浙江大学学报（医学版）杂志
Journal of Zhejiang University(Medical Sciences) 절강대학학보（의학판）
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牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导不同细胞分泌炎性细胞因子的差异性
目的:探讨牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)脂多糖(LPS),诱导人口腔上皮细胞KB和人牙龈成纤维细胞HGF-1及人单核-巨噬样细胞THP-1,分泌炎性细胞因子的能力及其差异.方法:采用酚水法提取Pg ATCC33277株的脂多糖(Pg-LPS).采用鲎试验和红外光谱对提取的Pg-LPS进行鉴定.采用ELISA试剂盒,定量检测不同浓度和时间Pg-LPS作用的上述3种细胞培养物上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8变化水平.实验中采用商品化大肠杆菌O111:B4脂多糖(E-LPS)为对照.结果:Pg-LPS和E-LPS凝固鲎试剂所需低浓度均为15 ng/ml,其红外光谱也极为相似.在Pg-LPS或E-LPS作用下,HGF-1细胞分泌的TNF-α和IL-1β水平呈单峰形增高(P<0.01),但THP-1细胞为持续性升高(P<0.01).Pg-LPS或E-LPS具有促HGF-1和THP-1细胞持续性增强IL-6分泌的作用(P<0.01).Pg-LPS和E-LPS均可诱导THP-1细胞增强IL-8的分泌(P<0.01),但对HGF-1细胞仅Pg-LPS有促IL-8分泌的效应(P<0.01).Pg-LPS和E-LPS均不能诱导KB细胞分泌上述细胞因子.结论:Pg-LPS有很强的促靶细胞分泌多种炎性细胞因子的生物学活性,从而引发初始的局部炎症反应.Pg-LPS致炎作用与E-LPS相似,但诱导不同炎性细胞因子的模式颇有差异.KB细胞不能作为LPS致炎作用的效应靶细胞.
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腹泻型肠易激综合征患者外周血T淋巴细胞亚群及血清微量元素含量变化研究
目的:通过测定腹泻型肠易激综合征(D-IBS)患者外周血T淋巴细胞亚群及血清Zn、Se、Fe、Cu含量变化,旨在探讨IBS的可能病因及发病新机制.方法:随机抽取30例D-IBS患者和30例健康志愿者的外周血标本,采用流式细胞技术,分别测定CD3、CD4、CD8 T淋巴细胞亚群百分比,并计算CD4/CD8比值;采用原子吸收光谱法,测定血清Zn、Fe、Cu水平,用原子荧光分析法,测定血清Se水平.结果:D-IBS组外周血CD4 T淋巴细胞水平及CD4/CD8比值较正常对照组明显降低(P<0.01);D-IBS组与正常组血清Zn、Se、Fe、Cu水平差异无统计学意义(P>0.05).结论:外周血T淋巴细胞CD4水平及CD4/CD8比值降低提示D-IBS患者可能存在细胞免疫异常;D-IBS患者血清Zn、Se、Fe、Cu水平较正常对照组无统计学意义.
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G4PAMAM/VEGFASODN抗乳腺癌血管生成的体外实验研究
目的:探讨G4PAMAM/VEGFASODN复合物体外对乳腺癌细胞MDA-MB-231VEGF、VEGF mRNA表达的影响及血管内皮细胞生长的抑制作用.方法:用透射电镜观测G4PAMAM/VEGFASODN的粒径,在不同的酸碱度下观察G4PAMAM/VEGFASODN的稳定性;将G4PAMAM/VEGFASODN进行体外转染,流式细胞仪测定其转染率,激光共聚焦检测转染阳性细胞,MTT法检测转染后细胞的存活率;免疫组化检测VEGF蛋白的表达,RT-PCR检测VEGF mRNA的表达,MTT法测定此复合物对血管内皮细胞生长的抑制作用.结果:G4PAMAM/VEGFASODN的直径约10 nm,呈较均匀的网状排列;酸碱度在5到10的范围内具有较高的稳定性,不同电荷比的G4PAMAM/VEGFASODN均没有出现被解离的现象;48 h 时G4PAMAM/VEGFASODN组在1∶40的条件下转染率明显高于脂质体组;各组转染物均对细胞无明显毒性;VEGF 蛋白在G4PAMAM/VEGFASODN转染后的MDA-MB-231细胞胞浆中的染色强度明显减弱,阳性表达率显著降低,VEGF mRNA的表达也受到有效的抑制.结论:G4PAMAM/VEGFASODN复合物稳定性好、转染率高,是一种有良好应用前景的新型纳米载体基因转移系统;G4PAMAM/VEGFASODN复合物能够高效特异地抑制目的基因VEGF的表达,为进一步进行体内动物实验提供了依据.
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Ref-1在阿尔茨海默病大鼠海马CA1区表达的研究
目的:探讨Ref-1在阿尔茨海默病(AD)大鼠发病中的变化及其可能机制.方法:采用Aβ25-35单次侧脑室注射诱导AD大鼠模型,Y迷宫测定大鼠行为学变化,免疫组化法检测建模后4 d、7 d和14 d时痴呆组、对照组大鼠海马CA1区Ref-1的表达.结果:①Aβ注射7 d、14 d后,痴呆组大鼠达到学习标准的训练次数、错误次数和全天总反应时间较对照组均明显增加(P<0.05).②痴呆组Aβ注射4 d起,海马CA1区Ref-1表达开始增高(P<0.01),随着观察时点的延长,这种表达进一步增高(P<0.01).结论:大鼠侧脑室注射Aβ 7 d可成功诱导AD大鼠模型;Ref-1的上调早于大鼠记忆障碍的发生,Ref-1可能参与了AD的发生发展.
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不同血清群问号钩端螺旋体mce基因序列分析及表达模式的研究
目的:确定问号钩端螺旋体(简称钩体)株携带侵袭相关mce基因情况,原核表达mce基因并制备其抗血清,了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化.方法:采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段,T-A克隆后测序.采用基因工程技术构建mce基因原核表达系统,SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况,采用Western Blot对表达的rMce进行鉴定.采用皮内免疫法制备兔抗rMce血清,免疫双扩散试验测定其效价.采用实时荧光定量RT-PCR,检测问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染J774A.1细胞前后mce基因转录水平的变化.结果:我国13株问号钩体株均携带mce基因,双曲钩体三宝垄群patoc型Patoc Ⅰ株则否.与报道的序列(GenBank accession No.:NP712236)比较,所克隆的mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.02%～100%和97.91%～100%.所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce,其产量为细菌总蛋白的5%.问号钩体56601株全菌抗血清能有效识别rMce.问号钩体56601株感染细胞后mce基因转录水平明显上调.结论:mce基因仅存在于致病性的问号钩体中,且其转录水平呈细胞接触上调模式,表明该基因与问号钩体致病性密切相关.mce基因产物是序列保守的外膜蛋白.所构建的mce基因原核表达系统及所制备的rMce抗血清为深入研究该基因功能提供了有效的手段.
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问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析
目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定.方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原核表达系统.采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统,检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量.采用免疫双扩散试验及Western Blot,鉴定rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2的免疫原性.结果:获得了序列正确的lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统E.coli BL21DE-3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2.表达条件优化后的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量为37.78 mg/L,是优化前的3.7倍.rLipL32/1-LipL21- OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4.rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2.rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号.结论:成功地构建了lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原.
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问号钩端螺旋体对主要细胞外基质分子黏附作用及其差异性研究
目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)对细胞外基质(ECM)分子的黏附作用及其差异.方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株对J774A.1、L929和Vero细胞感染模型,采用Fontana镀银染色法及显微镜检查法,了解问号钩体56601株黏附细胞ECM的效果.建立多种ELISAs,检测问号钩体56601株黏附ECM分子层粘连蛋白(LN)、纤维纤连蛋白(FN)、核心蛋白多糖(DEN)及胶原蛋白1、2、4(COL1,2,4)的作用,采用竞争性抑制试验对上述实验结果进行验证.结果:问号钩体56601株能以一端或两端黏附于L929、J774A.1和Vero细胞的ECM部位.问号钩体56601株可与上述6种ECM分子发生黏附,其中对COL1、LN、COL4的黏附作用较强.问号钩体56601株分别与上述6种ECM分子预孵育后,对相应ECM分子的黏附作用明显下降.结论:ECM是问号钩体黏附宿主细胞的主要部位.LN、FN、DEN、COL1、COL2、COL 4均是问号钩体黏附的受体分子,但问号钩体对不同ECM分子的黏附效果有一定差异.
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问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞凋亡及caspase-3、-6活化对凋亡的影响
目的:了解问号钩端螺旋体(钩体)诱导小鼠单核-巨噬样细胞(J774A.1)凋亡的作用,以及caspase-3、-6活化对凋亡的影响.方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株J774A.1细胞感染模型.采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡或坏死情况.分别采用荧光比色法和Western Blot,检测感染细胞caspase-3、-6活性及其底物(PARA和LaminA/C)剪切情况.结果:多种不同浓度的问号钩体赖株感染均可使J774A.1细胞发生凋亡,其中以问号钩体∶细胞=100∶1的比例感染时凋亡率高(48.81%±5.95%).感染细胞caspase-3和-6大活性分别为(1453.41±36.07)FU和(618.65±39.82)FU,是未感染细胞的16.38和9.98倍.感染细胞的PARP和Lamin A/C均被剪切.Caspase-3、-6抑制剂对问号钩体赖株诱导的J774A.1细胞凋亡有明显的阻断作用.结论:问号钩体可诱导J774A.1细胞凋亡,caspase-3和-6与该细胞凋亡密切相关.
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fliR基因与问号钩端螺旋体黏附及损伤细胞功能相关性的研究
目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)fliR基因的致病性.方法:分别从问号钩体黄疸出血群56601株DNA和pET42a质粒中扩增fliR基因和kana基因.构建fliR基因自杀质粒,并设计和合成特异性siRNA.采用分别基于自杀质粒的基因敲除、基于siRNA的基因沉默技术构建问号钩体fliR基因突变株,并用PCR、测序、半定量RT-PCR进行鉴定.采用小鼠单核-巨噬细胞J774A.1黏附试验和流式细胞术,检测敲除fliR基因的问号钩体突变株56601fliR-Kana、siRNA阻断fliR基因的问号钩体突变株56601siRNA-R2株黏附细胞,及诱导细胞坏死或凋亡能力的变化.结果:所克隆的fliR基因与GenBank中相应基因的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%和100%,所克隆的kana基因核苷酸序列与pET42a图谱完全相同.56601fliR-Kana可在含氨苄青霉素和卡那霉素的EMJH培养基中生长,PCR和测序结果证实56601fliR-Kana株fliR基因中插入了kana基因.56601fliR-Kana株fliR基因mRNA水平明显下降(P<0.01),56601siRNA-R2株fliR基因mRNA水平也低于野生株(P<0.05).56601fliR-Kana和56601siRNA-R2黏附J774A.1细胞的能力基本消失,诱导J774A.1细胞坏死或凋亡的能力也明显减弱(P<0.01).结论:fliR基因是问号钩体毒力相关基因,其功能与问号钩体黏附细胞、诱导细胞凋亡或坏死密切相关.
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肺炎链球菌ciaH/R基因重组表达及CiaH/R与β-内酰胺类耐药相关性
目的:构建肺炎链球菌ciaH和ciaR基因的原核表达系统,探讨CiaH和CiaR封闭后细菌耐药性变化.方法:采用PCR扩增全长ciaH和ciaR基因,以常规基因工程技术建立其原核表达系统.采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rCiaH和rCiaR表达量.制备rCiaH和rCiaR兔抗血清及其IgG.检测IgG胞外或胞内封闭肺炎链球菌菌株CiaH和CiaR后,细菌对青霉素和头孢噻肟耐药性的变化.结果:与报道序列比较,所克隆的ciaH和ciaR基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%～100%和100%.所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-ciaH和E.coli BL21DE3pET42a-ciaR能高效表达目的重组蛋白rCiaH和rCiaR,其产量分别高达细菌总蛋白的33%和45%.rCiaH、rCiaR抗血清及其IgG免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶1、1∶1.CiaH-IgG胞外或胞内封闭CiaH、CiaR-IgG胞内封闭CiaR后,青霉素及头孢噻肟敏感菌株可出现对两种抗生素的耐药性,但对耐药菌株耐药性无明显影响.结论:成功地构建了肺炎链球菌ciaH/ciaR基因原核表达系统,为深入研究该TCS与耐药性关系奠定了基础.CiaH和CiaR均与肺炎链球菌对青霉素及头孢噻肟耐药性有关.
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问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定
目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别.方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位.采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组PⅢ.分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组PⅢ免疫杂交反应性.结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位.经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段.各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体PⅢ蛋白N端并有效表达.各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其Western Blot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定.结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位.共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位.差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象.
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基于问号钩端螺旋体rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2融合抗原的ELISAs建立及应用
目的:建立基于问号钩端螺旋体(简称钩体)rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2融合抗原的ELISAs,并应用于检测钩体病患者血清特异性IgG和IgM.方法:采用显微镜凝集试验(MAT),检测钩体病患者血清及rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清对我国问号钩体参考标准株的效价.分别以rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2、rLipL32/1、rLipL21和rOmpL1/2为包被抗原,建立检测血清特异性IgM和IgG的ELISAs,并用于检测107份MAT阳性钩体病患者血清标本.结果:MAT结果证实,66%(71/107)患者感染黄疸出血群问号钩体,rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清对我国15株问号钩体参考标准株的凝集效价为1∶20～1∶160.rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2、rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2抗原用于检测IgM的ELISA阳性率分别为89.7%、75.7%、85.1%和79.4%,用于检测IgG的ELISA阳性率分别为99.1%、99.1%、94.4%和86.0%.rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-IgM-ELISA检测阳性率高于其它3种检测IgM的ELISAs(P<0.05),rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-IgG-ELISA检测阳性率高于rOmpL1/2-IgG-ELISA(P<0.05),但与rLipL21-IgG-ELISA及rLipL32/1-IgG-ELISA接近(P>0.05).结论:rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-ELISAs可作为敏感、特异的通用型钩体病血清学早期诊断方法.
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问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞FasL/Fas表达上调及FasL/Fas相关细胞凋亡的研究
目的:了解FasL/Fas途径参与问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导细胞凋亡及其FasL/Fas表达水平变化.方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核-巨噬细胞J774A.1模型.采用DAPI染色法观察问号钩体56601株感染细胞凋亡的形态学特征,流式细胞术定量检测感染细胞的凋亡率及FasL中和抗体对细胞凋亡的阻断作用.PE标记抗小鼠FasL或Fas单克隆抗体染色法,观察问号钩体56601株感染细胞FasL/Fas表达情况.采用流式细胞术定量检测感染细胞的FasL/Fas表达水平.结果:问号钩体56601株感染J774A.1细胞4 h时,部分细胞出现染色质浓缩及边缘化现象;感染24 h时上述病变现象更加明显且有部分细胞核裂解.问号钩体56601株感染J774A.1细胞4 h和24 h的凋亡率分别为53.6%和64.31%.FasL中和抗体预处理细胞后,问号钩体56601株感染细胞4 h或24 h的凋亡率分别为10.27%和15.90%.J774A.1细胞被问号钩体56601株感染后4和24 h,FasL表达率分别从感染前的4.19%上升至21.69%和65.70%,Fas表达率分别从感染前的12.88%上升至91.96%和88.01%.结论:诱导细胞凋亡是问号钩体56601株损伤J774A.1细胞的重要机制.问号钩体可上调靶细胞FasL/Fas表达水平,并通过FasL/Fas途径诱导J774A.1细胞凋亡.
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空间流行病学研究中的贝叶斯统计方法
贝叶斯统计学通过构建分层贝叶斯模型,结合马尔科夫链-蒙特卡罗方法,可以有效地对包括小范围区域疾病分布图的描绘、疾病地理聚集性分析研究和疾病地理相关性研究在内的时空非独立数据进行分析.目前贝叶斯空间分析模型已发展成多类的分析方法,包括近年来充分发展和得到应用的BYM模型、联合随机模型、半参数贝叶斯统计及移动性均化模型等.同时,通过离差信息准则,开展了众多的模型比较分析;其中,以BYM模型和半参数模型中的MIX模型的优势较明显.随着进一步的深入研究,贝叶斯统计学在空间流行病学研究中发挥的空间将进一步增大.
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疑难输卵管间质部妊娠的诊治探讨
目的:探讨输卵管间质部妊娠(间质部妊娠)的诊断和治疗方法,旨在为临床诊治提供线索.方法:分析2004年1月至2007年6月收治的4例疑难间质部妊娠患者的临床资料.结果:4例患者术前均误诊且均未生育,其中位年龄为30岁,中位停经时间为48天,术前中位血hCG值为3245.5 IU/L.2例患者行腹腔镜检查后确诊为间质部妊娠,其中1例在腹腔镜监护下经宫颈吸刮术;1例吸刮术失败后改行腹腔镜下间质部切开取胚术.另2例患者行宫腔镜检查后确诊为间质部妊娠,并在宫腔镜直视下插管,在胚囊植床部位注入50 mg MTX进行局部化疗.4例患者术后血hCG平均13天降至正常,术后3个月B超检查子宫均恢复完整性.结论:可疑间质部妊娠应及早行腹腔镜(或宫腔镜)检查;腹腔镜监护下经宫颈吸刮术(或宫腔镜插管局部化疗),可为要求保留生育功能的间质部妊娠年轻患者提供有效的保守治疗方法.
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三聚氰胺及其同系物三聚氰酸的生物学效应和毒理学研究进展
三聚氰胺因为近的奶粉事件成为食品公共安全的焦点,所以针对三聚氰胺及其同系物三聚氰酸的生物学效应和毒理学研究作一综述,主要从理化性质、代谢、毒理机制,以及检测等方面进行总结.三聚氰胺和三聚氰酸本身的急性毒性作用很低,体内为惰性代谢,大部分以原型从尿液排出,大剂量应用时主要对肾脏产生毒性,产生结石,急性肾衰和结石相关的膀胱肿瘤,但同时可能对心脏等肾脏以外的器官产生毒性作用.它们的毒性具有对动物物种的选择性,相对于小鼠、猫和大鼠的肾脏毒性反应更大,而且在雄性动物更加明显.在检测上,HPLC/MS/MS正在成为主要的检测手段.尽管对这一类化合物的生物学效应和毒理学特性已有一定的理解,但仍然存在一些问题,比如,为何肾脏成为结晶产生的主要器官,对肾脏以外器官/系统的作用如何,体内同时存在的三聚氰胺及其同系物可能的累加和协同作用机制等等,亟待进一步从生理、病理、生化实验方面作出解答,为未来生物毒理研究和研制出解决措施提供科学依据.
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问号钩端螺旋体致病机制和新型疫苗及细菌耐药性研究进展
钩端螺旋体(简称钩体)病是重要的人兽共患传染病之一,但其致病机制至今不明,目前也无可预防所有问号钩体血清群、型感染的通用型疫苗.细菌耐药性一直是医学微生物学和传染病学关注的重大问题之一,近年发现二元信号传导系统(TCS)与某些细菌耐药性密切相关.根据近年国内外有关研究资料,文中就问号钩体致病物质及其作用机制、相关信号传导通路及其致病意义,以及TCS在肺炎链球菌对青霉素和头孢胺噻耐药性形成、结核分枝杆菌对异烟肼和乙胺丁醇耐药性影响的新研究进展进行简要介绍.
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内镜下逆行胰胆管造影诊断环状胰腺一例
环状胰腺是一种罕见的胰腺先天性疾病,患者多有腹痛、呕吐及其他消化道症状,大多数病例通过开腹探查诊断.我科近对一名疑似病例行ERCP检查后成功确诊.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
