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原花青素影响Aβ25-35诱导PC12细胞周期变化与细胞凋亡的可能机制
目的 探讨原花青素(Proanthoeyanidins,PAC)对β-淀粉样肽(25-35)[β amyloid peptide-(25-35),Aβ25-35]诱导体外血清饥饿培养的PC12细胞周期异常与凋亡保护作用的可能机制.方法 种人培养瓶或板的PC12细胞贴壁后用常用血清饥饿培养使细胞同步于G0期,30 mg/L的PAC预处理血清饥饿培养的PC12细胞,加入终浓度为25μmol/LAβ25-35处理0～20 h,通过RT-PCR和Western blot从mRNA及蛋白水平检测细胞周期蛋白依赖性激酶4(Cyclin-dependentkinase-4,CDK4)、磷酸化的视网膜纤维母细胞瘤蛋白(phosphorylated Retinoblastoma protein,pRb)、腺病毒E2启动子结合因子1(Adenovirus E2 factor-1,E2F1)、B细胞淋巴瘤/白血病关联X蛋白(B-cell lymphoma/leukemia-2 As,sodated X protein,bax)基因表达的变化.结果 与Aβ25-35诱导组比较,CDK4、E2F1、bax mRNA表达和CDK4、pRb、Bax蛋白表达降低.结论 PAC可能通过下凋CDK4、pRb、E2F1的表达,从而降低bax的活化,对Aβ25-35诱导的PC12细胞周期异常与凋亡起保护作用的.
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远志皂苷调节细胞自噬抗Aβ25-35诱导的SH-5Y5 Y细胞凋亡的研究
目的 从细胞自噬角度探讨远志皂苷(tenuifolin,Ten)抑制Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的作用及分子机制.方法 建立Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型,通过MTT法和流式细胞术测定细胞活力和凋亡率,单丹磺酰尸胺(MDC)染色检测自噬小泡的变化,Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平的变化.结果 Ten抑制Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞活力降低及凋亡率增加,减少Aβ25-35诱导的自噬体增加,显著降低自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达水平.结论 Ten通过调节Aβ25-35诱导的细胞自噬,从而抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,发挥神经保护作用.
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远志皂苷调控RAGE和LRP1的抗Aβ诱导的氧化应激作用研究
目的 探讨远志皂苷(TEN)对转运蛋白RAGE和LRP1的调控作用,以及对Aβ诱导的PC12细胞氧化应激的保护作用.方法 建立Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型,MTT法测定细胞活力,Western blot 检测RAGE和LRP1蛋白表达水平变化,分光光度法检测活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)浓度及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性变化.结果 TEN能明显下调RAGE的表达,上调LRP1的表达,并且抑制Aβ25-35诱导引起的ROS、MDA浓度增加,提升Aβ25-35诱导引起的SOD、GSH-Px活性降低.结论 TEN可能通过调控Aβ转运清除蛋白RAGE和LRP1的表达,抑制Aβ诱导的氧化应激效应,发挥抗Aβ神经毒性和神经保护作用.
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β-淀粉样蛋白Aβ25-35诱导HT22细胞自噬及其对V-ATPase表达的影响
[目的]探讨β-淀粉样蛋白Aβ25-35诱导HT22细胞产生自噬及与V-ATPase变化的关系.[方法]将HT22细胞分为对照组、无血清培养组、Aβ处理组和Aβ+ Bafilomycin A1组,不同浓度的Aβ25-35作用于HT22细胞24 h,用CCK8测定细胞活力变化,免疫细胞荧光检测自噬斑点变化,及Western blot检测LC3、V-ATPase蛋白变化.[结果]Aβ可以诱导HT22细胞出现明显的自噬现象,且这种自噬同Aβ的浓度以及作用时间具有一定的相关性.V-ATPase的表达伴随自噬的增多也逐渐增多.Bafilomycin A1可以进一步诱导V-ATPase增加,增加细胞内自噬体的聚积.[结论]Aβ25-35可诱导HT22细胞产生自噬,且与V-ATPase表达有关.
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绞股蓝正丁醇部位对NG-108受损细胞的保护作用研究
目的:研究绞股蓝正丁醇部位对体外Aβ25-35造成NG-108细胞损伤的保护作用.方法:采用MTT法,观察直接加药和含药血清对绞股蓝正丁醇部位在体外对Aβ25-35造成NG-108细胞损伤模型的增殖作用.结果:直接加药法表明,绞股蓝正丁醇部位5、10 μg/ml浓度对Aβ25-35损伤的NG-108细胞均有明显的增殖作用(P＜0.01)；含药血清法表明,10％绞股蓝正丁醇部位含药血清对Aβ25-35损伤的NG-108细胞体外生长有促进增殖作用(P＜0.05).结论:绞股蓝正丁醇部位可促进Aβ25-35损伤的NG-108细胞增殖,提示对Aβ25-35造成NG-108细胞损伤有一定的保护作用.
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玉郎伞多糖对Aβ25-35所致PC12细胞损伤细胞内钙离子浓度的影响
目的 观察Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡损伤模型胞内钙浓度的变化及YLSP的影响.方法 采用Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡损伤模型,石杉碱甲作为对照药,给予YLSP预处理后,加入Flu-3/AM,用流式细胞仪(FCM)测定各组细胞的平均荧光强度.结果 各组PC12细胞内钙离子含量存在显著性差异(F=14.051,P<0.01),其中,Aβ25-35作用PC12细胞后,PC12细胞内钙离子含量显著升高(P<0.01),经YLSP处理后,PC12细胞内钙离子含量较模型组细胞显著降低(P<0.01),其中,YLSP高剂量组的PC12细胞内钙离子含量显著低于石杉碱甲组(P<0.01).结论 YLSP能对抗Aβ引起的细胞内钙离子浓度升高,防止钙超载的发生.
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吡格列酮对Aβ25~35导致的痴呆大鼠学习记忆能力及海马内氧化应激的影响
目的：研究吡格列酮(Pioglitazone，Pio)对Aβ25~35引起的大鼠学习记忆能力和海马内氧化应激反应的影响。方法将40只大鼠随机分为空白对照组、模型组、Pio低剂量组和Pio高剂量组，每组10只。Pio低剂量组和高剂量组大鼠分别给予吡格列酮40 mg/kg和80 mg/kg灌胃21 d，空白对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。治疗结束次日进行Morris水迷宫实验，前5 d定位航行训练，第6天进行空间探索实验。Morris水迷宫实验结束后次日，麻醉、断头取脑，提取脑组织匀浆，以备ELISA实验使用。ELISA法检测大鼠海马内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量。结果 Morris水迷宫结果显示，模型组大鼠潜伏期比空白对照组明显延长，而穿过平台次数和平台滞留时间缩短，差异均具有统计学意义(P<0.05）；与模型组相比，Pio低剂量和高剂量组大鼠潜伏期显著降低，穿过平台次数和滞留时间也相应增加，差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中Pio低剂量组增加显著；ELISA法检测结果显示，模型组大鼠海马内GSH-Px和SOD含量比空白对照组明显降低，而脂质过氧化产物MDA明显增加，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，Pio低剂量和高剂量组大鼠海马内GSH-Px和SOD的活性明显升高，MDA明显减少，差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中Pio低剂量组增加显著。结论吡格列酮能够改善痴呆大鼠的学习记忆能力，其机制可能与对抗海马内的氧化应激反应有关。
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玉郎伞多糖对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用研究
目的:研究玉郎伞多糖(YLSPS)对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用.方法:采用Aβ25-35诱导PC12细胞损伤模型.试验分为6组,即空白对照(无血清DMEM低糖培养基)、模型(10μmol/LAβ25-35溶液)、石杉碱甲(1μmol/L石杉碱甲溶液)与YLSPS高、中、低浓度(1.0、0.1、0.01 μg/ml YLSPS溶液,10μmol/L Aβ25-35溶液)组.检测细胞培养液与细胞匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)水平.结果:细胞培养液和细胞匀浆中,与模型组比较,YLSPS高、中、低浓度组NO、MDA含量显著减少、NOS活性显著减弱,SOD、GSH-Px活性显著增强,GSH含量显著增加(P＜0.01或P＜0.05).结论:YLSPS对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤具有较好的抗氧化保护作用.
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Aβ25-35诱导PC12细胞内Ca2+浓度升高和自噬发生
目的 研究Aβ25-35对PC12细胞内Ca2+浓度和自噬发生的影响.方法 培养PC12细胞,分别用0、5、10 μmol/L Aβ25-35处理24 h,用MTT法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度,单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色观察自噬泡,共聚焦显微镜检测LC3-Ⅱ表达,透射电镜观察细胞超微结构.结果 5、10μmol/LAβ25-35处理24 h后,PC12细胞存活率分别为(64.6±2.3)％和(41.3±4.1)％,与对照组相比显著下降(P＜0.05),细胞内游离Ca2+浓度升高(P＜0.05).与此同时,随着Aβ25-35浓度升高,显微镜下可见细胞皱缩、变圆,与对照组相比,细胞内MDC阳性颗粒增多,LC3-Ⅱ荧光强度增强(P＜0.05),与Aβ25-35呈浓度依赖关系.电镜下可见单(双)层膜样自噬体.结论 Aβ25-35诱导PC12细胞发生自噬呈浓度依赖关系,其发生可能与细胞内游离Ca2+浓度升高有关.
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独活香豆素对Aβ25-35损伤神经元的保护作用及机制研究
目的:研究独活香豆素对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)损伤神经元的保护作用及可能机制.方法:从新生乳鼠大脑皮层中分离纯化神经元,与Aβ25-35、不同浓度独活香豆素和丹酚酸B共同孵育24h,用噻唑蓝(MTT)法和乳酸脱氢酶(LDH)测定法检测细胞存活率与LDH释放量,用Hoechst 33258染色检测Aβ25-35诱导的神经元凋亡,用RT-PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表达量.结果:独活香豆素(10、50、100、150 μg/ml)能明显提高Aβ25-35(30μM)损伤神经元的存活率,降低LDH释放量,抑制神经元凋亡,以浓度为100 μg/ml时作用显著,作用强度与丹酚酸B相当；独活香豆素能提高神经元Bcl-2 mR-NA、降低Caspase-3 mRNA的表达量.结论:独活香豆素对Aβ25-35损伤神经元具有保护作用,其机制可能与抑制促凋亡基因Caspase-3、促进抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达有关.
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β-细辛醚,丁香酚和远志皂苷对Aβ25-35神经细胞毒性的保护作用
目的:优选β-细辛醚,丁香酚和远志皂苷对Aβ25-35诱导的海马神经细胞的保护作用,确定三者佳配比.方法:采用体外细胞培养的方法,通过NF染色鉴定,建立大鼠海马神经细胞Aβ25-35损伤模型.利用正交实验设计,测定细胞存活率(MTT法)、乳酸脱氢酶(LDH)活性,确定佳三种药物佳配比；通过观察细胞形态,利用Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况.结果:L9(34)正交设计实验结果表明β-细辛醚(20,40,80 μmol/L),丁香酚(2,4,8μmol/L),远志皂苷(10,20,40 μmol/L)合用的佳优化配比剂量分别为40 μmol/L,2μmol/L,20 μmol/L,可显著降低Aβ25-35(1μmol/L)诱导的神经细胞凋亡率(P＜0.01)和LDH活性,提高细胞相对生存率.结论:三种药物联用可有效保护海马神经细胞免受β淀粉样蛋白的毒性损伤.
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红参水提物对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用
目的 探讨红参水提物对Aβ25-35诱导人神经瘤母细胞SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用.方法 用Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞,模拟阿尔茨海默病患者脑内神经元的病理损伤模型,以不同浓度的红参水提物进行干预;用倒置显微镜观察其形态学的变化;MTT法测定细胞的存活率;流式细胞技术检测细胞的凋亡率以及线粒体膜电位的变化.结果 50 μmol·L-1Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞72 h后,细胞变圆、聚集,其存活率为39.26%土3.16%、凋亡率为37.30%±0.69%,线粒体红绿荧光强度比值为0.45±0.10;而Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞与不同浓度(1、5、10 mg·ml-1)红参水提物同时孵育后,明显减少了细胞损伤,升高了细胞存活率、降低了凋亡率,并升高了线粒体红绿荧光强度比值.结论 红参水提物对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡有显著的保护作用.
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藁本内酯预处理对Aβ25-35诱导人脑神经瘤母细胞SH-SY5Y细胞毒性的保护作用
目的 探讨藁本内酯(Z-ligustilide,LIG)对β淀粉样蛋白(Aβ)25-35引起的人脑神经瘤母细胞SHSYSY细胞毒性的保护作用.方法 0.1、1.0、2.5、5.0 μg/mL LIG作用于SH-SY5Y细胞,24 h后以50 μmol/L Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡建立阿尔茨海默病体外模型,MTT法检测细胞活性,Western blot法检测细胞中凋亡蛋白含量.结果 经Aβ25-3s处理后,细胞存活率下降,细胞内凋亡相关蛋白——Bax、cleaved caspase3、细胞色素C、caspase8表达上调,但Bcl-2蛋白表达下降(P均＜0.05).细胞经过LIG一定浓度预处理,细胞存活率提高,凋亡相关蛋白——Bax、cleaved caspase3、细胞色素C、caspase8蛋白表达下降,Bcl-2表达上升(P均＜0.05).结论 LIG具有对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞毒性的保护作用,其机制可能是抑制Aβ诱导的细胞凋亡.
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反式白藜芦醇对Aβ25-35致痴呆大鼠海马caspase12的影响
目的 观察反式白藜芦醇(TR)对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)致痴呆大鼠海马caspase12 mRNA和蛋白表达的影响,补充说明TR抗痴呆的作用机制.方法 大鼠随机分为五组:假手术组、阳性对照组、模型组、低剂量组、高剂量组,每组9只.在大鼠海马给予Aβ25-35造模结束后连续灌胃15 d每日1次,阳性对照组给予多奈哌齐1mg/kg,低剂量给予TR10mg/kg,高剂量TR40mg/kg,假手术组和模型组给予同体积的生理盐水.第15天时处死大鼠,免疫组化及Western blot检测海马caspase12蛋白表达,实时定量PCR检测海马caspase12 mRNA的表达.结果 大鼠注射Aβ25-35后,模型组海马caspase12蛋白和mRNA表达明显高于假手术组(P＜0.01).TR剂量依赖性地降低了大鼠caspase12蛋白表达和mRNA表达(P＜0.05).结论 TR抗Aβ25-35致痴呆大鼠的作用机制与抑制海马caspase12基因表达有关.
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淫羊藿苷对Aβ25-35所致神经细胞损伤的保护作用研究
目的 观察淫羊藿苷对β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)所致神经细胞损伤的作用.方法 18只Wistar大鼠简单随机分为5组,分别为假手术组、模型组、ICA药物组(30、60、120 mg·kg-1),海马内注射Aβ25-3510μg(5μg.μl-1)制备AD大鼠模型,ICA30、60、120 mg·kg-1连续灌胃给药14天后,石蜡切片HE染色观察海马神经元形态及数量的变化;神经细胞原代培养,MTT检测神经细胞增殖活性.结果 与模型对照组比较,ICA连续灌胃给药14天可减少皮质和海马神经元的丢失;ICA给药组噻唑蓝值较模型组增加.结论 淫羊藿苷对Aβ25-35所致神经细胞损伤具有保护作用,有利于老年性痴呆的治疗.
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蜕皮甾酮对大鼠脑内c-fos表达的影响
目的观察大鼠海马内给予Aβ25-35后c-fos基因在不同脑区表达的变化以及蜕皮甾酮的影响.方法 用立体定位仪向大鼠双侧海马内微注射Aβ25-35,免疫组织化学染色观察c-fos基因的蛋白表达情况,采用BI 2000图象处理系统中的免疫组化模块进行c-fos表达的定量分析.结果对照组的c-fos在海马、丘脑及大脑皮层均有较高的表达;海马内注射Aβ25-35后,各脑区c-fos基因的表达均明显降低(P＜0.01);而蜕皮甾酮治疗组c-fos基因的表达相对增加:低剂量组,海马P＜0.05,丘脑P＜0.05;高剂量组,海马P＜0.01,丘脑P＜0.01,皮层P＜0.01.结论海马内注射Aβ25-35后可明显降低海马、丘脑及大脑皮层c-fos基因的表达;蜕皮甾酮可抑制Aβ25-35的作用,使海马、丘脑及大脑皮层的c-fos基因表达相对增加.
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一种神经元轴突变性的量化分析方法
目的 建立一种神经元轴突变性的量化分析方法.方法 采用Aβ25-35(10-7、10-6、10-5 mol/L)诱导的大鼠原代海马神经元轴突变性模型,经神经元特异性标记蛋白βⅢTubulin免疫荧光染色获得神经元形态学荧光图像.荧光图像经二维消卷积和二元化处理,将荧光标记的神经元区域转变为黑色并测量其面积,即为神经元总面积.应用ImageJ软件的颗粒分析功能测量轴突变性产生的片段和颗粒面积,并计算其占神经元总面积的百分比,即可获得神经元轴突变性的量化数据,命名为变性指数(degeneration index,DI).Western blot测定突触后致密蛋白95(postsynaptic density 95,PSD95)和突触素(synaptophysin,SYN)蛋白变化.Pearson法分析DI与PSD95、SYN变化的相关性.结果 免疫荧光染色结果显示Aβ25-35可诱导海马神经元轴突变性,DI显著高于对照组并呈剂量依赖性,PSD95和SYN蛋白水平显著降低,与DI变化呈显著正相关.结论 本方法可获得准确的神经元轴突变性的量化数据.
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吡格列酮对Aβ25-35所致痴呆大鼠的学习记忆能力及海马内氧化应激的影响
目的 研究吡格列酮对Aβ25-35所致痴呆大鼠学习记忆能力和海马内氧化应激反应的影响.方法 侧脑室注射Aβ25-35建立大鼠AD模型,吡格列酮(40mg/kg、80 mg/kg)灌胃21d,次日行Morris水迷宫实验,前5天定位航行训练,第6天进行空间探索实验.行为学实验后第2天麻醉,断头取脑,提取脑组织匀浆,以备ELISA实验.ELISA实验研究大鼠海马内的氧化应激反应.结果 Morris水迷宫结果显示,模型组大鼠潜伏期较空白对照组明显延长,而穿过平台次数和平台滞留时间缩短.经吡格列酮治疗后,潜伏期显著缩短,穿过平台次数和滞留时间也相应增加.ELISA结果显示,模型组大鼠海马内酶性抗氧化剂GSH-Px和SOD活性较空白对照组明显降低,而脂质过氧化产物MDA含量增加.经吡格列酮治疗后,GSH-Px和SOD活性提高,MDA产生减少.结论 吡格列酮能改善痴呆大鼠的学习记忆能力,其机制可能与对抗海马内的氧化应激反应有关.
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胰岛素样生长因子-1抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡
目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对β淀粉样蛋白25-35(beta-amyloid 25-35,Aβ25-35)诱导的神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)凋亡的影响.方法:以SH-SY5Y细胞系为研究对象,将其分为对照组、Aβ25-35组和IGF-1预处理组.利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测细胞活性;Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-xL、Bax及cleaved caspase-3的表达.结果:Aβ25-35可降低SH-SY5Y细胞活性,诱导其发生细胞凋亡.IGF-1预处理组细胞活性增加,细胞凋亡率降低,伴有Bcl-xL表达增加、Bax表达降低及casapse-3活化减少.结论:IGF-1可通过上调Bcl-xL、下调Bax的表达,抑制casapse-3的活化,发挥抗Aβ25-35诱导的细胞凋亡作用.
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Aβ25-35伤害大鼠空间学习记忆和在体海马长时程增强的联合研究
目的:探讨海马内注射β-amyloidprotein25-35(Aβ25-35)所致AIzheizer's病(AD)模型大鼠空间学习记忆功能障碍的海马突触可塑性长时程增强(LTP)机制,为联合开展AD动物行为学和在体电生理学研究提供实验证据.方法:在脑立体定位仪上给予大鼠双侧海马分别注射4nmol/LAβ25-35或等体积生理盐水每侧2(μ)l,手术后恢复2周,每只大鼠依次进行行为学和电生理两部分实验.首先,利用Morris水迷宫进行空间学习、记忆功能测试；之后,进行在体海马CA1区场兴奋性突触后电位(fEPSP)引导记录实验,观察突触可塑性指标长时程增强(LTP)的改变.结果:与对照组相比,海马内注射Aβ25-35大鼠的空间学习记忆功能和在体海马突触可塑性LTP均有改变,其中:逃避潜伏期和逃避距离明显增加(P＜0.0l)；目标象限内游泳时间和距离明显缩短(P＜0.01)；在体海马LTP幅度显著降低(P＜0.01).结论:海马内注射Aβ25-35可导致大鼠空间学习记忆功能障碍；联合实验中Aβ25-35同样可引起在体海马LTP改变.提示同批动物先后进行行为学和电生理学测试的方法是可行的,行为学实验不会影响后续LTP的实验结果.因此,本实验为行为学改变后进行在体LTP机制探讨提供了实验依据,为有效开展行为学和电生理学实验提供了思路.
