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病毒与细胞凋亡
近年来的研究表明病毒感染与细胞凋亡之间有着密切的关系,在感染病毒引起细胞凋亡的过程中有许多新基因和新蛋白得到表达,并且参与作用,另外许多细胞因子直接或间接地参与了该过程.本文对近几年在HIV,HBV,HCV,EBV,HPV等病毒在细胞凋亡方面的研究进展进行了综合介绍.
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病毒与细胞凋亡
近年来的研究表明病毒感染与细胞凋亡之间有着密切的关系,在感染病毒引起细胞凋亡的过程中有许多新基因和新蛋白得到表达,并且参与作用,另外许多细胞因子也直接或间接地参与了该过程.本文对近几年在HIV,HBV,HCV,EBV,HPV等病毒在细胞凋亡方面的研究进展进行综合介绍.
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补锌糖尿病大鼠差异显示新基因片段的克隆鉴定及组织表达
目的 克隆补锌糖尿病大鼠差异显示的新基因片段并检测其在各组织中的表达分布.方法 对前期研究中分离到的与补锌有关的糖尿病大鼠差异显示的基因片段进行克隆、测序,同源性分析,对发现的2条新基因(2#差异显示片段及6#差异显示片段)设计特异性引物,进行RT-PCR检测,以观察新基因在各组大鼠肝脏中的表达变化,并检测新基因在不同组织中的表达情况.结果 经克隆、测序、同源性分析,在GenBank中未找到与2#差异显示片段及6#差异显示片段高同源性的序列,确定2#及6#差异显示片段为新的基因片段;2#及6#新基因片段在糖尿病对照组、糖尿病补锌组的表达量均低于正常对照组,糖尿病补锌组的表达量高于糖尿病对照组(P＜0.05);2#新基因片段在大脑及胰腺中表达量较高,在肾脏中表达量较低,在心肌、骨骼肌、胸腺中无表达.6#新基因片段在心肌、骨骼肌、大脑、肾脏、胰腺中均有表达,但在胸腺中无表达;2#及6#新基因片段被GenBank收录,接收号分别为AY952968、AY959770.结论 分离并克隆了2条与补锌有关的糖尿病大鼠差异显示的新基因片段,经RT-PCR检测其在各组大鼠肝脏及其它各组织中表达分布后,在GenBank上成功登录.
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应用EST和电子克隆策略研究血吸虫表达基因谱
目的开展血吸虫表达基因谱的研究,寻找新的疫苗候选分子和药物靶标.方法应用表达序列标签(EST)和电子克隆策略.结果获得了552个EST序列和487个电子延伸序列,其中104个EST序列在延伸前未表现同源性,而延伸后表现出有意义的同源性;获得了日本血吸虫基因表达谱的信息以及发现了有潜在药物和疫苗价值的新基因序列.结论本研究为日本血吸虫基因表达谱的研究提供更有效的研究思路.
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锌指蛋白ZNF580定位在MGC803细胞核
新基因(AF184939)ZNF580是由本组克隆并于Genbank 注册的C2H2型锌指蛋白转录因子基因,其cDNA 748～1266 bp之间的碱基构成一个完整的开放阅读框,编码172个氨基酸.蛋白功能基序分析表明:其羧基端序列中含有3个重复串联的C2H2型锌指蛋白主构域:CX2CX3FX5LX2HX3H(X代表保守性差的氨基酸),富含脯氨酸残基的氨基端序列为转录激活结构域[1].利用绿色荧光(green fluorescence protein,GFP)在活细胞内的示踪作用[2],我们将GFP与ZNF580cDNA开读框融合,导入胃癌MGC803细胞株中,直观地观察到ZNF580基因在细胞内的表达及亚细胞定位,为阐明新基因ZNF580的功能奠定了基础.
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弓形虫新基因表位疫苗质粒的构建及鉴定
目的 构建两个弓形虫新基因2B9G1、7C3-C3的表位疫苗质粒,为阐明表位疫苗的保护性奠定基础.方法 采用生物信息学方法对新基因2B9G1、7C3-C3进行表位预测,PCR扩增基因中编码3个表位的片段W2b、W2a和W4a,连接入pcDNA3,转入DH5α,挑阳性菌落进行PCR、酶切和测序鉴定;同法将W2a、W4a分别克隆入pcDNA3-W2b载体中W2b片段下游,再将W4a克隆入pcDNA3-W2b2a载体中W2a片段下游.结果 经PCR、酶切鉴定及序列测定,W2b、W2a和W4a 3个片段分别插入pcDNA3预期位置;W2a和W4a片段分别插入pcDNA3-W2b预期位置;W4a片段插入pcDNA3-W2b2a预期位置.结论成功构建单表位、双表位、多表位疫苗质粒pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a、pcDNA3-W4a、pcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b4a、pcDNA3-W2a2b4a.
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利用噬菌体展示技术研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用——与酵母双杂交方法比较
近年来基因组测序工作已揭示了数以万计的新基因,但是这些基因序列的价值只有当这些数据被翻译成蛋白质功能的时候才能被了解.而蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分,不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能,而且为我们更好地理解生命过程、疾病机制和新药开发等提供了一个很好的基础.
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基因科学研究动态
2011 年,基因科学研究不断向前发展,笔者仅就和医学有关的基因测序,新基因和新功能的发现,基因的应用研究等加以总结,供读者参考.1 基因测序方面美国科学家首次绘制出了人体胚胎干细胞内一个名为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的修饰因子的全基因图谱.5hmC在一些被打开或激活的基因内出现的频率非常高,新研究将有助于癌症的控制.研究论文发表在美国<基因组生物学>杂志上.
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p33ING1基因及其研究进展
抑癌基因对于肿瘤的发生具有抑制作用,细胞内一种或多种抑癌基因的失活可以导致肿瘤的发生.迄今,在为数不多的抑癌基因中,与肿瘤关系密切、研究为广泛的可能是p53基因.近年来又发现了一种与p53密切相关的新基因p33ING1,它对p53功能的发挥可能起至关重要的作用.
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伤寒活疫苗Ty21a免疫相关新基因的克隆及其组织分布
粘膜免疫在机体的免疫防御系统中起着重要的作用.寻找粘膜免疫防御相关的分子,对于揭示粘膜免疫的规律具有重要的意义.在通过抑制消减杂交,建立cDNA消减文库的过程中,发现了几条在Ty21a免疫后基因表达发生改变的新的ESTs.为了揭示这些ESTs对应的基因在粘膜免疫中的作用,我们利用RACE-PCR技术扩增了其中1条EST对应基因的全长.
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牛乳头瘤病毒E6蛋白与p73蛋白作用的研究
高危型乳头瘤病毒E6蛋白能结合并降解p53蛋白，导致细胞发生转化，是其致癌的关键环节。但近大量研究表明p53并非E6致癌的唯一靶位，E6蛋白的致癌机制还远没有阐明，探索E6蛋白与其新的靶分子的相互作用对肿瘤的基因治疗和全面揭示其致癌机制具有重要意义。1997年，Kaghad等发现了一个在结构和功能上都和p53极为相似的新基因，命名为p73。p73基因虽然发现时间不长，却已成为研究的热点。p73无论在结构上还是在功能上均与p53极为相似。p73蛋白具有与p53同样的四个主要功能区，其中DNA结合结构域两者的相同序列高达63%。即使是在两者同源性较低的羧基端，也发现了相似的乳头瘤病毒E6结合α-螺旋基序(motif),即VNQLVGQ序列。并且当p73过表达
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系统性红斑狼疮患者中TNF的检测
本研究检测系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血TNF-α、β,sTNFR水平以及淋巴细胞TNF-α、β基因的转录变化,从多层面分析SLE患者中TNF系统的变化.TNF-α、TNF-β(也称淋巴毒素α,LTα)的编码基因位于与免疫调节密切相关的MHCⅢ类区.近在该区发现了与TNF基因结构相同的新基因,编码的蛋白(称淋巴毒素β,LTβ)与TNF高度同源,可能在免疫调节中起重要作用[1].我们初步观察了SLE患者中TNF-α、sTNFR 以及LTβ可能的转录变化.
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Klotho 基因及其与心血管疾病关系研究进展
Klotho 基因是一种与人类衰老密切相关的新基因,其主要在肾脏和脑脉络膜中表达,其分泌性蛋白是一种与衰老有关的激素,为此推测该基因表达可能对衰老相关性疾病(如老年高血压、冠心病、动脉硬化等)的发生发展起作用.本文就该基因与心血管疾病的关系研究新进展进行综述分析,以探寻其在心血管疾病中的发病分子生物学机制,为开展基因水平上预防和早期干预心血管疾病研究提供新线索.
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低剂量三氧化二砷对HepG2细胞基因表达谱调节的影响
目的:研究低剂量三氧化二砷作用于肝HepG2细胞之后,无机砷对于肝细胞基因表达谱的影响.方法:应用基因表达谱芯片技术,对5 umo1/L三氧化二砷诱导的HepG2细胞和以DMSO处理的相同细胞的mRNA进行差异显示分析,研究三氧化二砷诱导入HepG2细胞后的差异表达基因.结果:HepG2细胞经5 umo1/L三氧化二砷诱导后,所检测的4096条目的基因中有137条产生差异表达,其中53条基因表达上调,84条基因表达下调;其中有10条尚未在genebank登录的新基因.结论:成功筛选了低剂量三氧化二砷诱导肝细胞后的基因表达谱,为进一步阐明无机砷对肝细胞作用的调节机制及低剂量无机砷用于治疗肝癌等肿瘤的药理作用机制提供了科学依据.
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应用基因表达谱芯片技术筛选NS4ATP2蛋白反式调节基因
目的:对丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)反式激活新基因NS4ATP2转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4ATP2和pcDNA3.1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测.结果:基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS4ATP2表达质粒转染的细胞有29条差异表达基因,其中12条基因表达增强,17条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关.结论:基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS4ATP2生物学功能及HCV-NS4A的致病机制提供了理论依据.
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HBV核心蛋白结合蛋白1编码基因C1的克隆化
目的:对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合蛋白l的基因C1进行克隆化研究.方法:对应用酵母双杂交技术筛选的白细胞中与HBV核心蛋白结合的新蛋白基因,利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因的编码序列,根据GenBank中的序列信息设计引物,以HepG2细胞系cDNA文库为模板,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长编码序列,并经测序证实,命名该新基因为C1,在GenBank中注册,注册号为AY555145.结果:C1基因编码区为366个核苷酸(nt),编码产物由121个氨基酸残基(aa)组成.经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,表明我们克隆的C1基因属于未知功能新基因.结论:成功克隆了HBV核心蛋白结合蛋白新基因C1.
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酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式调节靶基因编码产物NS3TP6蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV NS3TP6蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HCV NS3TP6蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个,其中3个人类白细胞CDl4抗原,1个人类免疫球蛋白入轻链,3个人类推定蛋白基因(ACl24014,AC097504,AC023785).结论:成功克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP2(615)反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交技术构建人类新基因NS5ATP2(615)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5ATP2反式激活相关基因,了解该基因的可能生物学功能.方法:构建NS5ATP2表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ATP2-TP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.半定量RT-PCR显示实验组NS5ATP2的转录水平明显高于对照组.cDNA经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pEGM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到76个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的32个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知功能基因序列,和2个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明NS5ATP2生物学功能提供理论依据.
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乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白新基因PPSBP9的克隆化
目的:研究乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白新基因PPSBP9的克隆化.方法:构建前-前-S的酵母细胞表达载体,采用酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.发现其中有1个未知功能的新基因.根据GenBank中的序列信息设计引物,以HepG2细胞系cDNA文库为模板,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长编码序列,并经测序证实,命名该新基因为PPSBP9并在GenBank中注册,注册号为AY553877.结果:PPSBP9基因的编码序列全长为840个核苷酸(nt),编码产物由279个氨基酸残基(aa)组成.经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性.结论筛选并成功的克隆了乙型肝炎病毒前-前-S蛋白与肝细胞cDNA文库中结合蛋白新基因PPSBP9,为进一步研究HBV前-前-S及其肝细胞结合蛋白新基因在HBV致病中的作用奠定了基础.
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新基因结构与功能研究的策略
发现一种新的基因,同时把其编码的新蛋白的结构与生物学功能、与生物学和临床医学之间的相互关系、以及新基因表达调节的机制阐明,是目前基因的分子生物学研究领域中具挑战性的工作.首先利用酵母双杂交(yeasttwo-hybrid)技术、酵母单杂交技术(yeast one-hybrid)、抑制性消减杂交(SSH,suppression subtractive hybridization)技术、基因芯片(DNA chip)技术、噬菌体表面展示(phagedisplay)技术等获得蛋白结合蛋白的编码基因、差异表达的基因、DNA/RNA结合的蛋白基因等,或利用生物信息学技术获得推测的编码基因.然后,利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合的手段,阐明新基因的功能、基因表达启动子的结构和调节机制基础,终阐明新基因的结构和新蛋白的生物学功能,以及这种基因研究的可能临床医学意义.生物信息学技术与分子生物学技术的结合,是目前基因的分子生物学研究领域中的重要、有效的研究技术和方法.
