推荐引物的灵敏度10-3.2种引物的特异性一致.结论 对于甲型(H1N1)流感病毒疑似样品的检测,荧光定量PCR是较灵敏的方法,但从成本和灵敏度两方面考虑,自行设计的引物更适合基层疾控机构采用.

滇西南地区埃及伊蚊种群微卫星标记筛选研究

目的 研究滇西南地区埃及伊蚊种群遗传学特征,针对该地区的埃及伊蚊种群筛选新的微卫星位点.方法 从美国国立生物技术信息中心GenBank数据库中下载埃及伊蚊全基因组数据,利用Tandem Repeats Finder软件查找全基因组中的微卫星位点,选择重复单位为2～4 bp且重复次数<30的微卫星位点,对其侧链进行BLAST比对,选择在基因组中单拷贝的位点设计引物,再对引物进行BLAST比对,选择扩增产物为单拷贝的引物进行相关筛选.结果 从17个全基因组中共获得80条微卫星序列,并成功设计出11对多态性引物,核心序列包括5对2碱基重复,5对3碱基重复以及1对4碱基重复,共有98个等位基因,平均每对引物有9个等位基因,观察杂合度平均值为(0.394±0.026).结论 设计引物可稳定地扩增出目标条带,且多态性较高,可以用于埃及伊蚊的种群遗传学研究.

探讨基于不同基因设计的巴尔通体特异引物

巴尔通体是一群革兰染色阴性、营养要求苛刻兼性细胞内寄生的需氧多形杆菌,呈全球性分布的新发现的病原体,重要性不断增加.巴尔通体培养较难,表型特征少,其鉴定主要根据基因扩增.合适的引物尤为重要.在巴尔通体检测、鉴定和种系发生研究中,设计和应用引物较多,主要基于16S rDNA、16S～23S rRNA ITS、gltA、rpoB、ribC、groEL和ftsZ基因等.该文就几种常被选择基因及所设计的引物在巴尔通体研究中的运用做一综述.

双重PCR技术诊断鼠疫的特异性比对

聚合酶链反应(PCR)现已广泛应用于诸多领域,是分子生物学、临床诊断、法医检验实验室的常规技术.随着现代分子生物学技术的发展,鼠疫研究领域中PCR逐步得到应用与完善.本研究组依据鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的6×106和65×106质粒上pla[1]与F1[2]基因核苷酸序列区,合成2对引物,并于1999年建立了双重PCR方法[3].

利用广谱细菌聚合酶链反应-DNA测序技术进行细菌病因学诊断

16S核蛋白体RNA基因(16S rRNA gene, 16S rDNA)存在于所有细菌中,其基因序列由保守性序列和多样性序列相间排列而成.其中高度保守的序列几乎在所有细菌中都是一致的,而多样性序列随细菌种类不同而不同.因此,在16S rDNA 多样性序列两侧的高度保守序列中设计聚合酶链反应(PCR)引物,便可将多种细菌的多样性(特异性)基因片段扩增,再通过DNA测序技术,就能确定细菌的种类.

应用双重聚合酶链反应检测乙型、丙型肝炎病毒

常规聚合酶链反应(PCR)方法对患者HBV和HCV需要分别检测，因而操作繁琐，费时费力，且增加了污染的机会，为此，我们建立了双重PCR技术，实现一步法同时进行HBV和HCV的检测。　　选取肝病患者血清标本115例，20例正常对照标本采自HBsAg阴性、肝功能正常的献血员。核酸提取采用蛋白酶K消化，酚／氯仿抽提，乙醇沉淀，将提取的DNA和RNA复悬于焦碳二乙酯处理过的蒸馏水中，并加入2U RNA酶抑制剂Rnasin。PCR反应在核酸提取管中进行，总体积50μl，反应条件为10 mmol／L Tris·Cl(pH8.3)，50mmol／LKCl，2mmol／LMgCl2，0.5μmol／L HBV和HCV引物，0.2 mmol／LdNITP,AMVRT逆转录酶2U，Tag DNA聚合酶2U，RNA酶抑制剂Rnasin 10 U，混匀。