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基因枪转导K-RAS反义基因对胰腺癌细胞(K-RAS P21)蛋白表达的影响
目的 观察基因枪转导K-RAS突变特异性反义基因对胰腺癌细胞K-RAS P21蛋白的影响.方法 利用基因枪技术,将反义基因转导入宿主细胞,通过免疫细胞化学和Western blot方法,观察K-RAS突变特异性反义基因转导后AsPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞系K-RAS P21蛋白的变化.结果 转导K-RAS突变特异性反义基因后,AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的K-RAS P21蛋白表达明显降低;BxPC-3胰腺癌细胞的K-RAS P21蛋白表达无明显变化.结论 突变特异性K-RAS反义基因经基因枪有效转导后,可用于胰腺癌的治疗.
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反义MCP-1转染兔平滑肌细胞及对其生长的影响
构建逆转录病毒载体反义单核细胞趋化蛋白1(LUCX-Anti-MCP-1)表达质粒,利用阳离子脂质体(Lipofectamine)将反义MCP-1导入体外培养的平滑肌细胞,通过PCR、Northern杂交检测外源基因的转染及其mRNA表达情况.应用3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法了解反义MCP-1基因对细胞生长的影响.结果显示:Lipofectamine可以成功的将反义MCP-1基因导入体外培养的主动脉平滑肌细胞中,并实现外源基因的转录表达.且反义MCP-1基因对体外培养的平滑肌细胞生长没有影响.
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以Pin1为靶点的肿瘤反义基因治疗研究进展
肽基脯氨酰顺反式异构酶1(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase 1,Pin1)是进化上非常保守的肽基脯氨酰异构酶(peptidyl-prolylisomerase,PPIase)家族的成员,属微小菌素蛋白[1],初报道于1996年,在分离与NIMA(never in mitosis geneA)相互作用的蛋白时得到[2].
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反义AT1受体基因治疗高血压
高血压的发生有多种因素的参与,其中涉及多种基因.能进行基因治疗的候选基因包括促进血管舒张的基因以及使血管收缩的基因.因此,高血压的基因治疗包括两方面,即正义插入使血管舒张的基因和反义抑制使血管收缩的基因.由于RAS在高血压的发生和发展中可能发挥极其重要的作用,本文仅就AT1受体基因方面,将近年文献进行综述.反义AT1受体基因治疗涉及四个方面,即降压,逆转高血压引起的病理生理改变,早期干预高血压的发生和进展,另外还有通过AT1受体反义基因的调控以调节基因治疗.
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细胞周期蛋白D1 RT-PCR ELISA的建立及其初步应用
目的:建立一种灵敏、特异和简便实用的细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA表达水平的检测手段.方法:生物素标记Cyclin D1 5'端引物,PCR DIG Labeling Mix取代dNTP,RT-PCR终产物置于链霉亲和素包被的ELISA板中孵育,洗涤、显色后,自动酶联检测仪测A45onm值.常规RT-PCR方法作对照.检测对象包括Cyclin D1表达细胞系SGC7901,转染反义Cyclin D1基因的SGC7901D1AS细胞及转染空载体的SGC7901neo细胞,原发性胃癌组织30例、胃癌旁和正常胃黏膜组织20例,胃良性病变组织22例.结果:RT-PCR ELISA与RT-PCR琼脂糖电泳检测结果吻合,所测得的A450nm值与Cyclin D1特异性基因片段的丰度和检测细胞数量有一很好的对应关系.SGC7901胃癌细胞转染Cyclin D1反义基因后,Cyclin D1mRNA表达显著降低(P＜0.05).Cyclin D1 mRNA在胃良性疾病起即开始明显升高(P＜0.05).在胃癌各组中,进展期胃癌伴转移组的Cyclin D1 mRNA表达水平显著高于其他两组(P＜0.05).结论:本文建立的Cyclin D1 RT-PCR ELISA可作为一种侯选的、较为简便和半定量的cyclin D1 mRNA检测方法.致谢:第三军医大学数学教研室罗明奎主任在本课题结果统计分析的工作中给予了无私的指导和帮助.
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正反义人端粒酶RNA组分(hTR)基因真核表达载体的构建
目的构建正义和反义端粒酶RNA组分((human telomerase RNA components,hTR)基因真核表达载体.方法用MluⅠ和SalⅠ从pGRN83质粒上切下约579bp的hTR cDNA片段,分别定向连入pcl-neo的Mlu Ⅰ/Sal Ⅰ和MluⅠ/Xho Ⅰ酶切位点上,即构建成了hTR的正反义表达载体,并经酶切鉴定和测序确认.结果经酶切鉴定和测序证明,所构建的正反义hTR真核表达载体与设计完全一致.结论成功构建了人端粒酶RNA的正反义真核表达载体,为进一步研究正反义hTR基因转染对胃癌细胞端粒酶及生物学行为的影响奠定了基础.
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肿瘤转移抑制基因KAI1对MHCC97-H肝癌细胞粘弹性的影响
目的:探讨肿瘤转移抑制基因KAI1对高转移潜能肝癌细胞MHCC97-H粘弹性的影响.方法:采用微管吸吮技术研究我们前已转染人类KAIl全长正或反义结构基因的人肝癌MHCC97-H细胞粘弹特性.结果:MHCC97-H肝癌细胞的粘弹性系数K1,K2,μ在转染KAI1正义基因后明显增加(P=0.007),在转染KAI1反义基因后明显降低(P=0.000),而转染空载体后则无明显变化(P=0.444).结论:KAI1基因对肝癌细胞的粘弹性有明显影响,这为肝癌侵袭和转移机制的研究提供了重要线索.
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KAI1正反义基因对MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响
目的:构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,了解其对高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响.方法:利用亚克隆技术构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,并用脂质体法将其分别转入高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞系,通过免疫细胞化学SP法检测KAI1蛋白表达情况.结果:限制性内切酶分析证明两个重组子的结构均与KAI1正、反义基因表达质粒的预期结构一致.免疫细胞化学SP法检测显示,转入正义KAI1基因后的肝癌细胞KAI1蛋白染色加深,(细胞积分光密度integra oculus dehter,IOD20.127±5.099 vs12.675±1.921,P＜0.01);而转入反义KAI1基因的肝癌细胞则KAI1蛋白染色变浅,(IOD 8.681±2.472 vs 12.675±1.921,P＜0.01).结论:成功构建了KAI1基因正、反义真核表达质粒.KAI1正义基因能上调肝癌细胞KAI1蛋白的表达,相反,KAI1反义基因则能下调肝癌细胞KAI1蛋白的表达.
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重组腺相关病毒介导血管紧张素Ⅱ受体1反义基因对高盐饮食诱导的高血压大鼠血压的影响
目的 研究导入血管紧张素Ⅱ受体1反义基因对大鼠高盐饮食诱导的高血压的预防作用.方法 首先采用钙磷转染法进行三质粒共转染,包装重组腺相关病毒,后采用Dot-Blot方法检测病毒滴度.选取8周龄雄性SD大鼠分成3组,分别经尾静脉注射重组腺相关病毒和生理盐水,实验组(rAAV-AT1-Antisense),对照组(rAAV-GFP),正常组(0.9%NaCl);2周后,实验组和对照组给予高盐(8%氯化钠)饲料喂养,正常组继续给予正常饮食喂养,实验周期为12周,实验过程中,前三周每周测量血压一次,三周后,每两周测量血压一次;处死动物后通过半定量RT-PCR检测血管紧张素Ⅱ受体1在主动脉组织的表达情况.结果 高盐饮食1周后,对照组大鼠血压开始升高,到第5周时血压达到140 mm Hg,并维持到实验结束,实验结束时达到(142.7±4.5 mmHg);实验组大鼠和正常组大鼠的血压一样在整个实验过程中一直稳定在正常范围,实验结束时维持在(117±3.8)mmHg,(117.8±2.9)mmHg.整个实验过程三组动物并未出现因为病毒载体注入和表达所引起的严重毒副作用.结论 血管紧张素Ⅱ受体1反义基因可以预防高盐诱导的高血压,为临床应用反义AT1基因治疗高血压提供了可能.
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bcl-2部分编码区的反义RNA促进烷化溶血磷脂诱导的白血病细胞凋亡
bcl-2抗凋亡基因在白血病细胞株常有高表达,引起对化放疗的耐受,封闭该基因的转录和翻译都将诱导白血病细胞凋亡,且对化放疗敏感.本研究通过比较逆转录病毒载体介导的全部和部分编码区的bcl-2反义基因瞬时和稳定表达在对抗bcl-2作用、降低内源性bcl-2蛋白水平和对烷化溶血磷脂ET 18-OCH3 (ALP)诱导白血病细胞凋亡的影响的差异,探讨了短片段bcl-2反义RNA作用特点,以期为硫代寡聚脱氧核苷酸的治疗白血病和对ALP协同体外净化白血病细胞提供实验基础.
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反义Smad4基因转染对抗昆明小鼠肝脏纤维化发展的效果观察
目的探讨反义Smad4基因阻断TGF-β信号传导系统对抗小鼠肝脏纤维化的效果. 方法将反义Smad4基因导入CCl4/乙醇诱导的昆明小鼠纤维化肝脏,用Southern blot检测整合情况,用Northern blot、RT-PCR及Western blot方法观察Smad4的表达,比较各组小鼠肝脏纤维化程度. 结果反义Smad4基因可整合到病毒处理组小鼠肝脏.纤维化肝脏Smad4表达较正常组明显增强.经转基因处理后,小鼠纤维化肝脏 Smad4的表达明显弱于对照组,肝脏纤维间隔不同程度地减少、变窄或不完整,纤维化程度也有所减轻. 结论反义Smad4基因能有效减少Smad4基因的表达,进而部分阻断TGF-β信号传导系统,以阻止贮脂细胞的活化,减少细胞外基质的产生,从而减缓肝纤维化的发展.
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反义单核细胞趋化蛋白-1基因抑制移植静脉内膜增殖的实验研究
目的探讨反义单核细胞超化蛋白-1(MCP-1)转基因表达对移植静脉术后局部血管MCP-1 mRNA表达、单核巨噬细胞浸润及与其相关的内膜增生的影响. 方法建立14只兔颈外静脉-颈总动脉移植模型,并随机分为基因治疗组、载体对照组和空白对照组.应用阳离子脂质体介导,将反义MCP-1基因通过局部定位转染的方法转染至移植静脉段.RNA斑点杂交,检测反义基因转染、表达情况;病理形态学观察移植血管新生内膜增生以及血管壁中单核巨噬细胞粘附、浸润的情况.结果 RNA斑点杂交提示:基因治疗组中有反义MCP-1基因表达.移植静脉自身MCP-1 mRNA的表达受到明显抑制(降低38%,P＜0.05).相应的单核巨噬细胞在移植静脉中的粘附、浸润明显减少(减少34%,P＜0.05).内膜增生程度显著减轻(减轻49%,P＜0.05). 结论反义MCP-1局部移植静脉内转基因表达,可抑制移植静脉自身MCP-1的表达,抑制单核巨噬细胞的浸润,减轻新生内膜的增殖.
关键词： 单核细胞趋化蛋白-1 静脉移植 基因疗法 反义基因 -
骨桥蛋白反义基因对胃癌浸润与转移影响的研究
目的:探讨骨桥蛋白反义基因对人类胃癌细胞增殖和浸润转移的影响.方法:1)PCR扩增获得人OPN基因,pcD-NA3.1(+)载体连接,酶切、测序.2)脂质体介导将pcDNA3.1-ANOPN基因转入ECA109,G418筛选,获得稳定表达AN-OPN基因的转染细胞SGC-7901-ANOPN,表达空载体的SGC-7901-vect细胞和空白对照SGC-7901.RT-PCR检测细胞OPNmRNA表达,体外观察对比各组间倍增时间、黏附、侵袭及迁移能力的差异.结果:成功构建了pcDNA3.1-ANOPN质粒,测序结果与GenBank中公布的序列同源性为100%.与SGC-7901-vect、SGC-7901相比,SGC-7901-ANOPN细胞OPN mRNA表达明显降低,倍增时间增加,黏附、侵袭及迁移能力明显降低.结论:ANOPN基因的稳定表达明显抑制胃癌细胞的恶性表型.
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AT1R-AS基因疗法不依赖血压的减轻心脏肥厚
SN Iyer等(1996)和D Lu等(1997)曾确认在自发性高血压大鼠心脏内一次注入含有血管紧张素Ⅱ 1型受体反义基因(AT1R-AS)的逆转录病毒载体(retroviral vector)可延长抗高血压作用.这些研究结果提示,反义基因疗法是一个理念确实的策略用以在基因水平上控制血压.
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高血压病基因治疗临床前研究近况
高血压病是一种世界性的常见疾病,不仅发病率高,还是脑卒中、冠心病的重要危险因素.临床上尽管有多种治疗高血压病的药物,但是由于药物作用时间短(≤24小时),特异性不高等,许多病人往往仍不能很好地控制住高血压.近年高血压病的基因治疗研究提供了具有精确特异性,效果长而又无副作用的突破性治疗方向.本文回顾了有关临床前研究中的两种基因治疗方法的近况,即:采用转移基因增加舒血管蛋白与反义技术减少缩血管蛋白的产生.
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反义VEGF腺病毒的制备及其对类风湿关节炎滑膜细胞VEGF分泌的影响
目的制备反义血管内皮生长因子(VEGF)腺病毒表达载体,为反义VEGF转基因治疗类风湿关节炎(RA)奠定基础.方法采用基因克隆的方法制备高滴度的反义VEGF腺病毒,并将其感染培养的RA滑膜细胞,观察期对RA滑膜细胞分泌VEGF的影响.结果成功制备了反义VEGF腺病毒,并观察到:在一定浓度范围内,反义VEGF腺病毒可以有效抑制RA滑膜细胞分泌VEGF,浓度越高,抑制效果越明显.结论制备的反义VEGF腺病毒可以高效抑制RA滑膜细胞分泌VEGF,为探索RA的反义VEGF基因疗法奠定了基础.
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反义血管内皮生长因子腺病毒基因感染对类风湿关节炎滑膜细胞VEGF基因转录的影响
目的观察反义血管内皮生长因子(VEGF)165腺病毒对滑膜细胞VEGF基因转录的影响.方法将反义VEGF165腺病毒转染滑膜细胞,通过Northern-blot的方法检测其对VEGF的基因转录的影响.结果Northern杂交结果显示:反义基因转染滑膜细胞3 d后,VEGF165基因的转录即受到明显抑制,4 d抑制更加明显,5 d后几乎检测不出阳性杂交信号.结论反义VEGF165腺病毒感染滑膜细胞后可以阻断VEGF基因的转录过程,从而抑制VEGF蛋白质的翻译和表达.
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反义mTOR基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响
目的:观察反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因转染对移植静脉内膜增生的影响.方法:聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)包载制备纳米级粒子混合物.建立自体静脉移植模型,随机分成转基因组、空载体组、对照组.转基因组转染纳米粒子包载的反义mTOR基因,空载体组转染纳米粒子包载的空载体,对照组不予特殊处理.分别于术后3、7、14、28 d取材,常规HE、弹力纤维VG染色,RT-PCR、免疫组织化学染色、Western blot检测mTOR基因的mRNA及蛋白的变化,TUNEL法观察血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的动态变化.结果:转基因组内膜中mTOR蛋白产物表达较其他组明显减少(P＜0.05);转基因组内膜增生程度在术后7、14、28 d较其他组明显减少(P＜0.01);转基因组凋亡细胞较其他组明显增高(P＜0.05).结论:反义mTOR基因的表达能够有效抑制自体移植静脉内膜的增生,促进VSMC的凋亡.
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OPN反义基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响
目的:探讨OPN反义基因(ANOPN)对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞生长及迁移能力的影响.方法:构建人骨桥蛋白反义基因真核表达质粒pcDNA3.1-ANOPN,将质粒pcDNA3.1-ANOPN、空载体pcDNA3.1(+)和等量的脂质体分别转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,将转染细胞分别命名为MDA-ANOPN、MDA-vect和MDA,在体外观察各组细胞的迁移能力.结果:MDA-MB-231细胞比MDA-vect及MDA细胞迁移能力弱(P<0.01).结论:ANOPN可抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的迁移能力.
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CD44反义寡核苷酸对肿瘤细胞表面抗原和对CD3AK杀伤敏感性的调节作用
目的:观察CD44反义寡核苷酸调节人低分化黏液腺胃癌MGC80-3细胞Fas分子和凋亡抵抗基因bcl-2的表达水平,提高免疫效应细胞杀伤敏感性的作用和机制.方法:RT-PCR法检测CD44、bcl-2 mRNA的表达水平.MTT法检测CD3AK杀伤活性.流式细胞术检测细胞表面CD44及Fas、FasL蛋白表达水平.结果:CD44反义寡核苷酸(1.6 μmol/L)处理后,明显地抑制MGC80-3细胞CD44 mRNA和蛋白表达水平,在CD44配体低分子量透明质酸(HA)存在下,使MGC80-3表面下调的Fas分子显著增高,表达率从6.69%提高到16.81%(P<0.01).CD3AK对反义寡核苷酸处理的MGC80-3细胞杀伤活性显著增高,并呈效靶比依赖效应(P<0.01).MGC80-3细胞bcl-2 mRNA的相对表达定量值由1.06降至0.32.结论:CD44反义寡核苷酸可通过抑制MGC80-3细胞CD44 mRNA和蛋白表达,上调Fas分子的表达,下调凋亡抵抗基因bcl-2的表达,并提高其对免疫效应细胞的杀伤敏感性.
