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外源蛋白在CHO细胞株中高效表达的策略
目的:随着基因工程技术的不断发展,目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质.真核细胞中CHO细胞与其他表达系统相比具有许多优点,是目前重组糖基蛋白生产的首选体系.本文着重阐述外源蛋白在CHO细胞中高效表达的策略.
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乙型肝炎病毒基因重组疫苗应用于母婴传播的免疫效果
作者对我国研制的哺乳动物细胞中高效表达的基因工程疫苗(CHO疫苗)阻断母婴传播的初步结果报道如下.
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乙型肝炎病毒基因重组疫苗阻断母婴传播的进一步观察
"七五"和"八五"计划期间,我国对第一代乙型肝炎(乙肝)疫苗(血源疫苗)的新生儿免疫效果进行了近期和远期效果考核,均证明效果良好."九五"期间又对第二代乙肝疫苗(基因工程疫苗)效果进行考核,以后取代血源疫苗.本文报道对我国研制的在哺乳动物细胞中高效表达的基因工程疫苗(CHO疫苗)阻断母婴传播的初步结果.
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人单核细胞趋化蛋白-1在大肠杆菌中的高效表达及其生物学活性
利用PCR和DNA重组技术,将人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)cDNA克隆在表达载体pGEX-2T中,表达产物GST/MCP-1占菌体总蛋白的50%,且以无活性的包涵体形式存在.经变复性,Glutathione Sepharose 4B亲合柱层析纯化,融合蛋白达到电泳纯,且具有MCP-1趋化活性.体内外抗肿瘤试验结果表明,GST/MCP-1激活单核细胞和淋巴细胞后可抑制肿瘤细胞生长,提示MCP-1可能成为肿瘤辅助治疗的一个候选药物.
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硫氧还原蛋白突变基因用于鲑鱼降钙素的高效可溶性融合表达
为了化学裂解后重组多肽的分离纯化，用双引物定点突变的方法将表达质粒pTrx-sCT-Gly中硫氧还原蛋白(Trx)与鲑鱼降钙素(sCT)的融合基因的第38位Met突变为Ala，并将突变后的基因克隆到pET30a中，然后转入大肠杆菌BL21，以IPTG诱导，使降钙素与硫氧还原蛋白融合表达，融合蛋白占菌体总蛋白的56%左右。并发现本原核表达体系存在“表达渗漏”现象，此现象为在菌体的对数生长期中，外源蛋白极少表达，随着培养时间的延长，外源蛋白逐步积累，达到51%的高水平。该发现在基因工程生产重组蛋白工艺中具有应用价值。
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抗卵巢癌单链免疫毒素183B2ScFvPE38融合蛋白的高效表达及活性测定
目的制备抗人卵巢癌单链免疫毒素融合蛋白183B2ScFvPE38,并对其活性进行测定,为卵巢癌导向治疗打下基础. 方法在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的诱导下,高效表达免疫毒素183B2ScFvPE38,并采用直接ELISA及细胞毒性实验对抗体及毒素部分的活性进行检查 . 结果表达蛋白183B2ScFvPE38以包涵体形式为主高效表达,并有少量可溶性表达.该蛋白具有较好的抗体活性及毒素活性. 结论抗卵巢癌单链免疫毒素183B2ScFvPE38具有良好的免疫学活性及生物学活性,有良好的应用前景.
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常用基因表达系统的特点及其在寄生虫抗原制备中的应用
寄生虫病仍然是威胁人类健康的重要疾病.与细菌及病毒不同,大多数寄生虫为多细胞生物,其抗原成分复杂,抗原结构随着寄生虫的生长发育而不断变化.即使是单细胞寄生虫如原虫,抗原结构也随着虫期的转换而发生变异.由于寄生虫抗原构成的复杂性、多变性及大多数寄生虫尚未建立人工体外培养技术,通过基因工程技术大量制备寄生虫重组抗原对寄生虫病的诊断与防治就显得尤为重要.如何根据基因表达系统的特点选择合适的体系获得高效表达,是研究中常常面临的重要问题.
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多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2蛋白高效表达和纯化
目的在前期的研究中,DAZAP2基因在多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)患者中表达明显下调,可能为MM的负性基因.须进一步获得DAZAP2蛋白,制备抗体,从而在蛋白水平上研究DAZAP2的表达、结构和功能.方法将原核重组质粒pQE30-DAZAP2转化大肠杆菌,阳性菌株经1 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,再经过纯化和透析.结果 IPTG诱导4 hr时,得到大量重组目的蛋白,占可溶蛋白的20%左右,经过Ni-NTA层析柱纯化,获得分子量为17kD的DAZAP2蛋白浓度为0.97 mg/ml.结论 DAZAP2蛋白获得高效表达,并且建立快速简便的纯化方法,目的蛋白可以用于下一步的实验.
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刚地弓形虫微线体蛋白3的高效表达及应用
目的 构建弓形虫微线体蛋白3(MIC3)原核表达体系.制备高纯度MIC3蛋白,评价其在血清学诊断方面的应用价值. 方法 应用PCR技术扩增去除信号肽序列的MIC3基因,将其插入原核表达载体pGEX-4T-3中.转化人大肠埃希菌DH5a中并克隆,用IPTG诱导表达与谷胱甘肽S转移酶融合的MIC3蛋白(rTgMIC3),用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B纯化rTgMIC3,用SDS-PAGE和Western blot鉴定rTgMIC3纯度及抗原性.以纯化的rTgMIC3为抗原,用ELISA检测人工感染刚地弓形虫ME49株的BALB/c小鼠血清IgG抗体,并观察其消长动态. 结果 扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列(AF509564)的相似性为100%;表达的MIC3融合蛋白分子质量为61.2 ku,与理论预测值一致,每升菌液能纯化出5 mg的rTgMIC3.Western blot显示,rTgMIC3能被弓形虫ME49株感染鼠血清识别;ELISA显示,感染弓形虫ME49株鼠血清能与rTgMIC3起阳性反应. 结论 本实验成功实现了MIC3基因在大肠埃希菌中的高效表达,以rTgMIC3为抗原建立的ELISA具有较高的敏感性和特异性,为开发弓形虫感染快速免疫诊断方法及弓形虫侵入宿主细胞的分子机制的研究奠定了基础.
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顺应疫苗行业技术创新潮流变供应商为支撑技术提供者
支撑技术,一般指为某一个行业提供技术支持、支撑与服务的技术平台.它具有引导先进技术的应用和技术创新,提高行业技术支撑能力,并为行业技术创新的全面实施提供技术支持的作用.具体到生物制药行业,支撑技术泛指细胞大规模培养技术平台、蛋白质分离纯化技术平台等,例如支撑多数人用和兽用疫苗生产、抗体药物生产的细胞大规模培养技术平台,它包括高效表达的细胞系/病毒株、生物反应器、个性化细胞培养基和细胞培养工艺技术.
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重组LTB蛋白在水弧菌VSP60中的高效表达与纯化
目的优化重组大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(rLTB)工程菌(VSP60)高效表达的条件. 方法以UVP凝胶照相系统扫描以及改良Lowry′s法检测rLTB表达量并分析各种因素对其影响.利用Sephacryl S-100凝胶层析纯化rLTB蛋白. 结果工程菌30℃振荡培养至吸光度(A600)值达0.2～0.3时加IPTG(终浓度为0.5mmol/L),诱导培养18～22h为rLTB蛋白表达的佳条件.Sephacryl S-100凝胶柱一步层析后,rLTB蛋白纯度可达98.1%. 结论本研究所用的培养和纯化工艺简单易行,可获得高产量、高纯度的rLTB蛋白.
关键词： 重组大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 高效表达 纯化 水弧菌 -
以lacZ作为报告基因研究霍乱弧菌irgA基因表达的铁调控性
细菌蛋白分泌表达基因水平的调控与许多环境信号密切相关，铁浓度作为环境信号影响许多基因的表达。irgA为霍乱弧菌中铁抑制外膜蛋白，在乳鼠模型中检测irgA突变株毒力下降100倍。鉴于irgA的可诱导表达，其启动子在可调控高效表达外源基因方面可能会发挥较好的作用。本研究用启动子探测质粒、以lacZ作为报告基因对irgA在大肠杆菌工程菌中的铁浓度调控表达方面进行了初步的定量研究。
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金黄色葡萄球菌RAP重组蛋白的高效表达及其免疫原性初步研究
金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)所产生的一系列毒素由agr 基因所编码并受细胞内的调节因子RNAⅢ调控,RNAⅢ的转录由细菌本身分泌的RNAⅢ激活蛋白(RNAⅢ-activating protein,RAP)诱导激活[1].
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HCV CE2融合蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的表达
HCV的E2蛋白能刺激机体产生具有中和活性的抗体,其C蛋白序列在不同的型和株间具有高度保守性,是细胞免疫的主要识别位点.本研究利用家蚕杆状病毒为载体,在家蚕培养细胞和幼虫中高效表达了具有生物活性的HCVCE2融合蛋白,为今后该蛋白免疫学特性及疫苗的研究、临床诊断试剂的开发提供了参考资料.
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人源抗甲型肝炎病毒Fab在大肠杆菌中的表达及复性
目前已有用于接触前预防的甲肝疫苗,但对于接触后预防,则多采用特异性免疫球蛋白作被动免疫.血源性免疫球蛋白虽应用效果好,但可能被血源中难以检测的病原体污染;鼠源抗体易引起人抗鼠抗体反应.因此基因工程人源抗体有望成为接触后预防的首选制剂.本文在从噬菌体抗体库筛选的抗甲型肝炎病毒(HAV)人源抗体的基础上,选用大肠杆菌高效表达该抗体Fab,并对表达产物进行了复性.
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56例神经系统疾病患者外周血尼帕病毒N基因片段检测
尼帕病毒(Nipah vires,NiV)为副黏液病毒,Henipavims亚属,单股负链RNA病毒,不分节段.人感染NiV后病死率达4|D%～70%,因此,NiV被列为危险的生物安全4(P-4)级病原.NiV共有6个结构基因,其中N基因高度保守且高效表达,因此被广泛用于NiV感染的诊断和流行病学调查.
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轮状病毒北京地方株VP4基因的序列分析和原核系统的初步表达
A组轮状病毒是引起婴幼儿重症腹泻的主要病原[1],结构蛋白VP4是A组轮状病毒感染后刺激机体产生保护性抗体的主要抗原之一.由于VP4仅占病毒毒粒蛋白的1.5%,对VP4的高效表达将非常有助于进行其多肽的功能性、抗原性和免疫原性的研究.我们先前的工作发现A组轮状病毒在我国的流行以P1A型为主,本文初步探讨了轮状病毒P1A型我国地方株VP4基因的一级结构特点及通过序列分析预测血清型的分子基础,并且将地方株VP4完整基因在原核系统中进行了表达.
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新疆出血热病毒核蛋白基因的高效表达及其在诊断中的初步应用
目的克隆并测定了克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)中国分离株(新疆出血热病毒,XHFV)BA88166株核蛋白 (NP)基因的序列并实现其在细菌中的高效表达与临床诊断的应用. 方法病毒RNA经RT-PCR扩增出完整的NP基因.将扩增产物进行序列分析并克隆至融合表达载体pET32a,使重组质粒在大肠杆菌BL-21中高效表达.将融合蛋白经初步纯化后包被ELISA板用于抗体检测. 结果 XHFV BA88166株NP基因序列以及推导的氨基酸序列与其它XHFV的NP基因和蛋白序列同源性较高,在进化树上形成独立的分支.BA88166株NP基因编码482个氨基酸的核蛋白,推测的相对分子质量(Mr)约为54×103.在细菌中表达的融合蛋白经印迹试验证明具有良好的抗原性.以所建立的ELISA方法检测疫区人和动物血清的结果与IFA一致,并与临床诊断有很好的符合率.结论 BA88166株与其它XHFV BA66019、BA8402的NP基因在进化上关系密切,综合M基因的序列分析结果,人源分离株BA88166可能是来自蜱的BA8402变异株.表达于细菌中的核蛋白可作为安全的诊断性抗原用于临床检测及流行病学调查,所建立的方法准确、特异、简便、快速.
关键词： 克里米亚-刚果出血热 核蛋白 序列测定 高效表达 诊断 -
巨细胞病毒pp150和gp52融合基因的克隆表达及重组蛋白的抗原性研究
人巨细胞病毒(HCMV)是一广泛传播的人类致病原.我们采用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增了gp52蛋白包含IgM抗原决定簇的基因片段[1]和 pp150蛋白C端包含IgM抗原决定簇的基因片段,然后将 gp52和pp150 两个基因片段串联克隆至pGEX-5x-3表达载体,成功构建了高效表达融合基因的重组载体,并对表达产物的抗原性进行了鉴定.
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人类抗凋亡基因survivin的克隆及其原核表达
目的:克隆人类抗凋亡基因survivin(SVV),实现SVV基因在大肠杆菌中的高效表达.方法:提取胃癌细胞系SGC-7901总RNA,RT-PCR扩增人SVV全长cDNA,克隆于载体pGEM-T,酶切、测序鉴定.将人类SVV基因全长cDNA克隆入原核表达载体pRSET,实现该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达.结果:得到人SVV基因全长cDNA,经测序与SVV基因的已知序列相同,原核表达所获融合蛋白经SDS-PAGE电泳与已知SVV基因的蛋白质表达产物大小相近.结论:克隆出人SVV基因的全长cDNA,并克隆入原核表达载体pRSET,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.
