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去乙酰化酶抑制与视网膜病变
组蛋白乙酰化酶(HATs)与组蛋白去乙酰化酶(HDACs)分别催化组蛋白的乙酰化与去乙酰化过程,组蛋白及特定基因的乙酰化修饰对于基因的激活或抑制发挥着调节作用,在糖尿病视网膜病变(DR)、缺血性视网膜病变、退行性视网膜病变、感染性视网膜病变、视网膜肿瘤等视网膜疾病的发生发展过程中均可发生相关基因的乙酰化水平下调,从而启动凋亡程序,导致视网膜细胞的死亡,引起视网膜功能障碍,因此,视网膜的病理生理与乙酰化修饰联系紧密.由于基因表观修饰的复杂多样性,乙酰化与去乙酰化作用在视网膜病变中所发挥的作用仍在进一步探索中.就乙酰化酶与去乙酰化酶的分类、功能及其与视网膜病变的关系及去乙酰化酶抑制对视网膜病变潜在的保护作用进行综述.
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细胞复制性衰老及早衰过程中组蛋白整体乙酰化改变
目的 检测人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导细胞早衰过程中组蛋白整体乙酰化修饰的改变.方法 应用细胞免疫荧光实验观察组蛋白乙酰化水平变化,并基于ELISA样反应方法检测组蛋白总体去乙酰化酶的活性变化,荧光定量PCR检测乙酰化酶mRNA表达,荧光定量PCR和Western印迹检测去乙酰化酶表达变化及曲古霉素A对相应酶表达的影响.结果 在细胞复制性衰老及细胞早衰过程中,组蛋白H3和H4整体乙酰化水平逐渐下降;去乙酰化酶活性逐渐降低;与年轻细胞组相比,中年细胞与复制性衰老细胞组P300表达下降;中年细胞组PCAF稍升高,复制性衰老细胞组降低;早衰起始组P300和PCAF均升高,早衰持续组P300降低;中年细胞组HDAC1表达稍降低;复制性衰老细胞组HDAC2稍降低;而HDAC3均降低;早衰起始组HDAC1,HDAC3有不同程度升高;早衰持续组HDAC2,HDAC3降低显著,而HDAC1明显升高.曲古霉素A诱导P300,PCAF表达,而降低HDAC1,HDAC2和HDAC3表达.结论 组蛋白H3和H4整体低乙酰化是衰老细胞的伴随状态;细胞复制性衰老与过氧化氢诱导的早衰内在调控机制存在差别.
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin-A诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的机制
目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin-A(TSA)诱导肿瘤细胞凋亡的机制.方法 显微镜下观察TSA作用24、48 h后,小鼠NIH3T3成纤维细胞、人乳腺癌MCF-7细胞的形态学变化,采用流式细胞学方法(FCM)检测细胞凋亡情况.利用Western blot方法检测细胞周期相关蛋白Rb蛋白和凋亡相关蛋白多聚ADP核糖聚合酶(PARP)降解片段的表达.结果 TSA作用后的NIH3T3细胞,生长变得缓慢,但细胞尚保持生长的活性.MCF-7细胞24、48 h的凋亡率分别为(36.4±1.5)%、(67.0±2.8)%,以48 h明显.TSA作用24、48、72 h后,两种细胞均出现不同程度的磷酸化Rb蛋白水平下降,MCF-7细胞中PARP发生明显的降解,48 h后降解明显,72 h达到大程度.结论 TSA可诱导MCF-7细胞凋亡,其机制可能通过改变肿瘤细胞校染色质的空间结构,以及阻滞细胞周期实现的.
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去乙酰化酶SIRT1抗衰老研究进展对防治老年性聋的启示
沉默信息调节因子2(silent information regulator 2,Sir2)相关酶1(SlRT1)是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotin-amide adenine dinucleotide,NAD)的去乙酰化酶~([1])(histone deacetylase,HDAC),到目前为止,SIRT1是研究较为深入的一个成员.去乙酰化酶SIRT1是Sir2的同源物,以许多非组蛋白和组蛋白为底物,它与多种细胞生物学功能如基因转录沉默、细胞生长周期调节、能垦代谢包括糖异生和脂质累积、胰岛素分泌、血管生成、神经保护、病毒感染以及细胞衰老有着密切关联,所以SIRT1可作为治疗不同疾病的靶点逐渐被人们所重视.
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溃疡性结肠炎大鼠肺组织中Sirt1的表达及其与氧化应激和炎症反应的影响
目的 探讨溃疡性结肠炎大鼠致肺损伤的病理机制中Sirt1的作用及其与氧化应激和炎症反应的关系.方法 采用结肠黏膜组织致敏加三硝基苯磺酸(TNBS)-50％乙醇灌肠的方法建立大鼠UC模型,48只Wistar雄性大鼠,随机分为正常组与模型组,每组各24只,每个观察时间点正常组与模型组各8只.于造模后第0、2、4周动态观察肺、结肠组织病理形态学改变,Western bolt检测肺组织中Sirt1的表达,Elisa法检测肺组织中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、TNF-α、IL-6和IL-10浓度.结果 造模第2、4周时,模型组肺组织发生病理改变,增加了氧化应激及炎症反应,Sirt1表达降低.结论 肺组织中Sirt1低表达与氧化应激反应和炎症损伤密切相关,其可能是UC肺损伤的分子机制之一.
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转录因子Bach1抑制Wnt信号通路和血管新生
目的：Bach1是一个转录抑制因子，在内皮细胞表达。但是Bach1是否调控血管新生还不清楚。本研究旨在探讨Bach1在血管新生和Wnt信号通路中的作用。方法和结果：在小鼠下肢缺血模型，Bach1基因敲除小鼠缺血肢毛细血管和小动脉密度，以及促血管新生相关因子（IL－8和VEGF）增多。 Bach1基因敲除小鼠的原代内皮细胞增殖、迁移和管腔形成能力增强。Bach1过表达抑制小鼠缺血下肢血管新生，抑制Wnt3a刺激的内皮细胞血管新生反应以及Wnt下游靶基因IL－8和VEGF的表达。 Bach1与TCF4结合抑制β－catenin与TCF4的结合。 Bach1通过减少p300／CBP和β－catenin的结合抑制β－catenin的乙酰化。 Bach1招募组氨酸去乙酰化酶，结合在IL－8启动子区的TCF4结合位点上抑制基因转录。结论：Bach1抑制缺血损伤后的血管新生，Bach1通过招募组氨酸去乙酰化酶到TCF4靶基因的启动子区域，抑制β－catenin和TCF4的结合，抑制Wnt／β－cate－
nin信号通路。 -
毛壳素诱导SIRT1表达及其在低氧性肺动脉高压形成中的作用及机制研究
目的：探索低氧性肺动脉高压（ HPH）的发生机制，明确毛壳素（ Chaetocin）在HPH发生发展中的作用及机制。方法：将小鼠分为常氧组、低氧组、低氧sham组和低氧毛壳素组，运用低压氧舱模拟5000 m海拔低氧28 d复制小鼠HPH模型。导管法检测小鼠右心室压力，并分离计算右心室肥厚指数，肺组织切片染色观察肺血管结构。体外培养平滑肌细胞，给予毛壳素及低氧（1％O2）处理，运用报告基因、PCR、Western blot、流式细胞等方法检测去乙酰化酶SIRT1及凋亡相关指标。结果：毛壳素可改善低氧诱导的小鼠右心室肥厚及肺血管重构，并显著降低小鼠右心室压力，同时逆转低氧诱导的肺组织中SIRT1以及caspase－3、8的表达下调。体外细胞实验也发现毛壳素可显著激活平滑肌细胞中SIRT1的转录和表达，上调caspase－3、8的表达，并诱导平滑肌细胞凋亡。结论：毛壳素可显著改善低氧诱导的小鼠肺血管重构，防止右心室肥厚，并降低右心室压力。其机制与上调SIRT1及凋亡相关分子的表达，诱导平滑肌细胞凋亡有关。
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低氧调控Sirt6的表达及其机制研究
低氧是肿瘤的重要微环境，它主要通过低氧诱导因子实现对肿瘤发生发展的调控。近，我们报道多梳蛋白CBX4通过SUMO化修饰低氧诱导因子HIF－1，进而增加其转录活性，促进肿瘤新生血管生成和肿瘤转移（ Cancer Cell，2014，25：118－131）。我们随后的研究发现，经CBX4进行SUMO化修饰的HIF－1α不能结合Sirt6。后者是去乙酰化酶sirtuin家族中的一员，也可能是HIF－1转录活性的共遏制因子。有趣的是，我们发现低氧能够下调Sirt6蛋白而非mRNA的表达。通过siRNA技术分别将低氧下发挥重要作用的两个转录因子HIF－1α／HIF－2α进行knockdown后发现，HIF－2α而不是HIF－1α介导了低氧对于Sirt6的调控。在常氧下转染HIF－2α能够剂量依赖地减少Sirt6的表达。低氧和过表达HIF－2α都能够缩短Sirt6蛋白的半衰期。同时，在分别加入蛋白酶体抑制剂MG132、PS－341或溶酶体抑制剂CQ，发现Sirt6是通过蛋白酶体途径而非溶酶体途径发生降解。在此基础上，我们进一步通过双荧光蛋白检测系统寻找低氧下加速Sirt6降解的泛素E3连接酶。
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二甲双胍通过调节线粒体去乙酰化酶SIRT3和线粒体动力学促卵巢癌细胞SKOV3凋亡
目的：观察二甲双胍对卵巢癌细胞株SKOV3的促凋亡作用，并探讨其可能机制。方法：MTT法检测二甲双胍（0、1．25、2．5、5、10、20、40 mmol／L）作用24 h对SKOV3细胞生存率的影响；Hoechst 33342标记细胞核，荧光显微镜下观察二甲双胍（10 mmol／L）对SKOV3细胞核形态的影响；Western blot法检测二甲双胍（10 mmol／L）对SKOV3细胞线粒体去乙酰化酶 sirtuin 3（ SIRT3）蛋白水平的影响；MitoTracker Red特异性标记线粒体，荧光显微镜下观察二甲双胍对SKOV3细胞线粒体形态的影响。结果：二甲双胍对于SKOV3细胞具有剂量依赖的抑制作用（P＜0．05）；与未处理组相比：二甲双胍（10 mmol／L）可引起SKOV3细胞核固缩、核染色增强，提示其促SKOV3细胞凋亡；二甲双胍能够上调SKOV3细胞SIRT3蛋白的水平（ P＜0．05）；二甲双胍使SKOV3细胞线粒体数目增多，形态呈点状。结论：二甲双胍能够诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡，这一过程可能同上调线粒体去乙酰化酶SIRT3以及对线粒体动力学的调控有关。
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BH3－only 模拟物S1通过活化SIRT3分子扰乱卵巢癌细胞糖代谢的机制
癌细胞中葡萄糖代谢的方式为细胞的快速增殖提供了物质和能量基础。去乙酰化酶SIRT3在癌细胞葡萄糖代谢重排和凋亡调控的过程中发挥着重要的作用，有可能成为一个有效的癌症治疗靶点。在本研究中，我们发现BH3－only模拟物S1能够抑制卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤的生长，同时能够上调SIRT3的表达。为了探讨S1对卵巢癌细胞糖代谢的影响及其分子机制，通过检测SKOV3细胞在S1作用下线粒体氧耗率（ OCR）、胞外泌酸率（ ECAR）以及葡萄糖摄入能力的改变，我们发现S1能够损伤线粒体呼吸链和抑制葡萄糖摄取。通过siRNA干扰SIRT3的表达，能够逆转S1对葡萄糖摄入的抑制作用，同时还能缓解S1对SKOV3细胞增殖的抑制效应。合用糖酵解抑制剂2－DG能够加剧SIRT3的活化，同时进一步促进S1对SKOV3细胞增殖的抑制作用和细胞凋亡的发生。综上所述，S1在卵巢癌细胞中抑制细胞增殖作用，可能是通过活化SIRT3以及扰乱葡萄糖代谢来实现的。
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外源性H2 S调控Nampt－Sirt3－CPT／LCAD乙酰化水平改善糖尿病心肌线粒体脂肪酸氧化
目的：Sirtuin 3（Sirt3）是线粒体中NAD＋依赖去乙酰化酶，通过赖氨酸乙酰化调节线粒体能量代谢。气体分子H2S具有抗氧化应激、蛋白质硫化和乙酰化等功能。本实验探讨外源性H2 S调控2型糖尿病心肌线粒体脂肪酸氧化及其关键酶的机制。方法及结果：采用db／db小鼠作为2型糖尿病动物模型，给予外源性H2 S作为治疗组（腹腔注射NaHS 30μg／kg 12周）。 Western blot及免疫荧光检测显示db／db小鼠心肌组织CSE的表达及H2 S含量均明显低于NaHS组。提取心肌组织线粒体，给予外源性H2 S组脂肪酸氧化水平、CPT及LCAD的活性及蛋白表达水平明显低于 db／db小鼠。 Co－IP及LC－MS／MS分析，结果显示在db／db小鼠中CPT及LCAD的乙酰化水平明显高于NaHS组，线粒体氧耗呼吸率及线粒体ATP含量明显低于NaHS组。 Western blot结果证实db／db小鼠心肌线粒体中Sirt3、Nampt的表达及NAD＋／NADH的比值明显低于给予外源性H2 S组。高糖高脂处理乳鼠心肌细胞，给予Nampt抑制剂FK866及NaHS，Sirt3的表达下降，但CPT及LCAD表达、活性及乙酰化水平明显增高。结论：本实验证实气体分子H2 S通过调控Nampt－Sirt3－CPT／LCAD乙酰化水平改善高糖高脂时心肌线粒体的脂肪酸氧化。
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组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶对心脏发育影响的研究进展
心脏发育受遗传和环境双重影响,任何微小的病变都会导致心脏发育异常,但潜在的机制仍不清楚.心脏发育相关基因的顺序表达是构建完美心脏的生物学基础.随着分子生物学技术的发展,人们逐渐意识到环境因素对心脏发育影响的重要性.表观遗传学的提出为心脏发育异常的研究带来了新的契机.
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Sirtuin家族及其生物学特性
沉默蛋白(sir2-related enzymes,sirtuin)或沉默信息调节因子2(silence information negulator2,Sir2)是一类从古细菌到人类都高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)依赖的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC),哺乳动物有7种sirtuin同源基因SIRT1-SIRT7,具有不同的亚细胞定位和功能.这些蛋白在细胞周期控制、维持线粒体的动态平衡、自噬和细胞生长调节等过程中发挥重要作用.笔者将对sirtuin家族的蛋白结构、酶学功能、家族成员及其生物学功能做一综述.
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Sirtuin、衰老与药物
概述:2009 年Discovery Health 播放了"极度衰老:Hayley 的故事", 讲述了一个叫做Hayley Okines 的少女因为患有早衰症(衰老速度是正常人的8 倍)而拥有老人的躯体.近期被判定活不过13 岁的她打破了这个医学宣判.她在母亲的帮助下完成并出版了自传,内容包含小小年纪的她如何与这种病症作斗争的感人经历.非正常的衰老是一种可怕的疾病.而正常的衰老往往也伴发疾病(如糖尿病、神经退行性疾病、肿瘤、心血管疾病、促炎性疾病及骨关节炎),严重影响了老年人的生活质量,带来了极大的社会负担.发达国家正在面临着人口老龄化的困扰.随着生活水平的提高,预期寿命提高,我国也逐渐步入老龄化社会.过去10年中,老年病学研究从简单的试验动物开始,逐渐发现了影响寿命的重要基因及通路.其中就有一种,NAD 依赖性蛋白去乙酰化酶,叫做sirtuin.在动物模型中,这些蛋白可以延长寿命,是在低热饮食中起抗衰老作用的重要物质.影响sirtuin 活性的物质有望成为延缓衰老、预防疾病的新药物.
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结核分枝杆菌去乙酰化酶2的克隆及酶学研究
目的：构建结核分枝杆菌去乙酰化酶2（Sir2）原核表达载体，并进行表达纯化及酶学研究。方法以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板，聚合酶链反应扩增 Sir2基因，构建 pET‐28a‐Sir2重组质粒，在 E ．coli BL2（DE3）中诱导表达蛋白，经 Ni2＋‐NTA 柱纯化，后通过去乙酰化酶试验测定 Sir2酶活的适反应温度和 pH值，以及吡嗪酰胺对其酶活的影响。结果成功构建了 Sirt2原核表达载体，并能在 E ．coli BL21（DE3）中高效表达。随后对纯化的 Sir2蛋白进行依赖于 NAD ＋的去乙酰化活性研究，得到该酶的适反应温度是25℃，适反应pH 值是9．0。在偏酸性环境中，吡嗪酰胺对酶活有抑制，而在偏碱性环境中，没有抑制作用。结论利用分子克隆技术，获得了高纯度的 Sir2蛋白并获得其酶活适反应温度和适 pH 值，及吡嗪酰胺对其有抑制效果，为研究抗结核药物吡嗪酰胺的抑菌机制提供一定基础。
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乙酰化生物学研究进展
自从可逆性蛋白质乙酰化修饰发现以来,前30年的研究多局限于探索组蛋白乙酰化修饰参与染色质重塑和基因转录的调控,并发现了作用于组蛋白的乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)、去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)及去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACI).近十年来,随着在细胞核外的细胞成分中发现乙酰化的非组蛋白及其相关的修饰酶,可逆性的乙酰化修饰在多种细胞生命过程中存在调控潜能逐渐得到认识.然而,复杂的生物学过程涉及到的蛋白质乙酰化修饰谱还不明确.由于技术的发展,目前已经可以在全蛋白质组学水平对乙酰化修饰进行鉴定和定量分析.这些研究结果揭示了乙酰化组学的复杂性,提出乙酰化修饰可能与磷酸化修饰一样普遍存在,并在生物学过程的调控中发挥着重要作用.全面的蛋白质乙酰化鉴定是一个有待继续探索的领域,将会提供更全面更有价值的蛋白质乙酰化修饰谱信息.
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Nampt在肾病炎症-纤维化中的作用机制研究进展
2013世界糖尿病大会报告称,目前全球约有3.82亿糖尿病患者,按照既往糖尿病发病规律,其中约有30％的糖尿病患者可能并发糖尿病肾病(diabetic nepbropathy,DN),其中很大一部分患者终将发展为终末阶段肾病(end stage renal dis-ease,ESRD),ESRD的病理特点是肾脏的进行性纤维化,迄今发病机制不清楚,严重危害人类健康.因此,揭示DN纤维化的发病机制和寻找治疗靶点成为预防和治疗DN的重点.病理研究发现,在肾脏前纤维化过程中,组织内大量炎症细胞浸润及众多细胞因子、化学因子、趋化因子相互作用,使肾脏内损伤部位的上皮细胞逐渐向间充质样细胞转变,成纤维细胞聚集,并在细胞外产生大量基质性物质,使组织在修复过程中引起肾脏纤维化失控,持续纤维化过程导致正常组织结构和功能丧失[1].
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Sirtuin家族与心血管疾病相关性研究进展
Sirtuin家族包括7个成员,均具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合和催化的保守区域.尽管7个成员具有这重要的共同特性,但是诸多证据显示它们的差异性远远大于它们的相似性,尤其在表达、催化活性以及生物学功能方面.Sirtuin家族蛋白具有去乙酰化酶活性或腺苷二磷酸-核糖转移酶活性,其中大部分成员具有去乙酰化酶活性,可使被ε-氨基酸乙酰化的赖氨酸残基发生去乙酰化.在蛋白发生乙酰化的情况下,Sirtuins发挥的反转性修饰加工可迅速调控蛋白活性及其调节的过程,可使细胞内乙酰化的蛋白均受到有利的调节,包括代谢和DNA修复等.本文就Sirtuin家族发挥生物学功能的结构基础、与心血管疾病的相关性等方面进行阐述.
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MicroRNAs介导的代谢调节与心力衰竭相关的研究进展
MicroRNAs参与调节物质和能量代谢,同时代谢刺激也对microRNAs进行反向调节,构成一个复杂的调节网络,在心力衰竭的发生发展中具有重要作用.去乙酰化酶可感受能量状态的变化,调节细胞代谢,保护心肌对抗代谢应激,去乙酰化酶也受到microRNAs的调控,提示存在一个错综复杂的涉及到microRNAs功能、乙酰化/去乙酰化异常、代谢改变和心功能不全的调节轴, microRNAs在心力衰竭的临床诊疗中具有应用前景.
