Ad5F35重组腺病毒载体研究进展

在分子生物学领域,腺病毒载体是将外源基因导入动物细胞内经常使用的载体之一.由于其靶细胞种类多,转导效率高,对增殖期及静止期细胞均有很高的转导效率,不整合到宿主基因组中,不会引起插入突变,理化性质较稳定,易于分离纯化,可容纳较大的目的基因片段等优势,因而被广泛用于基因治疗、体外基因转染及基因疫苗制备等实验及临床研究中,其中Ad5F35型腺病毒载体为近年来研究热点之一,此文就其研究进展作一综述.

胰腺癌等肿瘤的免疫治疗

胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,早期诊断率和手术切除率均较低,预后差,因此,开展胰腺癌基因免疫治疗研究具有特殊意义,特别是多基因转染胰腺癌形成的特异性胰腺癌瘤苗对胰腺癌的治疗,免疫基因治疗主要是有效地增强机体自身的抗肿瘤作用、清除术后残留肿瘤细胞、修复肿瘤突变基因.目前肿瘤基因治疗常用的策略有:细胞因子导入,肿瘤疫苗制备,自杀基因治疗,利用反义寡核苷酸技术封闭活化癌基因以及向靶组织转移抑癌基因等.现就wtP53、GM-CSF、B7-1对胰腺癌和相关肿瘤的基因免疫治疗作用进行综述.

幽门螺杆菌细胞毒素相关抗原A的表达纯化及其临床研究

目的:cagA+Hp的感染与胃癌的相关性在亚洲有不同报道,本研究应用重组幽门螺杆菌毒素相关抗原A(cagA)建立检测血清中抗CagA抗体的方法,以探讨本地区cagA+Hp的感染与胃癌的相关性.方法:构建表达幽门螺杆菌Cagg抗原的表达载体,工程菌经IPIG诱导,表达的CagA包含体经Ni柱纯化,变性、复性、透析并经活性鉴定后,抗原被点在硝酸纤维素膜上或用以包被ELISA板,建立检测正常人及胃癌患者血清抗Cag3抗体的DIGFA(斑点金免疫渗滤试验,简称滴金法)和ELISA法.结果:重组克隆pltSETcagA的工程菌可表达M36000的目的蛋白,表达形式为包含体;CagA包含体经纯化后SDS-PAGE显示纯度达98%以上,活性经ELISA证实;正常人64例及胃癌患者血清50例中,cagA+Hp的感染率分别为29.7%和62%,胃癌患者cagA+Hp的感染率明显高于正常人(P＜0.01).结论:我们建立的检测血清抗CagA抗体的DIGFA和ELISA均具有良好的可重复性;胃癌患者cagA+Hp的感染比例明显高于正常人,CagA阳性幽门螺杆菌的感染与胃癌有关,CagA可作为制备防治caen+Hp感染的疫苗的后备抗原.CagA可作为幽门螺杆菌疫苗制备的候选抗原,检测患者血清幽门螺杆菌CagA抗体,有可能为胃癌的发生提供预警作用.

丝裂霉素C处理代替γ-辐射在疫苗制备中的应用研究

在自体肿瘤疫苗制备过程中为防止接种部位发生人工种植，需对肿瘤细胞进行灭能处理。常用方法为γ-照射［1］，但所需Gammacell辐射仪价格昂贵，不适于常规应用。为此我们探索用丝裂霉素C（MMC）进行化学处理代替γ-辐射的可行性。材料与方法　　一、材料　　1. 主要试剂：人肺腺癌细胞系A549人乳腺癌细胞系MCF7购自美国组织细胞库（ATCC），结肠癌细胞来自手术切除新鲜肿瘤组织。〔3H〕-胸腺嘧啶核苷、〔3H〕-尿嘧啶核苷、〔3H〕-混合氨基酸购自中国原子能研究所。MMC为日本KYOWA公司产品。　　2. 动物：5周龄雌性裸鼠(购自中国预防医学科学院动物中心)，共6只，实验组对照组各3只。　　3. 仪器：1209 RACKBETA液闪仪为瑞士Pharmacia 公司产品。Gammacell-40辐射仪为加拿大MDS Nordion公司产品。　　二、方法　　1.〔3H〕-掺入：收集5×105细胞，不同剂量MMC处理60min，Hanks液洗涤去除MMC，或60μg/ml MMC处理60min、Hanks液洗涤去除MMC之后加正常培养基，MMC处理后分别于0、1、3、6、12、24h取细胞，加入标记核苷或氨基酸，每孔37k Bq，37℃ 5%的CO2孵育3h，细胞收集器收集细胞于whatman滤纸，分别用双蒸水洗涤2次、5%三氯醋酸固定、75%、100%的酒精脱水、烘干，加液闪液上机检测。　　2.γ-照射：收集一定数量的细胞，将细胞置冰浴中，Gammacell辐射仪200Gy照射，照射后分别于0、1、3、6、12、24h取细胞进行〔3H〕-掺入实验。　　3.裸鼠荷瘤：收集1×107乳腺癌细胞MCF7，MMC 60μg/ml处理1h，洗涤、离心后于实验组裸鼠腋下接种，对照组未经处理直接接种，2周后观察成瘤情况

壳聚糖-防龋DNA疫苗微粒的制备和体外表达研究

壳聚糖(chitosan,CS)是新开发的黏膜载体系统,具有良好的生物相容性和体内可降解性,并且安全无毒.我们将壳聚糖和防龋DNA疫苗制备成微粒,对微粒的大小、形态特征和体外转染进行了研究,探讨其作为防龋DNA疫苗黏膜递呈系统的可能.

我国在肝癌治疗性疫苗制备方面取得重要成果

疫苗研究进展

自从巴斯德在实验室里研制成疫苗至今120年来,科学家们在疫苗的研究上始终没有停止过,尤以近10余年来进展更为迅速,新的疫苗不断涌现,疫苗制备的方法及作用机制日新月异,疫苗防治的疾病范围也越来越广,已远远超出预防传染病的范畴[1～3].现对疫苗的发展简要回顾,着重介绍DNA疫苗和非常规疫苗.

沙眼衣原体的免疫清除机制及其疫苗制备

沙眼衣原体(Ct)感染是当今世界上常见的性传播疾病,而疫苗在预防和控制Ct感染方面将是有效措施之一.大量研究表明细胞介导免疫是体内清除Ct的主要应答机制,动物实验也支持体液免疫抗Ct感染的可行性.本文从Ct的免疫清除机制和可能的靶抗原分析等角度,综述了目前抗Ct疫苗研制中存在的主要障碍,以及探讨实施佳免疫路径和发展新型Ct疫苗的可能性等新进展.

B细胞表位人源化的猪ZP4在大肠杆菌中的表达与鉴定

近年来,以卵透明带为靶抗原的疫苗制备已从初的卵透明带及其组分水平向更高层次发展.Minoru等[1]发现用人工合成的LDPENLTL八肽B细胞表位片段与外源性T细胞表位所得嵌合肽免疫小鼠所得抗血清可有效抑制猪精卵结合试验,但对人精卵结合试验却效果甚差.

实验性肺炎球菌荚膜多糖-辅助性T淋巴细胞表位结合疫苗的研制

为了讨论小分子合成肽能否替代大分子细菌蛋白用于疫苗制备,美国Epimmune公司Alexander等将含13个氨基酸的全人白细胞抗原(HLA)-同向重复(DR)表位(PADRE)与肺炎球菌荚膜多糖(PS)结合制成糖结合疫苗(PADRE-PS),评估了PADRE作为糖结合疫苗蛋白载体的可能性.

昆明地区丙型肝炎基因型分析

HCV是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一.现研究已知HCV基因组高度的变异性是HCV持续感染及严重预后的重要因素,且HCV基因型与感染途径、临床病情及抗病毒治疗、疫苗制备等有明显的相互关系.根据HCV基因的遗传差异性可将HCV分为不同的基因型和亚型.根据HCV基因型可以明确病毒的种系发育和传播来源,了解不同基因型和亚型的地理分布,可能与HCV治疗的疗程及效果相关[1].因此,针对当地流行的HCV基因型进行检测鉴定,具有重要的临床意义.本研究即以型特异性探针杂交法对176例HCV感染者进行HCV基因型研究,以探讨昆明地区HCV感染基因型流行特征.

减毒沙门氏菌——真核质粒的导入载体

减毒沙门氏菌可侵入到宿主的Peyer氏集结、肠淋巴结、肝、脾等组织细胞，表达异源抗原，不仅激发出宿主针对伤寒杆菌本身的免疫反应，而且激发出针对其所携带抗原的各种免疫反应，包括局部体液免疫、全身体液免疫和细胞免疫反应，尤其是CTL作用。减毒菌本身可起免疫佐剂作用。由于已减毒，终被宿主清除〔1，2〕。减毒沙门氏菌可通过口服或鼻黏膜〔3〕进行接种，因此，接种方式简单，易于大规模的免疫接种。此外，以减毒沙门氏菌为载体的疫苗制备简单、易于储存和运输、抗原不需提纯，所以可显著降低疫苗的制作成本。因此，减毒沙门氏菌是异源抗原免疫的优良载体。但这方面大量的工作都是将异源抗原基因克隆在原核表达载体上，在减毒沙门氏菌原核环境中进行表达。近年来有实验表明，减毒沙门氏菌可将克隆有异源抗原基因的真核表达质粒携带释放入宿主深部淋巴细胞，使异源抗原基因在淋巴细胞的真核环境中进行表达。因此，减毒沙门氏菌有望成为真核质粒的导入载体，成为核酸疫苗的第三种接种方式，且在本质上不同于核酸疫苗的其他两种接种方式，在核酸疫苗研制中具有新的应用前景。

癌胚抗原与B-7.1双表达基因疫苗的构建及表达

基因疫苗是把外源基因连接到真核表达质粒载体上,将重组的质粒DNA注射到动物体内,使外源基因在活体内表达,产生的抗原激活机体免疫系统引发免疫反应.DNA疫苗制备简便、安全长效、可组建多价疫苗并兼有预防和治疗作用.癌胚抗原(CEA)有一定的抗原性,可作为诱导肿瘤免疫的有效靶抗原[1].B7.1分子可促进多种抗原诱导的免疫反应[2].我们选择编码人全长CEA和B7.1的cDNA构建共表达质粒载体,并检测其在体内、外的表达,为增强CEA基因疫苗的免疫效果进行研究.

树突状细胞肿瘤疫苗临床应用的研究与进展

早在1973年,Steinman就对树突状细胞(dendritic cells,DCs)进行了描述[1].90年代以后,人们在体外应用细胞因子大量扩增DCs成功.而临床研究中观察到肿瘤组织及其周围DCs浸润程度与肿瘤转移和病人预后有关,使DCs成为肿瘤免疫研究中的一大热点.近年来,随着DCs肿瘤疫苗应用研究的开展,DCs已成为目前肿瘤免疫治疗的焦点之一,大量的临床试验也取得了可喜的效果.但在DCs肿瘤疫苗的临床应用中,疫苗的制备、抗原选择、抗原冲击方法、疫苗剂量、注射途径、治疗疗程、治疗副作用等方面还存在很多争论.本文对DCs肿瘤疫苗在临床中应用的相关问题进行综述,讨论疫苗制备的质量控制、疫苗治疗的实施、临床疗效监测的标准,以便设计出更有效的DCs肿瘤疫苗和治疗方案.

基于TEM-8新型颗粒性疫苗的制备、鉴定和体外激发CTL杀伤活性的研究

目的 制备、鉴定基于肿瘤抗原TEM-8(tumor endothelial marker-8)的复合颗粒性疫苗,研究其在体外激发CTL杀伤活性.方法 在特定的条件下将阳离子肽和DNA制备成复合颗粒性的结构,以透射电镜、DNA阻滞试验、DNaseI保护试验、Western blot等对该疫苗进行制备和鉴定,同时进行体外激发CTL杀伤活性的标准(51)~Cr释放实验.结果 在NaCl浓度为87.5 mmol/L、电荷比为2的制备条件下,电镜扫描结果显示该疫苗能形成颗粒;Western blot鉴定其可有效介导TEM-8蛋白表达;该疫苗有明显的杀伤毒性,杀伤率为59.7%,与对照组性比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功制备了基于肿瘤抗原TEM-8的复合颗粒性疫苗,其在体外能够有效激发出特异性CTL应答.

基于survivin的"模拟病毒"瘤苗的制备和鉴定

目的 制备、鉴定基于肿瘤抗原survivin的"模拟病毒"瘤苗.方法 在特定的条件下将阳离子肽和DNA制备成模拟病毒颗粒样的结构,并以扫描电镜、DNA阻滞试验、DNaseⅠ保护试验和免疫印迹(Western blotting)对该疫苗进行制备鉴定.结果 在NaCl浓度为87.5 mmol/L,电荷比为2的制备条件下,该疫苗能形成颗粒,并可有效介导瘤苗所携带基因的表达.结论 该研究成功制备了基于肿瘤抗原survivin的"模拟病毒"瘤苗,为新型的肿瘤疫苗的设计奠定了基础.

新型肽-DNA复合颗粒性疫苗的制备方法

目的研究、优化新型颗粒性肽-DNA复合疫苗的制备方法.方法以DNA沉淀试验、DNA阻滞试验、DNase Ⅰ保护试验和电镜分析对该疫苗颗粒的制备参数进行优化.结果在NaCl浓度为87.5 mmol/L,电荷比为2的制备条件下,该疫苗形成直径为20nm的均一颗粒,并可有效介导DNA疫苗所携带基因的表达.结论该研究为颗粒性肽-DNA复合疫苗获得良好的免疫学效应奠定了基础.

重组胰酶在口服轮状病毒活疫苗制备中的初步应用

目的 探究重组胰酶替代猪源胰酶在轮状病毒疫苗制备中的可行性.方法 确立3种重组胰酶的佳工作浓度;观察3种重组胰酶和猪源胰酶消化MA104细胞并连续传10代(P1~P10),根据消化时间、消化后细胞总数、细胞活率、细胞生长状况、细胞形态变化等方面进行考量比较;观察轮状病毒LH9株经4种胰酶活化,分别接种对应胰酶传代的MA104细胞上培养,通过病毒滴度(lg CCID50/mL)及RNA-PAGE检测,分析重组胰酶替代猪源胰酶在轮状病毒疫苗制备中的应用.结果 连续P1~P10代后3种重组胰酶和猪源胰酶在细胞总数、细胞活率及细胞生长状况,差异均无统计学意义(P>0.05),显微镜观察细胞形态无明显改变.轮状病毒LH9株经不同胰酶活化,接种MA104细胞P1~P10代培养后,病毒滴度差异均无统计学意义(P>0.05),且RNA-PAGE 电泳图谱未见差异.结论 初步应用试验表明3种重组胰酶均可替代猪源胰酶用于轮状病毒疫苗的制备.