大鼠BMP-7重组腺病毒构建及在肾小管上皮细胞中表达

目的:利用AdEasy~(TM) system构建携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并鉴定其在原代肾小管上皮细胞中的表达.方法:将BMP-7全长序列分为46个片段分段合成,再采用PCR方法将合成的46个寡核苷酸片段拼接成BMP-7基因,并克隆到测序载体中测序鉴定.经Not I和Hind Ⅲ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-BMP-7.EcoRI酶切重组pShuttle-BMP-7,与pAdEasy~(TM)DNA电穿孔共转化BJ5183感受态菌, 抽提重组AdBMP-7质粒,PacI酶切线性化重组质粒AdBMP-7后,转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增,腺病毒荧光检测试剂盒测定其滴度.用AdBMP-7感染大鼠肾小管上皮细胞,以ELISA法和Western-blot法检测BMP(-7)在大鼠肾小管上皮细胞中的表达.RT-PCR方法检测α-SMA mRNA的表达水平,以鉴定重组腺病毒AdBMP-7的生物学活性.结果:构建了BMP-7基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度重组腺病毒保存液.该重组腺病毒在体外能有效转染大鼠肾小管上皮细胞并高表达BMP-7蛋白,所表达的BMP-7蛋白能有效逆转由TGF-β1诱导的α-SMA表达增高.结论:成功地构建了携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并初步证实其具有一定的抗肾纤维化功能.

角蛋白8在四氯化碳诱导的小鼠肝损伤中的表达

目的:探讨角蛋白8在四氯化碳诱导的小鼠肝损伤中的表达和角蛋白8可能参与肝损伤过程的机制.方法:取ICR小鼠40只,分为4组,每组10只,雌雄各半.A组接受四氯化碳处理2周(6%的四氯化碳橄榄油溶液腹腔注射,300 μl/kg 体重,每周3次);B组接受四氯化碳处理4周;C组接受四氯化碳处理6周;D组为空白对照组.各组分别在后一次注射四氯化碳的第3天,过量麻醉处死后取材.依次分离脾脏、双肾和心脏等重要脏器并称重.提取肝脏总RNA、RT(-PCR)和免疫组化方法检测角蛋白8的表达变化.结果:四氯化碳处理导致肝脏重量和体重的比值增高,第0、2、4和6周分别为5.60%、6.87%、7.83%和7.76%,差别具有统计学意义(P＜0.01),脾脏重量和体重的比值也增高(P＜0.05).HE染色显示,肝损伤程度随四氯化碳处理时间延长而加重.RT-PCR和免疫组化检测发现,角蛋白8在肝脏的表达随四氯化碳处理时间延长而升高.结论:在四氯化碳诱导的小鼠肝损伤模型中,角蛋白8的表达水平和肝损伤程度在一定条件下呈正相关.角蛋白8的细胞内积累可能是肝损伤的分子机制之一.

N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因的克隆与表达

目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌.方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化 E.coli BL21(DE3),然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌 E.coli DH5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达.结果:DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)大小为894 bp, 编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带.以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化 E.coli BL21(DE3),在得到的转化子 E.coli BL21(DE3)/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导.在N-乙酰(-D)-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2％,总回收率为70.6%.全波长扫描分析表明:本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征.结论:所构建的诱导型产酶菌株 E.coli BL21(DE3)/pRY1和组成型表达菌株 E.coli DH5α/pRY3都可较多量的产酶.合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征.

老龄大鼠脑组织内不同部位葡萄糖转运蛋白3的表达

目的:观察老龄大鼠的脑组织内不同部位的葡萄糖转运蛋白3(GLUT 3)的表达情况,探讨GLUT 3在神经系统衰老过程中的作用.方法:用免疫组织化学染色方法,测定3月龄、18月龄及30月龄大鼠(各10只)脑组织内不同部位GLUT 3的表达强弱.结果:各月龄组大鼠脑组织内不同部位阳性细胞数均有显著差异(P<0.01),其中海马区,尤其是海马CA1 区阳性细胞数多,而运动皮质区及第1小脑小叶阳性细胞数相对较少.结论:在老龄大鼠脑组织中GLUT 3的表达减弱,提示GLUT 3在神经系统衰老过程中发挥一定作用.

新型4,8-二取代-8,9-二氢吡嗪[2,3-g]喹唑啉-7(6H)-酮化合物合成及抗肿瘤细胞增殖构效关系研究

目的:评价新型4,8-二取代-8,9-二氢吡嗪[2,3-g]喹唑啉-7(6H)-酮系列化合物体外抗肿瘤活性,获得高效抗肿瘤小分子化合物用于后续药物研发.方法:固相合成17个设计作用于表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR),结构为4,8-二取代-8,9-二氢吡嗪[2,3-g]喹唑啉-7(6H)-酮的新型系列化合物.采用MTT法对人肺癌细胞株A549、人慢性髓细胞性白血病细胞株K562及人胃癌细胞株SGC7901加药96 h后进行抗肿瘤活性筛选.结果:对于人肺癌细胞株A549,化合物7-13和7-14抑制效果佳,其IC_(50)值分别为8.10和8.12 μmol/L.共有8个化合物对人慢性髓细胞性白血病细胞株K562有抑制作用,其中化合物7-2、7-13和7-17抑制效果佳,其IC_(50)值分别为2.22、0.57和7.20 μmol/L.而对于人胃癌细胞株SGC7901,化合物7-3和7-13具有抑制效果,其IC_(50)值分别为4.20和9.71 μmol/L.结论:17个化合物对3种肿瘤细胞株呈现不同抑制效果,为结构修饰以提高化合物抗肿瘤活性提供了很好的依据.其中化合物7-13对所测瘤株均具增殖抑制活性,可作为潜在药物用于后续抗肿瘤药物研发.

骨碎补柚皮苷对人牙周韧带细胞增殖和成骨分化潜能的影响

目的:探讨骨碎补柚皮苷对人牙周韧带细胞的增殖能力以及成骨分化潜能的影响.方法:MTT法检测在含有不同浓度骨碎补柚皮苷的细胞培养液中人牙周韧带细胞的增殖特性;检测不同浓度骨碎补柚皮苷作用后人牙周韧带细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性的改变.结果:骨碎补柚皮苷≥0.01 μmol/L时能增进人牙周韧带细胞增殖(P<0.05),并能增加其ALP活性(P<0.05).结论:骨碎补柚皮苷可提高人牙周韧带细胞的增殖能力及成骨分化的潜能.

CRTH2受体拮抗剂缓解大鼠哮喘模型气道炎症

目的:通过对大鼠哮喘模型嗜酸性粒细胞(EOS)上DP1/CRTH2受体及细胞因子变化的分析,研究DP1/CRTH2拮抗剂对大鼠哮喘模型气道炎症的影响和机制.方法:40只雄性SD清洁级大鼠,随机分为正常对照组、哮喘组、CRTH2拮抗剂BAYu3405应用组、DP1受体拮抗剂BWA868C应用组,每组10只.用卵白蛋白(OVA)雾化诱喘.放射配体分析其外周血EOS上的PGD_(2)受体;ELISA测定大鼠血中IL-4和IL-5及IFN-γ水平;肺组织病理切片,HE染色镜检.结果:CRTH2拮抗剂BAYu3405应用组大鼠支气管壁EOS浸润显著减少,血清IFN-γ水平显著增高,(IL-4)、IL-5水平显著低于哮喘组和DP1受体拮抗剂BWA868C应用组(P<0.01);在肺泡灌洗液中EOS计数较哮喘组和DP1受体拮抗剂BWA868C应用组显著减少(P<0.01),外周血EOS计数与哮喘组和DP1受体拮抗剂BWA868C应用组相似,较正常对照组显著增加(P<0.01).与正常对照组相比,哮喘组、CRTH2拮抗剂BAYu3405应用组和DP1受体拮抗剂BWA868C应用组外周血EOS上DP总结合和CRTH2受体结合容量显著增加(P<0.01),DP1无显著性差异(P>0.05).结论:CRTH2受体(DP2)拮抗剂能缓解大鼠哮喘模型气道炎症,减少气道中EOS浸润,可能与CRTH2受体拮抗剂能通过拮抗EOS上增高的CRTH2结合容量,降低IL-4、IL-5和增高IFN-γ水平有关,DP1拮抗剂BWA868C对大鼠哮喘模型气道炎症无显著改善作用.

转录抑制剂DRB和α-Amanitin对A549细胞中Nrf2定位影响的研究

目的:利用细胞核亚细胞器结构的一些特异性蛋白质SC35、核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)、RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)及 Y12等标记亚细胞器,探讨转录抑制剂5,6-dichloro-1-β(-D)-ribofuranosylbenzimidazole (DRB)与α-Amanitin对人非小细胞肺癌A549细胞中Nrf2的表达与定位的影响. 方法:①50 mg/L DRB和2.5 mg/L α-Amanitin分别作用于A549细胞1 h和6 h后,Western blotting检测Nrf2及其相关蛋白的表达变化.②50 mg/L DRB和2.5 mg/L α-Amanitin分别处理A549细胞1 h,利用免疫荧光细胞技术检测Nrf2、SC35、NPC、RNA PolⅡ、Y12形态结构的变化,并研究Nrf2定位的变化.结果:①与对照组相比,DRB和α-Amanitin作用1 h后, Nrf2及其调控的下游基因HO-1、AKR1C和NQO1的蛋白质表达变化不明显,但6 h作用后,这些蛋白质的表达明显降低.②激光共聚焦显微镜观察显示,细胞经DRB和α-Amanitin处理1 h后,SC35的荧光强度明显增强,PolⅡ的荧光强度减弱,而Nrf2的定位无明显改变;NPC、Y12的表达无明显变化,且与Nrf2无共定位现象.结论:DRB和α-Amanitin能抑制Nrf2及其HO-1、AKR1C和NQO1的表达,但是对Nrf2的定位没有显著影响.

木犀草素抗肿瘤细胞增殖及增敏抗肿瘤药物作用研究

目的:研究黄酮类化合物木犀草素(Luteolin)对体外抗肿瘤细胞增殖,以及其与抗肿瘤药联用的增敏作用.方法:选用5 μmol/L或10 μmol/L木犀草素与不同浓度抗肿瘤药联合作用肿瘤细胞24 h后,用MTS法检测其体外抗增殖作用.结果:5 μmol/L木犀草素对人非小细胞肺癌细胞(A549)、人子宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人胃腺癌细胞(AGS)、人胃癌细胞(MGC-803)的抗增殖作用均<20%,对人结肠癌细胞(Caco2)和人肝癌细胞(HepG2)的抗增殖作用约20%.Bexarotene单一用药时对Hela细胞抑制率达50%(IC_(50))的浓度约为2 μmol/L,与5 μmol/L木犀草素联用后IC_(50)约0.2 μmol/L,5 μmol/L木犀草素与0.1 μmol/L Bexarotene联用对Hela细胞的抗增殖作用达44%,Bexarotene与木犀草素联用在MGC-803、HepG2、A549细胞中增敏较小,在Caco2和MCF-7细胞中无增敏作用;顺铂单一用药时对Hela细胞的IC_(50 )>30 μmol/L,与5 μmol/L木犀草素联用后IC_(50)约3 μmol/L,联用后在MGC-803、HepG2和A549中增敏较小;博来霉素单一用药时对Hela细胞的IC_(50)>100 μmol/L,对A549细胞的IC_(50)约为100 μmol/L,与5 μmol/L木犀草素联用后Hela细胞的IC_(50)约为1 μmol/L,与10 μmol/L木犀草素联用后A549细胞的IC_(50)约为10 μmol/L.木犀草素与格列卫联用在MGC-803、HepG2、A549和AGS中增敏较小.结论:木犀草素在低于10 μmol/L浓度时,对肿瘤细胞体外抗增殖作用较小.低浓度(5 μmol/L~10 μmol/L)的木犀草素在不同的肿瘤细胞中对抗肿瘤药的增敏作用强度不同,在Hela细胞中增敏作用显著.

稳定表达Keap1的H460-N5细胞株的建立及增敏抗肿瘤药物作用的研究

目的:建立野生型Keap1过表达的H460细胞株降表达Nrf2,检测Nrf2-ARE信号通路对肿瘤细胞耐药性的影响.方法:H460细胞转染mKeap1-pEGFP后经过长期筛选得到稳定表达Keap1蛋白质的细胞株,通过Western blotting和荧光定量PCR的方法进行检测;并通过多次继代培养,细胞株H460-N5稳定表达mKeap1,Nrf2及其调控基因均显著降表达;用MTS法检测抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对细胞增殖抑制率.结果:H460细胞转染mKeap1-pEGFP后筛选建立Nrf2降表达的稳定细胞株H460-N5.MTS数据显示,与对照组相比,抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对H460-N5细胞的抗增殖作用更显著.当奥沙利铂和依托泊苷分别在93 μmol/L和100 μmol/L浓度作用于对照组细胞株H460-N0时,药物作用接近半数抑制率(IC_(50));而在H460-N5细胞株中,两种抗癌药物的IC_(50)分别为42 μmol/L和30 μmol/L.阿霉素对H460-N0细胞的IC_(50)>3 mg/L,而对H460-N5细胞的IC_(50)约为2 mg/L.结论:Keap1过表达的H460-N5细胞Nrf2及调控基因显著降低并增敏抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对肿瘤细胞的增殖抑制作用.

低表达Nrf2增敏奥沙利铂抗H460细胞增殖作用

目的:建立Nrf2低表达的H460细胞株,可增敏奥沙利铂对肿瘤细胞的抗增殖作用,同时为Nrf2-ARE信号通路的研究提供便捷途径.方法:H460细胞转染pRS-hNrf2后经过筛选得到多个单克隆细胞株,通过Western blotting和GSH含量的检测方法分析各细胞株中Nrf2及其调控基因的表达以及GSH含量的变化,用MTS法检测细胞株对抗癌药物的敏感性.结果:H460细胞转染pRS-hNrf2后筛选建立Nrf2低表达的稳定细胞株H460-C9和H460-C13,与对照组相比其GSH含量均有显著降低(P_(C9)= 0.00249,P_(C13)= 0.03944);同时,MTS检测表明,抗癌药物奥沙利铂和阿霉素的抗细胞增殖作用在H460-C9和H460-C13细胞株中明显增强.结论:成功建立Nrf2低表达的H460-C9和H460-C13细胞株,与对照组细胞株相比,低表达Nrf2可增敏奥沙利铂对肿瘤细胞的抗增殖作用.

tBHQ和Sulforaphane对Caco2细胞Nrf2-ARE信号通路的影响

目的:研究抗氧化性诱导剂(激活剂)叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)和莱菔硫烷[1-异硫氰酸-(4R,S)-(甲基亚磺酰基)丁烷](sulforaphane,SFN)对人结肠癌细胞株Caco2的Nrf2-ARE信号通路的影响.方法:选取不同的时间点,分别用20 μmol/L tBHQ和5 μmol/L SFN处理Caco2细胞,从蛋白质水平、mRNA水平和蛋白质定位3个方面,分别用Western blotting、real-time PCR和免疫荧光染色(immunoflourescence staining,IF)方法来检测Nrf2以及其调控基因AKR1C1和NQO1(Western blotting,real-time PCR)表达的变化.结果:细胞核中Nrf2基因表达的佳时间点为加药诱导后8 h,细胞质中Nrf2调控基因AKR1C1和NQO1表达的佳时间点为加药诱导后16 h.tBHQ的诱导作用在撤去之后仍能持续4 h.结论:本研究使用激活剂tBHQ和SFN对Caco2细胞的Nrf2-ARE信号通路进行诱导,取得了佳的诱导时间点,并研究了撤去tBHQ后持续诱导时间,为今后在肿瘤化学预防研究中,筛选合适的激活剂及其剂量和使用次数提供了重要依据,也为研究Nrf2-ARE信号通路的抑制剂提供了重要信息.

Wif1在神经系统发育中的研究进展

WIF-1(Wnt inhibitory factor-1)早作为人视网膜表达序列标签被人们所认识,后被证明是一种Wnt分子的胞外抑制剂,属于sFRP家族.WIF-1可以直接与Wnt分子结合,抑制Wnt分子与受体细胞膜上的Frizzled受体及辅助受体LRP5/6形成三聚体复合物,从而抑制了信号传导. Wif1 在斑马鱼、爪蟾、小鼠和人的神经系统均有表达,参与爪蟾神经系统A-P轴的分化,影响小鼠视杆细胞的形成. Wif1 在胚胎期小鼠中枢神经系统中表达强烈,提示在胚胎期神经系统发育中, Wif1 可能对Wnt信号通路活性起着时空特异性的调节作用.Wnt信号通路在脊椎动物中枢神经系统发育中发挥着重要的作用,但人们对 Wif1 在神经系统发育中的功能却知之甚少.根据 Wif1 在神经发育中的表达谱信息,可以选取合适的研究时期和部位,研究 Wif1 在神经发育中的功能.

离子通道病与遗传性心律失常

离子通道病是遗传性心律失常的主要病因,可分为由钠离子通道、钾离子通道和钙离子通道基因变异所致的心律失常综合征.其机理是编码心肌细胞离子通道亚单位的基因变异,导致离子通道功能的变化,进而引起异常的心电活动,临床表现为恶性心律失常.

铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控及治疗对策研究进展

铜绿假单胞菌是医院内感染重要的致病菌.该菌易形成生物被膜,常给临床治疗带来很多困难.在生物被膜形成的细菌早期定植、蘑菇状结构形成以及细胞外基质生成的各个阶段均受多种分子及基因的调控,而密度感知信号系统整体调控生物被膜的形成.根据生物被膜的形成过程及调控机制,多种针对生物被膜的治疗对策已应用于临床,一些新药物和新方法也在研究之中.

丙泊酚靶控输注复合雷米芬太尼麻醉期间右旋美托咪啶对麻醉深度的影响

目的: 研究丙泊酚靶控输注复合雷米芬太尼麻醉期间,右旋美托咪啶(Dex)对脑电双频谱指数(BIS)和听觉诱发电位指数(AAI)的影响.方法:选择拟于全麻下行甲状腺次全切除术的年轻患者30例(ASA Ⅰ～Ⅱ级),诱导方法:以血浆药物浓度为靶目标进行丙泊酚靶控输注,靶浓度(Ct)为4 mg/L,同时静脉泵注雷米芬太尼1 μg/kg,待患者意识消失后静注罗库溴铵0.6 mg/kg,1 min后气管内插管.术中以雷米芬太尼0.2 μg/(kg·min)~(-1) 维持麻醉,定时追加肌松药,调节丙泊酚靶控输注的Ct值,使BIS维持在50±3;维持10 min稳定后将患者随机双盲分为两组:D组(n=15):Dex 0.4 μg/kg,用生理盐水稀释成5 ml静脉泵注(5 min),C组(对照,n=15):生理盐水5 ml,方法同D组.记录20 min内BIS、AAI、MAP、HR.结果:D组静注Dex后BIS由51.4±2.2逐渐下降,20 min时降为42.2±15.7(P<0.05);而AAI给药前15.1±3.3,20 min内没有明显变化;C组对照观察期间BIS、AAI均无明显变化.结论:丙泊酚靶控输注复合雷米芬太尼麻醉稳定后,静注Dex能使BIS进一步下降,而AAI保持不变.

改良法与常规法GlideScope~(R)视频喉镜经口气管插管的比较

目的:通过与常规法比较,评估改良法GlideScope~(R)视频喉镜经口气管插管在操作和患者血流动力学改变上有无优势.方法:选择ASAⅠ～Ⅱ级、年龄21～53岁、拟在经口气管插管全身麻醉下施择期腹部外科手术的60例患者,随机分为常规组和改良组,每组30例.常规全麻诱导,常规组按照先置入GlideScope~(R)视频喉镜镜片,再置入气管导管的顺序经口气管插管,改良组按照先置入气管导管,再置入GlideScope~(R)视频喉镜镜片的顺序经口气管插管,记录气管插管操作时间,记录诱导前、诱导后、气管插管时和插管后1、3 min的血压及心率变化.结果:改良组的操作时间短于常规组;两组在气管插管时均引起血压和心率的上升,但两组间比较无统计学意义.结论:改良法能改善GlideScope~(R)视频喉镜经口气管插管的操作简便性,但还不能改善其对血流动力学的影响.

Nrf2-ARE通路抑制作用研究展望

转录因子红细胞系-2p45(NF-E2)相关因子-2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)通过上调解毒酶和抗氧化酶基因的表达,为人体提供防御系统.然而,Nrf2表达过高,不但对肿瘤形成和生长起促进作用,而且可增强肿瘤细胞的耐药性.

《浙江大学学报:医学版》征订和征稿启事

外阴浅表性血管黏液瘤一例

1 病例摘要患者,女,27岁,4年前因多次便血,入沈阳某医院治疗,诊断为肛周尖锐湿疣病变.因血红蛋白为30 g/L,多次输血治疗,具体量不详,湿疣未彻底治愈.4年来病情有所反复.2008年8月出现外阴部肿物,下腹、会阴部皮肤脓肿、破溃,病情逐渐加重,外阴部肿物近半年由直径2 cm左右迅速增大至15 cm×8 cm.