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改良法分离培养人牙周膜干细胞
目的 改良法体外分离培养人牙周膜干细胞(PDLSC),并进行鉴定.方法采用酶消化组织块法获得人牙周膜细胞,通过有限稀释法克隆化培养、分离得到PDLSC,用含10%FBS的α-MEM培养液培养并传代:测定克隆形成率:免疫组织化学检测角蛋白及波形蛋白表达:流式细胞术分析细胞周期及表面标志物STRO-1、CD146的表达;并进行成骨、成脂诱导实验.结果 本研究所得细胞有较强的克隆形成能力,波形蛋白染色阳性,角蛋白阴性,细胞周期分析大多细胞处于G0/G1期,STRO-1及CD146高表达,成骨、成脂诱导实验证明所得细胞有多向分化能力.结论 改良法克隆化培养可成功分离得到PDLSC,为进一步研究PDLSC奠定了基础.
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骨髓间充质干细胞在软骨组织工程化组织构建中的应用
人骨髓中所含的细胞可以分为造血类细胞和非造血类细胞.前者中含有的干细胞主要为造血干细胞,而后者中含有间充质类干细胞(mesenchymal sten cell)能够分化为骨、软骨、肌腱、脂肪、皮肤和其他类型的细胞[1-2].骨髓中含有多向分化潜能的细胞,这类细胞的共同特征是具有成纤维细胞的形态,能黏附塑料培养皿,并能形成细胞克隆,但无吞噬功能.
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系统性红斑狼疮T细胞的TCR/CD3信号转导
SLE是一种病因未明,累及多系统的自身免疫性疾病,从过去20年的研究中,我们认识到SLE的细胞免疫失调是一个复杂的多细胞系的功能紊乱,T细胞被认为是SLE发病机理之关键.Dayal等[1]提出,原发的T细胞异常,信号转导的生化途径失调,导致基因调节或表达的异常.使占主导地位的Tho细胞因子分泌方式转变为Th2方式,Tho细胞可产生Th1CK(如:IL-2、INF-γ)和Th2CK(如IL4、5、10),缺陷性T细胞的分泌细胞因子的转变,影响了B细胞克隆的免疫调节,导致多克隆B细胞的活化和无限制的致病自身抗体的产生.本文就SLE中TCR/CD3复合体介导的信号转导途径的异常作一简要的阐述.
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人牙周膜干细胞的体外分离、纯化及初步鉴定
目的:体外分离纯化人牙周膜干细胞,研究其生物学特性及表型特点并进行初步鉴定.方法:采用胶原酶和Dispase酶联合消化法培养人牙周膜干细胞,有限稀释法分离纯化,将克隆形成的细胞通过透射电镜观察其超微结构、流式细胞仪细胞周期分析及免疫组织化学染色技术检测抗波形丝蛋白(Vimentin)、STRO-1、骨粘素(ON)、骨涎蛋白(BSP)的表达. 结果:获得纯化人牙周膜干细胞,在透射电镜下,这种细胞核质比例大,核大,细胞器少;流式细胞仪细胞周期分析大多数细胞处于G0/G1期,为慢周期性;该细胞抗波形丝蛋白、STRO-1表达阳性、骨粘连素、骨桥蛋白弱阳性表达. 结论:提供了比较有效的分离纯化牙周膜干细胞的方法.该方法分离的人牙周膜干细胞具有干细胞的超微结构、细胞周期及表型特点.
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人牙周膜干细胞矿化诱导分化的实验研究
目的:体外分离纯化人牙周膜干细胞,研究其体外矿化能力,为牙周组织工程提供可靠的种子细胞来源. 方法:采用有限稀释法克隆分离纯化人牙周膜干细胞,将获得的第5代细胞用矿化液连续培养,观察矿化情况,进行矿化结节Von kossa染色;通过免疫组织化学染色技术检测诱导后细胞骨黏连素(ON)、骨桥蛋白(BSP)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)、Ⅲ型胶原(COLⅢ)的表达. 结果:人牙周膜细胞在体外可以叠层生长,形成肉眼可见的灰白色结节,Von kossa染色显示结节内有钙盐沉积,该细胞诱导21 d后有矿化相关蛋白COLⅠ、COLⅢ,BSP、ON的阳性表达.结论:人牙周膜干细胞在体外矿化液作用下出现向成骨细胞的分化.
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稳定表达细胞内病原体抗性基因1的RAW264.7细胞克隆的建立
目的:构建携带细胞内病原体抗性基因1(Ipr1),以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导入鼠巨噬细胞RAW264.7中表达.方法:Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切重组质粒pET32a(+)-Ipr1及真核表达载体pEGFP-C1,Ipr1基因定向克隆入pEGFP-C1载体,构建重组质粒载体pEGFP-C1一Ipr1.脂质法转染体培养的RAW264.7细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP-C1-Ipr1融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测Ipr1基因转录水平的表达;West-ern Blot方法验证Ipr1蛋白水平的表达.结果:酶切鉴定获得一条约4700 bp卒载体条带及一条约1338 bp目的片段,证明pEGFP-C1-Ipr1真核表达载体构建成功.pEGFP-C1-Ipr1转染RAW264.7细胞后,Western Blot可以检测到约Mr 77×103的融合蛋白在RAW264.7细胞中表达,荧光显微镜下可观察纠转染细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-Ipr1,获得稳定的RAW264.7-Ipr1细胞克隆可表达Ipr1,为进一步研究lpr1的功能奠定了基础.
关键词: 细胞内病原体抗性基因1 转染 脂质体 细胞克隆 -
稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立
目的:构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶(scNS4A/NS3)的真核表达载体;建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆. 方法:根据文献报道设计扩增scNS4A/NS3编码基因的引物,从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA,RT-PCR方法扩增出scNS4A/NS3基因片段, BamHⅠ/HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-),转化菌株JM109感受态细胞,获得重组质粒pcDNA3.1(-)~scNS4A/NS3,经酶切鉴定及序列测定. 将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系,用RT-PCR,IFA,Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白. 结果:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-scNS4A/NS3;建立了稳定转染的HepG2细胞克隆,命名为scpHepG2. 结论:获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白,为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础.
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人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究
目的 环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之 一. 本研究旨在获得hCOX-2 编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,并用反义重组载体转染COX-2高表达的胃癌 细胞,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制. 方法 按文献报道的hCOX-2 核苷酸序列设计合成PCR引物,利用总RNA抽取试剂盒从COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系 SGC 7901中提取细胞总RNA,反转录合成cDNA,再用PCR方法扩增目的基因序列. PCR产物经DNA序 列测定证实后,利用引物5端引入的EcoRⅠ, XbaⅠ酶切位点,通过粘端连接,将 所获目的 基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1中. 对两种重组质粒分别进 行相应的酶切鉴定. 采用脂质体介导的方法用COX-2反义核酸转染SGC7901细胞,经G418筛 选 后,随机挑选细胞克隆. 通过RT-PCR检测COX-2 mRNA水平的变化. 结果 应用RT-PCR反应扩 增获得大小约1.9 kb的特异性片段. 经DNA序列分析,证实与文献报道的hCOX-2编码区序列 一致. 重组正义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(+)用EcoRⅠ,XbaⅠ双酶切后,产生大 小约5.4 kb,1.9 kb的片段;重组反义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(-)通过PstⅠ酶切, 产 生大小约4.5 kb, 1.5 kb与1.3 kb的片段,与预期结果相符. 转染细胞经筛选后,随机挑选 、扩增了3个细 胞克隆,其中1个细胞克隆稳定表达COX-2反义核酸,RT-PCR提示其COX-2 mRNA水平显著 下 降. 结论 成功克降了hCOX-2编码基因序列,并构建了其正、反义真核表 达载体. 反转录PC R是克隆基因的简便、有效方法. 为扩增高GC含量的cDNA模板,可在PCR引物中加入限制性内 切酶位点,可以方便地实现基因的定向克隆. COX-2反义核酸在胃癌细胞系SGC7901中得到 稳定转染,转染细胞COX-2 mRNA表达显著受抑制.
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脂质体载体法将外源性野生型p53转染SHG44细胞及验证
目的 验证脂质体法将wt-p53有效转染SHG44细胞. 方法 G418筛选,DNA分子班点杂交. 结果 用脂质体法将wt-p53质粒转染SHG44细胞,G418筛选,24 d形成新生细胞克隆,呈集落状;以wt-p53 cDNA为探针进行斑点杂交,放射自显影,wt-p53 pLXSN/SHG44细胞为阳性杂交信号,而亲代SHG44细胞及转染pLXSN的 SHG44细胞为阴性信号,说明wt-p53基因已成功地转导入SHG44细胞中. 结论 斑点分子杂交显示,基因转染成功,初步证实脂质体介导法能有效地将外源性p53基因转导入SHG44细胞.
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抗鸭乙肝病毒core蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备抗鸭乙肝病毒core蛋白的单克隆抗体并进行鉴定.方法 PCR扩增鸭乙肝病毒(DHBV) core基因片段,构建表达载体pET28a(+)/DHBV core.转化诱导表达融合蛋白,用Ni2+亲和柱纯化目的 蛋白.免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选,采用有限稀释法筛选单克隆杂交瘤细胞并进行细胞克隆.体内诱生法大量制备单克隆抗体,进行抗体的特异性、效价和亚型的鉴定.结果 成功构建表达载体pET28a(+)/DHBV core,并表达DHBV core蛋白.获得2株稳定分泌抗DHBV core抗体的杂交瘤细胞株,分别为2D7和5G10,细胞培养液抗体效价为1:400和1:800.选择5G10细胞株制备单克隆抗体,小鼠腹水抗体效价可达1:320000.鸭肝组织免疫组化结果显示,DHBV病毒载量>1010copies/mg的肝组织中DHBV core蛋白的表达明显高于病毒载量<105 copies/mg的肝组织,而未感染DHBV的鸭肝细胞内不表达DHBV core蛋白.亚型鉴定结果为IgG2a κ链.结论 制备并获得了抗DHBV core蛋白的单克隆抗体,为DHBV core蛋白的功能研究、诊断试剂的研制与抗病毒治疗研究奠定了基础.
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利妥昔单抗治疗特发性血小板减少性紫癜的护理体会
特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种较常见的自身免疫性出血性疾病[1],是威胁生命的多系统受累的疾病,由于抗血小板自身抗体产生,加速外周血中血小板破坏,临床表现为广泛的皮肤紫癜和黏膜出血,严重者可有致命性出血和颅内出血,如不及时治疗病死率很高。美罗华又称利妥昔单抗,是一种新型的单克隆抗体,是目前临床上用于治疗特发性血小板减少性紫癜较多的药物,它能够特异性地与ITP患者B淋巴细胞表面的CD20抗原结合,有效清除异常B细胞克隆,妨碍血小板抗体的产生,从而减少对血小板的破坏,对血小板减少性紫癜有减少复发和维持长期缓解的效果2014年6月~2015年2月,我科收治了21例诊断明确的特发性ITP患者,通过利妥昔单抗治疗及精心的护理取得了良好的治疗效果,现将护理体会报告如下。
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Nampt在肿瘤中的研究进展
烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampl)又称为内脏脂肪素(visfatin)和前B细胞克隆增强因子(pre-B cell enhancing factor,PBEF),是NAD补救合成途径中的限速酶.Nampt通过调节细胞内NAD水平间接调控NAD依赖蛋白的活性,如组蛋白去乙酰化酶家族成员Sirtuins和多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP-1).近年来的研究表明,Nampt与肿瘤的发生发展、分期分级及预后密切相关.本文将就Nampt与肿瘤的关系以及Nampt抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展作一综述,以期为肿瘤靶向治疗提供新思路.
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自体外周血造血干细胞移植治疗非霍杰金淋巴瘤1例
造血干细胞移植(HSCT)泛指在患者接受超剂量化/放疗后将各种来源的正常造血干细胞通过静脉输注移植入受者体内,以替代原有的病理性造血干细胞,清除体内的恶性或异常细胞克隆,从而使正常的造血与免疫功能得以重建,并达到治疗疾病的目的.HSCT在国内外广泛应用于治疗恶性血液病、恶性实体瘤、部分非恶性难治性血液病,随着细胞因子的普及、干细胞分离技术的不断改进、免疫抑制剂作用的提高,HSCT的治疗技术不断成熟,疗效不断提高,甚至成为治愈某些疾病的唯一方法.
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CTLA-4Ig在诱导器官移植免疫耐受中的研究新进展
目前器官移植大障碍依然是术后排斥反应的发生.因此,寻找诱导免疫耐受的方法一直是器官移植领域的研究热点.抗原特异性T细胞的有效活化除需要TCR识别抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)提呈的MHC -肽作为第一信号外,还必需有APC和T细胞表面的共刺激分子之间相互作用所提供的共刺激信号作为第二信号才能顺利完成,阻断该第二信号而仅有第一信号则可以引起T细胞克隆无能甚至是凋亡,从而诱导器官移植免疫耐受.第一个发现可介导协同刺激信号的分子是T细胞表面的CD28分子和APC表面的B7分子,它们在移植后排斥反应的发生中起着非常重要的作用,体外阻断协同刺激反应,尤其是阻断CD28与B7分子的信号转导,可抑制T细胞活化,诱导T细胞克隆免疫无应答.现就利用CTLA-4Ig阻断CD28/B7通路来诱导抗原特异性免疫耐受的研究新进展做一综述.
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中西医治疗慢性粒细胞白血病进展
慢性粒细胞白血病(CML)是一种造血干细胞克隆增生性疾病,中位生存期3~4年,全球年发病率约为十万分之一,约占成人白血病的15%~20%.近年来,中西医治疗CML有较好效果,综述如下.
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急性髓系白血病细胞衍生的树突状细胞
微量残留病(MRD)是导致急性髓系白血病(AML)复发的根本原因,人们一直在不断找寻根除MRD的方法。大量研究表明细胞免疫治疗方法已经成熟,可根除MRD从而治愈AML。AML细胞在体内不能有效被T细胞识别,主要机制为70%的AML细胞表面缺乏共刺激分子CD(80)和CD(86)(分别为T细胞共刺激受体CD(28)和CTLA-4的配体),不能提供T细胞活化必需的第二信号,从而导致肿瘤特异性T细胞克隆……