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肿瘤微环境内免疫耐受机制研究进展
近十多年来,肿瘤免疫治疗理论和体外研究均获得了显著的进展,但利用到患者体内效果却不明显,其主要原因之一就是体外研究体系与体内肿瘤微环境(tumor microenvironment)有极大的差异.对肿瘤微环境进行深入研究有可能彻底阐明肿瘤免疫耐受的产生机制并探索有效的免疫治疗方法,目前该领域进展较快,现做简要介绍.
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PD-L1对肺癌细胞迁移能力的影响
目的:探索PD-L1在肺癌细胞中的表达及其对细胞迁移能力的影响.方法:采用流式细胞术检测不同病理类型肺癌细胞株表面PD-L1分子表达水平,分别选择高、中、低表达的细胞株,后添加细胞因子诱导肺癌细胞株,采用免疫印迹术筛选出能够提高肺癌细胞株PD-L1分子表达水平的细胞因子;采用siRNA干扰技术,下调中、高表达PD-L1的肺癌细胞株中PD-L1的分子表达水平,transwell实验检测细胞迁移能力改变.结果:PD-L1在细胞株HCC827、H1299、A549(腺癌)、H226、H520(鳞癌)、H460(大细胞癌)、H446(小细胞癌)表面的表达水平分别为HCC827、H460(高表达),H1299、H226、H446、H520(中表达),A549(低表达).选择具有transwell迁移能力的腺癌细胞株H1299、A549,分别添加细胞因子IL-4、IL-6、IL-13、TGF-β-1、IFN-γ培养,筛选出TGF-β-1、IFN-γ两种因子能够上调肺癌细胞株PD-L1的表达水平,transwell实验结果显示细胞迁移能力较对照组显著增强.si-PD-L1干扰肺癌细胞株PD-L1表达后,PD-L1的表达水平明显下调,细胞迁移能力较对照组显著减弱;TGF-β-1、IFN-γ诱导细胞株PD-L1表达水平上调后能够引起细胞迁移能力增强,经siRNA干扰后,PD-L1表达水平下调,细胞迁移能力随之显著减弱.结论:PD-L1的表达能促进肺癌细胞的迁移,可能参与肺癌转移过程.
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驱化因子CCL5介导骨髓间充质干细胞增加肾透明细胞癌细胞侵袭迁移能力
目的:明确骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)对肾透明细胞癌侵袭迁移能力的影响,并通过体内、体外研究阐明阻断趋化因子CCL5信号对于抑制肾细胞癌侵袭进展效应评价.方法:利用体外细胞共培养模型,验证BM-MSCs细胞对于肾癌细胞系侵袭迁移能力的影响,利用细胞因子芯片筛选潜在差异性表达的趋化因子,在患者肿瘤组织及对应正常肾脏组织中确认该差异性细胞因子的表达情况,终通过体外细胞侵袭、转移模型及体内小鼠成瘤实验,利用CCL5中和抗体特异性阻断该信号通路,验证该信号通路作用的特异性.结果:骨髓间充质干细胞可以显著增加肾癌细胞系(OS-RC-2、SW839)体外侵袭、迁移能力(P＜0.05);蛋白印迹法提示高侵袭性相关蛋白表达MMP9、MMP2提高(P＜0.05),并增加细胞EMT过程;细胞因子芯片筛选后发现细胞共培养后CCL5信号特异性高表达(P＜0.05);Western blot蛋白印迹法显示肿瘤组织中CCL5蛋白表达水平较正常肾脏组织提高(P＜0.05);体外细胞侵袭、迁移实验结果提示,CCL5特异性中和抗体阻断后能够显著抑制BM-MSCs导致的肾细胞癌侵袭、迁移能力(P＜0.05);体内小鼠成瘤实验发现CCL5特异性中和抗体阻断能够显著降低小鼠总体生存时间(P＜0.05).结论:BM-MSCs能够特异性通过CCL5信号增加肾透明细胞癌侵袭、迁移能力,特异性阻断CCL5信号后能够显著抑制肾癌细胞侵袭、迁移及延长荷瘤小鼠的生存时间,CCL5是潜在的肾透明细胞癌治疗新靶点.
关键词： 肾细胞癌 肿瘤微环境 骨髓间充质干细胞(BM-MSCs) 趋化因子 CCL5 -
胃癌来源exosomes诱导间充质干细胞促进裸鼠皮下移植瘤生长
目的:探讨胃癌细胞(SGC7901细胞)来源exosomes作用于人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)其EMT(epithelial-mesenchymal transition)相关分子表达以及对SGC7901细胞裸鼠皮下移植瘤的影响.方法:采用离心超滤和蔗糖密度梯度超速离心方法从胃癌细胞株SGC7901细胞的培养上清液中分离出胃癌细胞exosomes,透射电子显微镜观察其大小和形态,Western blot检测其标志性蛋白CD9和CD81的表达.Western blot分析SGC7901细胞分泌exosomes作用于hucMSCs后其EMT相关分子TGF-β、IL-6和N-cadherin的表达水平;裸鼠皮下移植瘤实验观察裸鼠移植瘤的生长情况.结果:透射电子显微镜下观察SG7901-exosomes具有椭圆或碟状的囊泡结构;直径在30 ～ 100 nm之间,表达CD9和CD81蛋白;SGC7901-exosomes作用于hucMSCs后其EMT相关分子TGF-β、IL-6和N-cadherin的表达水平升高;且SGC7901-exosomes诱导过的hucMSCs能促进裸鼠皮下肿瘤的发生和发展.结论:SGC7901分泌的exosomes能促进hucMSCs高表达TGF-β、IL-6和N-cadherin;能促进SGC7901细胞裸鼠皮下移植瘤的发生和生长.
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结直肠癌相关成纤维细胞的microRNA的差异表达谱
目的:分析结直肠癌相关成纤维细胞(carcinoma associated fibroblasts,CAFs)与正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)的微小RNA (miRNA)表达谱差异.方法:收集结直肠癌组织和癌旁正常肠黏膜共3对,抽提、纯化RNA,加入荧光标记后与miRNA寡核苷酸基因芯片杂交,应用SAM软件进行数据分析,对有显著差异的miRNA进行实时荧光定量PCR验证,采用靶基因分析软件分析miRNA功能.结果:hsa-miR-138,hsa-miR-210,hsa-99a等12个miRNA在肿瘤组织中显著上调,中位假基因验出率(FDR) ＜5％；has-miR-29b、has-miR-494、has-miR-126等28个miRNA显著下调(FDR＜5％).结论:结直肠癌与正常结肠黏膜之间存在明显的miRNA差异表达谱,这些miRNA的差异性表达可能与结直肠癌的发病、侵袭、转移相关.
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趋化因子CCL5表达与肾透明细胞癌病理特征及预后的相关性研究
目的:明确趋化因子CCL5表达水平与肾透明细胞癌患者病理特征及患者预后的相关性.方法:收集本院2006年1月至2014年1月行手术治疗并术后病理证实为肾透明细胞癌患者肿瘤及对应癌旁组织标本(90例),术后随访时间为18～90个月,应用免疫组织化学、蛋白印迹法、ELISA方法分别检测趋化因子CCL5表达、血清浓度状况,分析CCL5表达与肾脏透明细胞癌临床病理特征及预后的关系.结果:肾透明细胞癌患者血清中趋化因子CCL5浓度显著高于正常非肿瘤患者(P=0.0152);趋化因子CCL5在肾透明细胞癌组织内蛋白表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01);CCL5表达强度与肿瘤大小(P<0.01)、病理分级(P<0.01)、临床分期(P<0.05)呈正相关性,而与性别与年龄关系不密切(P>0.05);CCL5表达强度与患者总生存时间(OR)呈负相关性且具有显著性差异(P<0.001).结论:趋化因子CCL5表达水平与透明细胞癌患者病理特征及预后关系密切,其异常高表达可能是促进透明细胞癌发生发展的重要原因,并有可能作为肾透明细胞癌早期监测指标及潜在治疗靶点.
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CCN3在胶质瘤细胞中的表达及对肿瘤侵袭作用影响的初步研究
目的 以低恶性胶质瘤细胞A172和高恶性胶质瘤细胞U87为研究模型,观察分泌型蛋白肾母细胞瘤过表达基因(NOV/CCN3)在胶质瘤细胞中的表达并初步探讨可能的分子生物学机制.方法 用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验检测A172和U87细胞中CCN3的表达情况,同时用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测A172和U87细胞培养上清液中CCN3的蛋白含量,Transwell试验观察CCN3刺激前后A172细胞及U87细胞的侵袭能力.结果 U87细胞中CCN3在mRNA的表达水平是A172细胞中的15.63倍,CCN3在A172细胞培养上清液中的含量是48.62 pg/mL,而在U87细胞培养上清液中的含量是549 pg/mL;U87细胞的侵袭能力强于A172细胞,10 ng/mL的CCN3能明显增强A172细胞的侵袭能力,而对细胞增殖能力无明显影响.结论 CCN3的表达可能与胶质瘤的恶性程度密切相关,并与胶质瘤侵袭能力有关,与肿瘤增殖能力无关.
关键词： 胶质瘤 肿瘤微环境 肾母细胞瘤过表达基因 肿瘤侵袭 -
肿瘤纤维间质的特点及其对比剂延迟强化的意义
近年来,随着"土壤-种子"学说的发展,由各种间质成分构成的肿瘤微环境对肿瘤细胞的影响愈来愈受到人们的重视[1].肿瘤的发生发展并非由肿瘤细胞或间质单方面决定,而是两者相互作用的结果.在肿瘤间质性成分中,纤维间质占有重要的比例,有些肿瘤内纤维间质可占瘤体的90%以上.纤维间质主要由成纤维细胞构成,分为弹力纤维、胶原纤维及网状纤维3种类型,它不仅为肿瘤细胞提供主要的结构支架,同时在肿瘤形成、演进、侵袭和转移过程等方面也发挥重要的作用[2].肿瘤纤维间质主要分布于肿瘤的内部和边缘,影响肿瘤的双向分化,既可导致肿瘤退化,也可促进其生长[3].肿瘤纤维间质随肿瘤的发生发展逐渐出现并增多,直接影响肿瘤细胞的生长演变,而且纤维间质表现为延迟强化,因此,它在肿瘤的影像诊断、评估肿瘤生物学行为和预后、以及利用影像学进行无创评估和量化方面具有重要的价值.
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沉默肝星状细胞神经菌毛素-1抑制肝癌生长的实验研究
目的 探讨沉默肝星状细胞神经菌毛素-1(neuropilin-1,NRP-1)表达后,是否会影响其对肝癌的促生长作用,并初步探讨可能存在的作用机制.方法 细胞免疫荧光及细胞荧光双重染色观察NRP-1在肝星状细胞LX2中的表达及其与血小板源性生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor-β,PDGFR-β)的共表达;MTT法检测沉默肝星状细胞NRP-1后对肝癌细胞体外增殖能力影响;建立裸鼠皮下肝癌移植瘤模型,绘制生长曲线,免疫组化法观察各组瘤体α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、NRP-1、PDGFR-β表达强度的差异.结果 LX2表面存在NRP-1表达,且NRP-1与PDGFR-β共表达于LX2;沉默LX2 NRP-1后对HepG2促增殖作用降低(P＜0.05);NRP-1 KG移植瘤体积较NRP-1 CG、NRP-1 NG小(P＜0.05),进一步对各组瘤体行免疫组化染色并进行表达强度积分分析,发现NRP-1 KG瘤体间质NRP-1、PDGFR-β表达均较NRP-1 CG弱(x2=25.89,P＜0.05;x2 =28.12,P＜0.05).结论 沉默肝星状细胞NRP-1表达后,其对肝癌细胞促增殖作用降低,在体内环境中其对肝癌皮下移植瘤促生长作用也降低,其机制与肝星状细胞活化减弱有关,而肝星状细胞NRP-1表面共受体PDGFR-β表达减弱也可能参与这一过程.
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小鼠胚胎成纤维细胞对Lewis肺癌细胞增殖及凋亡的影响
目的 探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)是否具有肿瘤相关成纤维细胞相似的生物学活性.方法 原代培养MEF并经细胞免疫组化法鉴定α-SMA的表达情况;收集培养48h无血清高糖DMEM培养基上清并制备条件培养基MEF-CM,根据实验中Lewis肺癌细胞(LLC)细胞培养基不同,分为MEF条件培养基组、DMEM组,应用MTT法检测不同培养基对LLC增殖率的影响;再根据5-Fu作用与否,进一步应用流式细胞仪检测不同培养基对LLC凋亡的影响.结果 成功获得原代培养的MEF,表达α-SMA; MEF-CM较DMEM能够明显促进LLC细胞增殖(P＜0.05);MEF-CM较DMEM能够明显抑制LLC细胞凋亡,并能够明显拮抗5-Fu的肿瘤杀伤作用(P＜0.05).结论 MEF是一种活化的成纤维细胞,具有肿瘤相关成纤维细胞相似的生物学活性,有促进LLC增殖及抑制凋亡的作用,可以作为肿瘤相关成纤维细胞用于肿瘤微环境的研究.
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人神经菌毛素-1基因重组腺病毒的构建及鉴定
目的：构建含有人神经菌毛素-1(NRP-1)基因和3 Flag标签蛋白基因的腺病毒载体，为研究该基因对肿瘤细胞与其周围间质细胞的相互作用的影响提供实验基础。方法应用AgeⅠ和NheⅠ限制性内切酶酶切含有人 NRP-1基因的质粒，再将其与酶切线性化的 pDC315-3 Flag 载体片段连接，构建穿梭质粒 pDC315-NRP-1-3 Flag；应用腺病毒骨架质粒 pBHGlox△E13Cre与此穿梭质粒共转染 HEK293细胞，产生重组腺病毒，进而对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定；用PCR和基因测序方法验证穿梭质粒 pDC315-NRP-1-3Flag 的构建；再通过荧光显微镜和 Western blot方法，分别检测质粒 pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒转染 HEK293细胞后 NRP-1蛋白的表达情况。结果经PCR和测序分析，证实穿梭质粒 pDC315-NRP-1-3 Flag与设计一致；穿梭质粒 pDC315-NRP-1-3 Flag 和重组腺病毒分别转染 HEK293细胞后，经 Western Blot均检测出在95~130 ku处有条特征带，其大小和 NRP-1-3Flag 融合蛋白(104 ku)相吻合；滴度测定为2.00E+11PFU/mL。结论成功构建了人 NRP-1基因重组腺病毒载体，并能在HEK293细胞中表达。
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程序性细胞死亡因子4在肿瘤及炎症中的交叉作用研究进展
肿瘤与炎症关系肿瘤与炎性关系密切，癌症的发生大约20％与慢性炎症有关［1］。感染引起的炎症反应作为宿主正常保护的一部分，主要目的是清除病原体，但是它也同时促进肿瘤的发生。致瘤性的病原体能够损坏宿主免疫使得低度而慢性的炎症持续存在。持续存在的慢性炎症能导致机体处于免疫失调及自身免疫性状态，终促进肿瘤的发生。然而，肿瘤发生后也可引起炎症的产生。研究表明，有些肿瘤可以通过分泌一些急性分子来促进炎症的发生，这些肿瘤相关的炎症反应能被加入到肿瘤治疗行列。Michael Karin等做了大量癌症与炎症关系的研究，他们发现两者之间关系非常密切。在吸烟对肺肿瘤发生的研究中，他们发现，吸烟引起的肺部炎症导致细胞增殖增加是引起肺肿瘤发生的原因，在髓样细胞内IκB激酶β（IKKβ）的降低以及c-Jun N末端蛋白激酶1（c-Jun n-Terminal protein kinase 1，JNK1）的灭活都可降低肿瘤的发生［2］。同样，在饮食性和遗传性的肥胖引起肝癌的研究中，他们发现肥胖引起的肝癌是依赖于促肿瘤发生因子白介素6（IL-6）及肿瘤坏死因子（TNF）的大量产生，而这两种因子可以导致肝炎发生及促癌转录因子STAT 3的激活，由肥胖引起的慢性炎症反应以及IL-6及TNF的大量产生可能也增加其他癌症的发生危险［3］。多次研究发现，肿瘤微环境中存在的免疫细胞是肿瘤相关的巨噬细胞（TAMs ）和T细胞，这种肿瘤相关的巨噬细胞能促进肿瘤的增长，而且很可能是肿瘤血管生成、肿瘤浸润、转移所必需的［4］。而且，TAMs是细胞因子的重要来源［5］，因此，TAMs在肿瘤及炎症中发挥着重要作用。目前，对细胞因子信号进行药理学干预可以降低肿瘤的发生及增长［6］。因此，寻找肿瘤与炎症相关的分子进行干预很可能作为肿瘤预防和治疗的基本方法。
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炎症调节因子与肿瘤靶向治疗研究进展
恶性肿瘤的发生和发展受遗传与环境双重因素影响,是多基因参与和多阶段演进的复杂过程,不仅受肿瘤细胞自身的遗传学和表观遗传学调控,还受着微环境变化的影响,慢性感染和炎症被认为是其中重要的因素之一.流行病学研究证实,约25%的肿瘤由炎症发展而来.在肿瘤微环境中的炎性细胞和炎性因子几乎影响着肿瘤发生发展的各个环节.炎症可以是由微生物感染引起,也可以由非炎症性物理或化学性刺激引起.肿瘤相关性炎症不仅存在于肿瘤的早期阶段,炎症调节因子和炎症细胞也涉及恶性细胞的迁移、侵袭和转移.
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胰腺星状细胞与胰腺肿瘤微环境的关系
胰腺导管癌(PDAC)是一种破坏性极强的疾病，在近的数10年里，患者的预后都没有明显的改善。近10余年来，研究发现，胰腺癌的发展和转移不仅取决于胰腺癌细胞，还与胰腺癌间质细胞密切相关，胰腺星状细胞是一种重要的间质细胞。一些体外和体内的实验的证据证实了胰腺星状细胞对胰腺癌发展的影响。本综述回顾了胰腺星状细胞在胰腺肿瘤微环境中起的作用及对胰腺癌的影响。抑制胰腺星状细胞从而改变肿瘤微环境，未来可能会提高胰腺癌的治疗效果。
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肝癌微环境及其药物干预研究进展
肝癌(HCC)是一种较常见且恶性程度较高的消化系统恶性肿瘤.在HCC的发生、发展过程中,除了HCC细胞本身外,HCC微环境发挥着至关重要的作用.HCC微环境是HCC在其发生过程中所处的内环境,它由细胞成分和非细胞成分共同构成.细胞成分主要包括肝星状细胞、肿瘤相关成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关免疫细胞、调节T细胞和肿瘤相关内皮细胞等;非细胞成分主要包括细胞外基质、胞外基质蛋白、酶类、炎症因子和细胞因子及其受体等.这些成分在HCC细胞的形成、增殖、侵袭、迁移、黏附等过程中均发挥着重要的调控作用.近年来,将HCC微环境作为潜在作用靶点已成为研究HCC癌前状态和肝细胞癌药物治疗的新方向和热点领域.目前,干预HCC微环境的药物主要包括抗纤维化、抗肿瘤血管生成和免疫调节药物等.
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硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在胶质母细胞瘤肿瘤微环境中的作用研究进展
胶质母细胞瘤(GBM)是一种呈弥漫性生长的高度恶性胶质细胞瘤.肿瘤微环境在GBM的生长中起重要作用.硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)是GBM肿瘤微环境中的重要成分之一.它通过与不同蛋白配体的相互作用,可以调控一系列配体介导的信号通路,通过对肿瘤细胞、血管内皮细胞以及免疫细胞的不同作用来促进GBM的形成和发展.HSPG的修饰酶,HPSE和SULF,也可以通过对HSPG上硫酸乙酰肝素黏多糖链的修饰作用来调节相关细胞信号通路,调节肿瘤的生长.在前神经元型和间质型GBM中,HSPG及其修饰酶的表达有明显的差异性,以其在GBM中的亚型特异性为基础,发展针对不同亚型的特异性治疗将有利于改善患者的治疗效果.正在开展的以HSPG为治疗靶点的PG545、OKN-007、M402和SST0001等药物的相关临床前研究将为GBM患者开展精准治疗提供新策略.
关键词： 胶质母细胞瘤 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 肿瘤微环境 -
浸润性树突状细胞在宫颈癌中的表达及其临床意义
树突状细胞(Dendritic cell,DC)是机体内功能强的抗原呈递细胞,具有独特的抗原呈递和激发功能,在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用.对肿瘤微环境中浸润树突状细胞功能状态的研究有助于揭示宿主局部抗肿瘤免疫状态,判断预后.本文探讨了浸润性树突状细胞在子宫颈癌中的表达及意义,现报告如下.
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嵌合抗原受体T细胞治疗实体肿瘤的进展与挑战
近年来,嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术的发展使肿瘤免疫治疗成为生物治疗领域热点.CAR-T可识别肿瘤细胞表面抗原、靶向裂解肿瘤细胞.以CD19为代表CAR-T在血液系统肿瘤治疗中取得成功.然而其在实体肿瘤中的应用仍面临巨大挑战.与血液系统肿瘤比较,实体肿瘤微环境更复杂,肿瘤特异性抗原筛选难度大.回输的CAR-T由血液系统浸润至肿瘤局部,需克服肿瘤基质细胞屏障.尽管部分CAR-T可浸润至肿瘤细胞内,但T细胞功能很快被抑制.笔者综合分析现有研究结果,从实体肿瘤抗原特异性、实体肿瘤抗原异质性、CAR-T靶向肿瘤部位以及肿瘤微环境对CAR-T治疗的抑制作用等方面重点探讨影响实体肿瘤CAR-T疗效的免疫抑制因素及其可能的解决方法.笔者相信,以基因工程为代表的生物技术发展必将为优化CAR-T结构和功能提供更为丰富的技术手段,实体肿瘤CAR-T治疗必将取得突破性进展.
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Hedgehog信号通路与胰腺癌研究进展
Hedgehog通路是动物胚胎发育中的经典信号通路,参与了人类多种组织的分化、增殖过程.在胰腺癌中,Hedgehog通路被异常激活并参与着胰腺癌多个病理生理过程.其中,近年发现Hedgehog通路在胰腺癌纤维化、乏血供、缺氧的肿瘤微环境形成过程中的作用尤为突出.应用Hedgehog抑制剂减少肿瘤间质治疗胰腺癌患者的设想已进入了临床实验阶段,但实验结果却差强人意.这激发了人们对于胰腺癌肿瘤间质所扮演角色的新一轮探索.
关键词： Hedgehog信号通路 胰腺癌 肿瘤微环境 -
胰腺星状细胞在胰腺癌发展中所扮演的角色
胰腺癌的预后极差,5年生存率＜1％.在西方国家,胰腺癌位于恶性疾病死因的第4位,年发病率约10/10万[1].外科手术及相关的辅助治疗依然作为有可能治愈胰腺癌的惟一手段.近年来胰腺癌肿瘤微环境愈来愈受关注,胰腺癌肿瘤微环境的特征是明显的肿瘤间质成分促纤维化增生反应.胰腺癌间质是一个动态的环境,其中胰腺星状细胞、细胞外基质、基质金属蛋白酶(MMPSs)及其抑制物、炎症细胞、神经纤维、干细胞、内皮细胞及各种不同的生长因子和细胞因子一道与胰腺癌细胞发生相互作用,而影响相互的生物学行为.尽管一些研究发现肿瘤间质是机体抵御肿瘤进一步扩散的重要手段,但在胰腺癌方面,越来越多的研究提示胰腺癌间质促进肿瘤发生和发展[2].
