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姜黄素与牛血清白蛋白结合的反应机制研究
目的:研究中药化学成分姜黄素与牛血清白蛋白(BSA)结合的反应机制.方法:在不同温度下采用荧光光谱法研究了姜黄素与BSA的相互作用,实验数据采用Linewearver-Burk静态猝灭公式处理,计算了不同温度下的结合常数及结合位点数n.结果:姜黄素对BSA有猝灭作用,二者结合常数较大,可形成一个结合位点,且温度对结合常数Ka的影响较小.结论:姜黄素对BSA内源荧光的猝灭机制为静态猝灭.
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载阿霉素新型壳聚糖纳米粒的性质及体外抗肿瘤研究
目的 采用离子凝胶法与化学交联法联合制备新型壳聚糖纳米粒,考察其相关性质以评估此种壳聚糖纳米粒的潜在的应用价值.方法 以盐酸阿霉素为模型药物,采用离子凝胶法和化学交联法联合制备新型壳聚糖纳米粒.以离子凝胶法制备的壳聚糖纳米粒为对照,离心法测定纳米粒的包封率;膜透析法检测纳米粒在不同pH下的盐酸阿霉素累积释放度;考察纳米粒在不同介质及pH中的粒径、电位和多分散系数.以离子凝胶法制备的壳聚糖纳米粒及游离盐酸阿霉素为对照组,MTT法检测新型壳聚糖纳米粒对人乳腺癌MCF-7肿瘤细胞的体外抑制作用.结果 新型壳聚糖纳米粒较离子凝胶法制备的纳米粒粒径小(P＜0.05),且包封率明显提高(P＜0.05);中性条件下的累积释放度较pH 5.0小(P＜0.05);在pH 5.0醋酸钠缓冲液介质中的粒径和PDI较小,电位较高(P＜0.05);对MCF-7细胞的抑制作用随时间增加而逐渐强于游离盐酸阿霉素,且其对肿瘤细胞的抑制效果强于离子凝胶法制备的壳聚糖纳米粒(P＜0.05).结论 离子凝胶法和化学交联法联合制备的壳聚糖纳米粒的粒径较小,缓释性较好,对肿瘤细胞的抑制作用较强,为研究盐酸阿霉素新剂型提供了实验依据.
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［Ni（Phen）（5-Fu）2］（NO3）2与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究
目的：为了研究[Ni（Phen）（5-Fu）2]（NO3）2配合物与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用机理。方法以Ni（II）为中心离子，5-氟脲嘧啶（5-Fu）和邻菲啰啉（Phen）为配体，合成了[Ni （Phen）（5-Fu）2]（NO3）2配合物，并利用荧光光谱考察了该配合物牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。结果配合物与BSA作用可导致BSA内源荧光猝灭，其猝灭机理为静态猝灭，结合常数Ka＝8.14×105 L· mol-1，结合位点数n＝1.32，且该配合物能够猝灭BSA分子中表面91.0％的Trp残基。结论[Ni（Phen）（5-Fu）2]（NO3）2配合物是良好的BSA淬灭剂。
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荧光光谱法研究偶氮胂Ⅲ与牛血清白蛋白的相互作用
目的 为了研究偶氮胂Ⅲ与牛血清白蛋白(BSA)在不同pH条件下(pH=2.0～9.0)的相互作用机理.方法 采用荧光光谱法研究偶氮胂Ⅲ对BSA荧光的影响,通过计算获得作用机理的诸多信息.结果 偶氮胂Ⅲ对BSA有较强的荧光猝灭作用,猝灭机制为生成复合物的静态猝灭;偶氮胂Ⅲ与BSA间的结合常数在pH3.0～5.0大,结合位点数为1;pH =3.5和4.5时偶氮胂Ⅲ与BSA色氨基酸残基间的结合距离在4.10 nm左右;两者主要靠静电引力结合;金属离子Mg2+、Ba2+和Ca2+对两者结合作用有影响.结论 偶氮胂Ⅲ及偶氮胂Ⅲ-Ba2+、偶氮胂Ⅲ-Ca2+可作为优良的光谱探针,用于蛋白质的定量测定.
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正交试验法优选姜黄素白蛋白微球的制备工艺
目的:制备姜黄素牛血清白蛋白微球.方法:以牛血清白蛋白为囊材,选用单凝聚法制备姜黄素微球,紫外分光光度法测定药物含量.采用正交设计法优选制备工艺,显微镜观察法、紫外分光度法等验证微球.结果:在佳工艺下,即药物∶囊材为1:6,乳化剂0.5 mL,乳化时间20 min,乳化温度35℃时,包封率为(67.85±1.73)％(n=3).经验证微球已经形成,制得的微球外观多呈圆球形,平均粒径为52.48μm.结论:该方法简单、方便,工艺可控.
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BSA-PLGA缓释微球的制备及优化条件的探索
目的 以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白、聚乳酸.聚乙二醇酸(PLGA)为包裹材料,探索微球的制备方法并优化制备工艺.方法 采用复乳.溶剂挥发法制备BSA-PLGA微球,显微测量微球粒径,以微量BCA法测定微球的蛋白含量并计算包封率,进行体外释放,测定微球的累积释放量.探索BSA投药量、PLGA用量、PVA浓度、超声功率等因素对微球包封牢、突释量的影响.结果 通过正交实验设计,优化了微球的制备工艺,其优化条件是BSA投药量为10 mg、PLGA用量为250 mg、PVA浓度为1.5%、超声乳化功率为60周.结论 通过控制不同的因素,可以得到较高包封率、较小突释、适当载药和粒径的BSA-PLGA微球.
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采用蛋白质工程技术将a B晶状体蛋白导入心肌细胞的初步研究
目的: 采用蛋白质工程技术将a B晶状体蛋白(a B-crystallin,a BC)导入心肌细胞,以深入研究其保护心肌缺血损伤的分子机理,并为将其应用于防治心肌缺血损伤奠定基础.方法: 将人a BC的全长cDNA基因克隆至具有细胞膜通透能力的膜移位序列(membrane-translocat ing sequence,MTS)的下游,构建含GST-MTS-a BC融合蛋白基因的原核表达质粒,转染大肠杆菌DH5a.经IPTG诱导表达后,裂解细菌,谷胱甘肽亲和层析分离纯化GST-MTS-a BC融合蛋白,采用Xa因子切除GST,纤维素-DEAE-52离子交换层析分离纯化MTS-a BC.在检测其分子伴娘活性的基础上,采用异硫氰荧光索(FITC)对MTS-a BC进行标记,加入新生大鼠心肌细胞培养基中,采用荧光显微镜观察其在心肌细胞中的分布.结果: 1.重组的GST-MST-a BC质粒经EcoRI酶切后,可见一4.9 kb的载体及690 bp的a BC基因插入片段 . 经测序证实,重组质粒中的GST-MTS-a BC融合蛋白的序列处于同一阅读框架.2.GST-MTS-a BC原核表达质粒导入DH5a,阳性克隆经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示50 kD的GST-MTS-a BC诱导表达带.用谷胱甘肽亲和层析能分离该诱导表达组分.分离的GST-MTS-a BC被Xa因子切成二段,其一为23 kD的MTS-a BC:另一为26 kD的GST.Western免疫印迹分析证实,GST-MTS- a BC及MTS-a BC均能为人a BC抗体识别.3.MTS-a BC能使变性聚集的肌动蛋白重新解聚,其分子伴娘功能与HSP25大小相当. F ITC标记的MTS-a BC能进入心肌细胞中,而同样标记的a BC及牛血清白蛋白(BSA)均不能进入细胞.讨论: 本研究将12个氨基酸残基组成的具有膜通透能力的MTS的碱基顺序与a BC的全长cD NA序列融合,在大肠杆菌中表达出了MTS-a BC.这种融合蛋白不但具有a BC的分子伴娘功能 , 而且能导入心肌细胞.结论: 1.克隆、表达并纯化了具有分子伴娘活性的MTS-a BC.借助MT S的介导作用,能将a BC导入心肌细跑.2. a BC导入心肌细胞的成功,为进一步研究其保护心肌缺血损伤的分子机理提供了研究工具,并为将其应用于防治心肌缺血损伤奠定了基础.
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糖皮质激素快速激活PC12细胞Erk1/2 MAPK
目的:研究皮质酮在PC12细胞是否能激活Erk1/2 MAPK及探讨其胞内信号转导机制.方法:(1)PC12细胞培养;(2)免疫蛋白印迹(Western blotting)法检测Erk1/2 MAPK的磷酸化;(3)用间接免疫荧光染色法观察激活的Erk 1/2 MAPK由胞质向核转位的情况;(4)MAPK活性直接测定法.结果:(1)皮质酮可以浓度依赖性方式刺激MAPK磷酸化,激活曲线为钟形,大激活浓度为10-9 mol/L(时间为15 min);(2)皮质酮以时间依赖性方式刺激MAPK磷酸化,皮质酮作用5 min时,有Erk1/2 MAPK激活,大激活时间为15 min;(3)皮质酮、B-BSA(皮质酮偶连的牛血清白蛋白)和NGF可激活Erk1/2 MAPK活性,Erk1/2 MAPK的激活可能不是由经典的糖皮质激素受体介导,因为B-BSA能快速激活Erk1/2 MAPK;(4)MAPK激酶抑制剂(PD98059)可抑制皮质酮诱导的Erk1/2 MAPK磷酸化,进一步证明皮质酮激活Erk1/2 MAPK;(5)皮质酮、B-BSA和NGF可引起Erk1/2 MAPK核转位,免疫荧光染色结果显示15 min时,由皮质酮和B-BSA激活的Erk1/2 MAPK从胞质转移到细胞核;(6)皮质酮可通过蛋白激酶C激活Erk 1/2 MAPK,蛋白激酶C激活剂(PMA)能激活Erk1/2MAPK,而蛋白激酶C抑制剂(G6976)能阻断皮质酮诱导的Erk1/2 MAPK激活.结论:本研究首次发现皮质酮在PC12细胞能快速激活Erk1/2 MAPK,并清楚地显示皮质酮可能作用在细胞膜上通过蛋白激酶C激活Erk1/2 MAPK.
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PLA2R在儿童和成人特发性膜性肾病肾组织中的表达
膜性肾病（MN）是常见的肾小球疾病类型之一，以肾小球毛细血管基底膜上皮侧免疫复合物沉积为特征，分为特发性和继发性。特发性膜性肾病（IMN）占我国成人原发性肾小球病的9.89%[1]；占儿童肾活检总数的7.27%，并呈逐年增高趋势[2]。2009年Beck等[3]首次发现磷脂酶A2受体（PLA2R）是成人IMN的靶抗原。Debiec等[4]发现阳离子牛血清白蛋白（cBSA）为幼儿MN的致病抗原。目前，PLA2R和cBSA在儿童MN肾组织中的表达及其意义尚不十分清楚。本研究旨在比较儿童和成人MN肾组织中PLA2R表达的异同，以明确PLA2R是否可作为儿童IMN诊断的标志物。
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低氧诱导因子1α在白蛋白过负荷致肾小管上皮细胞转分化中的作用
长期蛋白尿可致肾脏纤维化，细胞外基质(ECM)的主要来源之一是转分化的肾小管上皮细胞(TEC)[1]，因此上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)是蛋白尿患者肾脏纤维化的主要机制之一。低氧诱导因子1(HIF-1)可诱导多种细胞转分化[2]。本研究检测大鼠TEC(NRK-52E细胞)在含高浓度牛血清白蛋白(BSA)的培养基中是否发生转分化，以及shRNA- HIF -1α能否抑制BSA致NRK-52E细胞转分化的作用，以探讨HIF- 1α在蛋白尿致肾脏纤维化中的作用。
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PLGA/PEG缓释微球的制备与载药性能的研究
目的 以不同组成丙交酯/乙交酯共聚物(PLGA)为载体,制备载牛血清白蛋白(BSA)聚合物微球,考察共聚物组成、浓度及混合聚乙二醇(PEG)对聚合物微球粒径、BSA包封率和体外释放规律的影响. 方法 采用水/油/水(W/O/W)双乳化溶剂挥发技术制备载BSA的PLGA/PEG聚合物微球.利用扫描电子显微镜观察聚合物微球表面形貌,激光动态粒度分析仪测定聚合物微球粒径,紫外分光光度法测定聚合物微球药物包封率和体外释放速率. 结果 PLGA共聚物中GA含量越高,聚合物微球粒径越大.释放速率越快.同时,PEG的加入导致聚合物微球对BSA的包封率增加.高达88.22%.且释放速率也加快.采用双乳化溶剂挥发法制备的BSA-PLGA/PEG聚合物微球包封率较高、突释量较小、缓慢释放时间达3周以上并能维持较高药物浓度. 结论 通过调整各组份的比例及添加PEG,可以得到较高包封率和适当载药量的BSA-PLGA/PEG缓释微球.
关键词： PLGA/PEG缓释微球 牛血清白蛋白 双乳化溶剂挥发法 控制释放 -
新生大鼠心肌细胞体外原代培养及鉴定
目的 探讨一种较为理想的体外原代心肌细胞培养的方法.方法 取新生SD大鼠心脏心尖部,冷胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶-BSA消化分离单细胞,二次差速贴壁法纯化心肌细胞,倒置相差显微镜和流式细胞仪检测细胞存活率、活力及纯度.结果 获得的心肌细胞存活率为90％,纯度达94％以上,自发搏动明显,频率为80～ 120次/min,且培养前15 d细胞搏动频率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 本方法可获得较高存活率及纯度的心肌细胞,可满足实验要求.
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金刚烷甲酸与牛血清白蛋白相互作用的光谱分析
目的 研究金刚烷甲酸(Ad)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.方法 以BSA为荧光剂,Ad为猝灭剂,采用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱和圆二色性光谱等方法研究在生理条件下Ad与BSA的相互作用.结果 Ad与BSA二者间的结合常数为7.83 × 104L·mol-1(291 K),1.59×104L·mol-1(301 K);Ad与BSA相互结合时,结合反应的主要作用力为氢键和范德华力,结合距离为r=3.12 nm,结合位点数n=1;BSA的α-螺旋由22.4%降低为19.6%,β-折叠分别由30.2%上升为43.6%.结论 Ad对BSA的荧光猝灭属于静态荧光猝灭;紫外吸收光谱、同步荧光光谱和圆二色性光谱数据证实Ad与BSA相互作用后,BSA的二级结构发生了改变.
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荧光光度法研究微乳介质中丹参酮ⅡA与牛血清白蛋白的相互作用
目的 研究微乳介质中丹参酮ⅡA和牛血清白蛋白的相互作用行为.方法 采用荧光光度法,通过Stern-Volmer公式计算荧光猝灭数据和结合常数,通过计算热力学数据探讨丹参酮ⅡA和牛血清白蛋白的相瓦作用机理.结果 常温下结合常数为1.93×104L·moL-1,且结合常数、猝灭常数均随温度升高而降低,热力学数据△H0、△S0和△G0均为负值.结论 在微乳液中,丹参酮ⅡA对牛血清白蛋白的猝灭机制属于复合物的静态猝灭过程,其结合机制可能为范德华力和氢键作用力.
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3种直接性染发剂染料的生物安全性研究
目的 探讨藏红T、碱性品红和碱性蓝26这3种直接性染发剂染料对人体健康和人类居住环境是否存在潜在毒性.方法 采用透皮吸收、红细胞溶血、大肠埃希菌毒性测试、NIH/3T3细胞抑制率研究毒性情况,光谱学方法配合分子模拟方法研究其与生物大分子牛血清白蛋白的相互作用情况.结果 在我国2015年《化妆品卫生规范》允许的浓度下,藏红T与碱性品红在48 h后的透皮吸收分别达到0.023mmol/L和0.010 mmo]/L.3种染发剂将导致红细胞溶血(LD50达到0.16～ 0.23 mmol/L)、抑制大肠埃希菌(LD50达到0.64～ 3.77 μmol/L)和NIH/3T3细胞的存活率(LD50达到2.32～ 22.77 μmol/L),并与牛血清白蛋白细胞内生物大分子有较强的相互作用.结论 这3种直接性染发剂对人类的健康和居住环境有潜在性威胁.
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青藤碱与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究
目的 了解在生理条件下青藤碱与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.方法 采用荧光光谱和圆二色性光谱等方法,研究在生理条件下青藤碱与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.结果 青藤碱与牛血清白蛋白二者间的结合常数(KA)为(9.77±0.01) ×105 L· mo1-1(291 K)和(2.47±0.02)×105 L·mol -1(301 K)；根据热力学参数可知,青藤碱与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的作用力为氢键和范德华力,青藤碱与牛血清白蛋白间结合距离为r=2.33nm,只有1个结合位点；牛血清白蛋白的α-螺旋由18.4％降低为15.6％,β-折叠由45.4％上升为74.1％.结论 青藤碱对牛血清白蛋白的荧光猝灭机制属于静态荧光猝灭,同步荧光光谱和圆二色性光谱研究结果证实,青藤碱与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用可引起牛血清白蛋白的二级结构变化.
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不同添加剂对BSA-PLGA缓释微球特性的影响
目的：：探讨不同添加剂对聚乳酸-聚乙二醇酸( PLGA)包裹牛血清白蛋白( BSA)制备的BSA-PLGA微球特性的影响。方法：采用复乳-溶剂挥发法制备BSA-PLGA微球，显微测量微球粒径，以微量BCA 法测定微球的蛋白含量并计算包封率，进行体外释放，测定微球的累积释放量。探索添加剂PEG6000、Tween-20、Trehalose对微球粒径、包封率、突释量和累积释放量的影响。结果：加入添加剂制备的微球，粒径增大，突释降低，载药量、包封率、累积释放量均有所提高，且呈浓度依赖性(P<0.05)。结论：通过加入适当种类和浓度的添加剂，可以得到较高包封率和累积释放量、较小突释、适当载药量和粒径的BSA-PLGA微球。
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特发性膜性肾病发病机制的研究进展
膜性肾病（MN）是引起成人肾病综合征常见的原因之一。其病理表现以肾小球基底膜外脏层上皮细胞下免疫复合物（IC）形成伴肾小球基底膜（GBM）弥漫性增厚为特点。病因未明者称为特发性膜性肾病（IMN），约占80％，另有20％是由感染、肿瘤、药物、自身免疫性疾病等因素引起，称继发性膜性肾病（SMN）。近年来，国内外关于IMN发病机制的研究取得了重大进展。从鼠Heymann肾炎模型制备成功开始，先后发现了中性肽链内切酶（NEP）、M型磷脂酶A2受体（PLA2R）、醛糖还原酶（AR）、超氧化物歧化酶（SOD2）、α－烯醇化酶及阳离子化牛血清白蛋白等靶抗原。诸多文献均提出致病靶抗原、循环抗体、补体激活等在IMN发病中的重要作用。可能的机制为IgG与肾小球足细胞和（或）基底膜的抗原结合形成免疫复合物从而激活补体，导致滤过屏障受损引起蛋白尿等症状［1］，现将其做一综述如下。
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他克莫司完全抗原的制备与鉴定
目的:制备他克莫司完全抗原并鉴定.方法:采用碳二亚胺两步法将半抗原他克莫司分别与牛血清白蛋白和血蓝蛋白偶联,制备免疫原FK506-BSA和ELISA包被抗原FK506-KLH,并计算偶联率.采用紫外光谱分析法和动物免疫试验鉴定偶联产物.结果:FK506-BSA的偶联率为10.16∶1；FK506-KLH的偶联率为16.32∶1,成功制备具有免疫原性的他克莫司完全抗原.结论:紫外光谱分析和动物免疫试验证实他克莫司完全抗原合成成功,该抗原可用于他克莫司单克隆抗体的制备和免疫检测试剂盒的开发.
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PCR佐剂在单细胞PCR技术中的优化应用
目的:探索一种优化的单细胞PCR佐剂,应用于分子病理学研究中单细胞基因的检测.方法:从淋巴结反应性增生冷冻组织切片中,应用激光捕获显微切割获取单个淋巴细胞,优化单细胞PCR反应体系进行actin基因检测.对照组不添加PCR佐剂,实验A、B、C组分别添加PCR佐剂二甲基亚砜、甘油、牛血清白蛋白.结果:对照组、实验A、B、C组的单细胞扩增阳性率分别为5％,7.5％,10％,45％,对照组和实验A、B组的单细胞扩增阳性率比较无显著性差异(P＞0.05),而实验C组的单细胞扩增阳性率显著性高于对照组和实验A组(P＜0.01).结论:牛血清白蛋白是佳的单细胞PCR佐剂,显著提高了单细胞PCR的敏感性、特异性和稳定性.
