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蓝谱Loopamp? LA-500实时浊度基因检测系统
针对LAMP?方法生产的专用检测系统，可在恒温条件下（60~65℃）将扩增和检测同步完成，具有16个独立的试管通道，多可扩展至96个通道，仪器每6秒自动收集一次浊度信号，在液晶屏上实时显示结果，内置热敏打印机，结果可直接打印。该仪器能特异的进行引物筛选、能对佳引物浓度和反应时间进行控制，以及对非特异性扩增进行判断。
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蓝谱Loopamp?LA-500实时浊度基因检测系统
针对LAMP?方法研发的专用检测系统，可在恒温条件下（60-65?C）将基因扩增过程与结果检测同步完成。每个扩增模块具有16个独立检测通道，全套系统可扩增至6个模块96个检测通道。每6秒自动检测一次浊度信号，液晶屏实时显示结果，内置热敏打印机，可直接输出结果。该仪器可进行特异性引物筛选，对佳引物浓度及佳反应时间进行控制，对非特异性扩增进行判断。
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染料法实时荧光PCR检测慢性乙型重型肝炎患者外周血克隆特异性αβT淋巴细胞
以染料法(SYBR Green I)实时荧光PCR并结合基因熔解曲线峰形来监测慢性乙型重型肝炎(慢乙重肝)患者(健康献血者为对照)外周血T细胞受体B链基因(TCRBV)克隆特异性扩增情况,从而可能反映慢乙重肝患者对HBV感染的免疫应答状态.
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血清HIV抗体阴性静脉药瘾者肝组织HIV DNA测定
为评估HIV抗体阴性HIV感染高危人群潜在的HIV传播性，本研究对来自德国的38例HIV抗体阴性的静脉药瘾者肝组织样品进行常规DNA抽提，用HIV不同结构区(gag,pol,env)6对引物同时扩增HIV DNA。结果发现38例肝组织中有30例在HIV gag区(M667/sk03c,M661/sk01c)发生特异性扩增。10例对HIV env区(env526/C02,envC01/571K)发生特异性扩增。进一步分析发现38例中有3例同时在gag、pol、env 3个区域产生特异性扩增，12例分别对HIVgag和pol区或gag、env区产生特异性扩增，17例产生单一gag或pol或env特异性扩增，6例在gag、pol、env区均阴性。对env阳性的部分标本经荧光标记自动测序仪测序并与国际HIV标准株比较，其感染HIV株与欧美B亚型同源性为86%。此研究提示，抗HIV阴性的静脉药瘾者为潜在HIV感染的高危人群，加强对这类人群“窗口期”的监测，对预防HIV的传播有重要意义。
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云南省三民族人FⅧ基因XbaⅠ限制性片段长度多态性研究
血友病甲是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致的X染色体连锁隐性遗传性疾病[1],FⅧ基因定位于X染色体长臂末端2区8带(Xq28)全长约186 kb,包括26个外显子和25个内含子.目前多利用DNA限制性内切酶片段长度多态性(RFLPs)[2]和可变数目串联重复顺序(VNTR)[3,4]作为遗传标志进行有缺陷基因的连锁分析和产前诊断.但多态性位点在不同人种、不同民族、不同地区人群中出现的频率各异,为获得不同民族FⅧ基因的遗传多态性及其信息量,我们应用聚合酶链反应(PCR)技术特异性扩增了云南省傣、彝、汉族人群FⅧ基因22内含子XbaⅠ限制性内切酶片段长度多态性位点的DNA序列,以确定该位点在上述三个民族中的诊断价值.
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含人HSP72重组腺病毒制备及其在肠上皮细胞中的表达
目的:构建并鉴定含人全长热休克蛋白72(HSP72)基因的重组腺病毒,为严重创伤后缺血缺氧损伤的防治提供基因治疗措施.方法:用同源重组方法构建含人全长HSP72目的基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-HSP72),并加以鉴定、扩增,以制取高滴度AdCMV-HSP72转染液,体外转染肠上皮细胞株IEC-6,检测目的基因表达.结果:将构建的重组腺病毒载体AdCMV-HSP72转染肠上皮细胞并表达48 h后,RT-PCR检测转染组显示特异性扩增的532bpHSP72目的基因片段.对照组(转染空腺病毒载体组)扩增结果为阴性.蛋白印迹结果显示AdCMV-HSP72转染组HSP72蛋白的表达明显增高.结论:腺病毒载体可较高效率介导HSP72在肠上皮细胞的表达.所获AdCMV-HSP72重组腺病毒可进一步用于基因治疗研究.
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HIV-1基因分型及其研究意义
艾滋病病毒1型(HIV-1)属于单股正链核糖核酸(RNA)逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒亚科(Lentivirinae),其成熟病毒粒子含2个基因组,每个基因组全长约9.8kb,含3个结构基因、6个调节基因和两侧长末端重复序列.该病毒因具有高突变率、高重组率和高复制率等特点,故其基因组能快速变异,产生大量变异株,从而顺利逃脱宿主的免疫压力,致使HIV感染者/艾滋病(HIV/AIDS)患者总数日趋增多.至2003年底,全球HIV/AIDS患者总数已超过4 000万,每天仍有约1.4万人新感染HIV[1].通过对HIV-1基因片段或全长特异性扩增、测序及种系分析,可将其变异株做基因分型,这对于HIV-1监测、诊断、疫苗和药物治疗等发现具有重要的指导意义.
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基于分子生物学特异性扩增的方法鉴别菲牛蛭
目的:通过DNA条形码鉴定和建立特异性引物扩增的方法,有效区分菲牛蛭与其他水蛭品种.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对水蛭样品的COI序列进行扩增,利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析,针对菲牛蛭素的编码基因序列、利用Primer Premier 5软件进行引物设计,对经设计、合成的8对引物通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验进行筛选,并确定特异性引物的佳退火温度.结果:通过COI序列的NJ树聚类分析可以确定20批水蛭样品中的9批菲牛蛭样品,经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳预实验筛选出引物7、为佳实验引物,且确定了引物7的佳退火温度为49℃.结论:通过COI序列的DNA条形码研究,确定了样品中的菲牛蛭,通过特异性引物PCR扩增和电泳检测,有效地将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分,为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考.
关键词： 菲牛蛭 聚合酶链式反应(PCR) COI DNA条形码 特异性扩增 -
KRT14分子诊断中两种去除假基因干扰的扩增方法比较
目的 已报道有3种方法可以去除KRT14P对于KRT14分子诊断的干扰,分别为从活检组织中提取RNA法、用识别KRT14P的限制性内切酶酶切基因组DNA法和长距离特异性扩增KRT14法.本文建立特异性扩增法并和内切酶法就能否完全去除假基因干扰做比较.方法 据文献报道KRT14P外显子2上有AluI的酶切位点而KRT14外显子2上没有该位点,用AluI消化基因组DNA.部分消化和完全消化的酶切产物作为模板用于下一步KRT14的分子诊断.比对KRT14和KRT14P的区别,设计特殊引物对使其包括3'末端的碱基和KRT14P错配而和KRT14完全匹配,这些引物对在PCR过程中将只扩增KRT14而去除假基因的干扰.结果 部分酶切消化的基因组DNA因为不能完全去除KRT14P可能导致假阳性结果.应用本文中的特殊引物对,能够很好地去除KRT14P的干扰.结论 我们采用的特异性扩增法去除KRT14P较酶切法经济有效.
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辽宁地区汉族人群多巴胺D1受体基因T-800C位点的多态性研究
多巴胺受体是多巴胺系统的重要组成成分,近年来研究显示多巴胺D1受体(DRD1)与一些神经精神疾病的病因密切相关,并有研究表DRD1受体基因存在某些功能性多态性位点影响DRD1基因的转录[1-5].我们应用等位基因特异性扩增技术分析了DRD1基因T-800C位点的基因型及等位基因的频率在辽宁汉族人群中的分布情况,观察是否存在地区及种族差异,为疾病的关联研究及群体遗传学研究提供基础资料.
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Y染色体STR位点的鉴定
Y染色体STR基因座位自发现以来,就引起了法医学者的重视,近年来由于新位点的不断发现使其在某些特殊案例尤其是在强奸案提取的混合斑检材(阴道脱落细胞和精子)和父系之间的亲权鉴定显示突出优势.本文介绍一起强奸案例,女性已死亡2个月,轻度腐败,DNA特异性扩增有一定难度,用Y染色体STR基因座成功解决了此案,现报告如下.
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特异性扩增技术鉴定龟甲与鳖甲
目的 基于特异性扩增建立动物药龟甲与鳖甲的真伪鉴定技术.方法 根据龟甲与鳖甲及3种常见伪品的全基因组序列的差异设计了5对特异性引物(PCR、PTS、PMS、PPS、PAF),采用SDS法、酚仿抽提法从龟甲与鳖甲中提取与纯化DNA,并通过聚合酶链式反应(PCR)对目标片段进行扩增,产物以琼脂糖凝胶电泳分析及凝胶成像系统检测,并根据电泳条带的有无及分子量大小以鉴定真伪.结果 龟甲与鳖甲及其常见伪品巴西龟、花龟、佛罗里达鳖的DNA经扩增后分别在120、120、81、105、114 bp处产生条带,且引物间无交叉反应,体现出很强的专属性,5个物种DNA的检出限为1 ng.自制药材、饮片、掺伪品均扩增出与目的片段相一致的条带.在市售样品中,18批龟甲和20批鳖甲经鉴定为正品,2批龟甲药材经鉴定为来源于巴西龟的伪品.结论 本文所建立的技术可准确、快速地鉴定龟甲与鳖甲的真伪,有助于监控其产品质量.
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血浆k-ras基因突变及与胰腺癌临床生物学特性关系
胰腺癌是常见的恶性肿瘤.近年来,其发病率呈增高趋势.许多研究表明,胰腺癌k-ras基因突变的发生率高达90%以上,且主要位于第12密码子[1,2].而慢性胰腺炎等胰腺良性疾病则罕有发生.因此,检测k-ras基因12密码子突变为诊断胰腺癌提供了可靠的分子生物学基础.我们分别应用高度敏感的突变等位基因特异性扩增(mutant allele specific amplification, MASA)和突变富集聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(ME-PCR-RFLP)技术,检测胰腺癌患者外周血浆k-ras基因突变,以评价其对胰腺癌的诊断意义,并与血清CA19-9水平进行比较.
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小鼠CTL体外非特异性扩增对其杀瘤活性的影响
目的在体外用抗CD3单抗、抗CD28单抗和白细胞介素2(IL-2)扩增肿瘤特异性CTL,为肿瘤过继治疗提供足够数量的、具有高度杀瘤活性的效应细胞.方法采用2种方案培养肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞.(1)抗CD3单抗刺激48 h后,加入抗CD3单抗和20 U/ml rIL-2(抗-CD3+IL-2组);(2)抗CD3单抗和抗CD28单抗同时刺激48 h后,加入抗CD3单抗、抗CD28单抗和20 U/ml rIL-2(抗-CD3+抗-CD28+IL-2组).分别检测2组效应细胞的增殖水平、杀瘤活性及表型.结果抗-CD3+IL-2组细胞的3H-TdR掺入量在第6、12、20天分别为22 126、5 426、2 072,抗-CD3+抗-CD28+IL-2组细胞的3H-TdR掺入量在第6、12、20天分别为32 168、12 922、3 265,后者明显高于前者.在培养12 d时,抗-CD3+IL-2组细胞对FBL-3的大杀伤活性的66.4%,抗-CD3+抗-CD28+IL-2组细胞对FBL-3的大杀伤活性为77.8%.细胞表型FACS分析结果表明,抗CD3+抗-CD28+IL-2组培养12 d后的细胞90%以上为Thy1.2+细胞,且CD25+细胞在抗-CD3+抗-CD28+IL-2组、抗-CD3+IL-组分别为23.00%、8.15%.结论抗CD3单抗、抗CD28单抗和低剂量IL-2同时非特异性刺激,可获得大量扩增的,具有高度杀瘤活性的肿瘤特异性C儿. [全文刊登于中华微生物学和免疫学杂志2001,21(2):143]
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两种快速鉴定甘草方法的比较
目的:建立快速检测中药材甘草的荧光定量PCR和环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)两种技术,并对它们的特异性和灵敏性进行比较.方法:以中药材甘草作为实验对象,提取DNA后,用设计的PCR引物及LAMP引物组合分别对甘草进行普通PCR、荧光定量PCR以及LAMP实验,检测引物的特异性,同时建立模板DNA的浓度梯度,对荧光定量PCR及LAMP的灵敏性进行检测.结果:甘草的特异性序列可以通过荧光定量PCR得到有效扩增,而与甘草相近的混伪品结果显示阴性.荧光定量PCR低可检测到甘草的浓度为0.67×10-4ng/μL.在LAMP特异性检测中,甘草出现浊度值,其他混伪品显示阴性.灵敏度性检测中,LAMP检测在60 min反应时间内同样检测到的甘草的低DNA浓度为0.67×10-4 ng/μL,反应产物加入荧光染料SYBR Green Ⅰ后反应液呈现肉眼可观察的明显的亮绿色.结论:LAMP检测和real-time PCR检测具有相似的特异性、灵敏度和精确性,但LAMP检测方法更为简单、方便,所需时间更短,而且不需要昂贵的仪器.因此,LAMP检测中药的方法更适合于对中药材甘草检测的推广使用.
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芬香化酶在神经干细胞及其早期分化中的表达
芳香化酶细胞色素P450(Aromatase cycochrome P-450,AROM) 作为雌激素生物合成的后一步限速酶,在脑的发育分化中扮演着重要作用.大量文献及我们的研究均表明脑内AROM主要来源于神经元,胶质细胞中是否AROM的表达尚存在争议.作为一种具神经元和胶质细胞分化潜能的神经干细胞,为了确定它是否具有雌激素合成能力,本研究用免疫细胞化学染色和RT-PCR技术研究AROM在神经干细胞及其诱导分化中的基因表达及其分子基础.实验取胚胎12.5天Wistar大鼠脑泡,用DME M/F12加B27的无血清培养基加bFGF(20ug/ml)获取神经干细胞克隆,用 10%的胎牛血清对干细胞进行诱导分化,以Nestin免疫荧光对所的克隆进行鉴定; 以NSE及GFAP免疫组化鉴定干细胞的分化能力.对所得干细胞及其分化后24h及4 8h后的细胞进行AROM免疫组化染色及RT-PCR检测AROM的表达及其启动子的利用情况.结果显示AROM免疫反应阳性反应物沉积于细胞克隆中绝大部分干细胞及一些单个的尚未分裂的干细胞胞浆中;干细胞经诱导分化后,一些有一个或两个长突起的神经元样细胞,AROM免疫反应强阳性,而大量具有多个粗长突起,胞体较为扁平的星形胶质样细胞为AROM免疫反应弱阳性或阴性,即干细胞分化后神经元中AROM强表达而神经胶质细胞中弱表达.RT-PCR结果可见AROM编码区及启动子1.4两个特异性扩增带,而未发现启动子1.3和PⅡ的特异性扩增带.说明神经干细胞及分化后AROM的表达主要受脑组织特异启动子1.4驱动.以上结果在一定程度上丰富了对脑雌激素来源的认识,可能为中枢神经系统内雌激素的来源提供新的线索.同时也为脑组织芳香化酶基因表达的调控的研究提供一个良好的细胞模型.
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QPCR检测人细小病毒B19方法的建立及其在病毒去除工艺验证中的应用
目的 建立1种检测人细小病毒(B19)的荧光定量PCR方法,并应用于纳米膜过滤去除病毒的工艺验证,评价在血液制品生产过程中纳米膜过滤去除B19的效果.方法 用上游引物(P1)5’-GGC ACC TCT CAA AAC ACT-3’和下游引物(P2)5’-C CAC TCC TTG CTG ATA CTC-3’,在95℃ 3min、95℃ 10s 52℃ 10 s 72℃10S条件下扩增40个循环,建立检测B19的QPCR方法并验证该方法的专一性、重复性和灵敏性;后用该方法检测纳米膜过滤去除制品中B19的效果.结果 该方法实验内和实验间的精密度均＜5％,低检测限为50 copies/μL;经检测纳米膜过滤可使样品中B19滴度下降3.8Logs.结论 成功建立了具有良好专一性、重复性和灵敏性的荧光定量PCR方法.
