浙江大学学报（医学版）杂志
Journal of Zhejiang University(Medical Sciences) 절강대학학보（의학판）
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甲基硝基亚硝基胍诱导的一种全核γH2AX染色的特性研究
目的:明确甲基硝基亚硝基胍(MNNG)诱导的全核γH2AX所代表的DNA损伤的性质.方法:利用免疫荧光方法观察人羊膜FL细胞中MNNG诱导的γH2AX焦点的形成,中性彗星实验检测DNA双链断裂的形成,碱性彗星实验检测DNA单链、双链及其他类型损伤.结果:MNNG在10 mg/L时能诱导一种特殊的全核染色,1 mg/L时能在一部分细胞中诱导这种全核染色,但作用比较微弱.在这类细胞中中性彗星实验不能检测到明显的DNA双链断裂的形成,而碱性彗星实验能显示有DNA损伤的存在.结论:尽管γH2AX焦点被认为是DNA双链断裂的特异性标志,这种全核染色可能代表着另外类型的DNA损伤.
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内源性组胺对大鼠戊四唑点燃癫痫诱发记忆障碍的作用
目的:研究大鼠戊四唑点燃癫痫诱发记忆障碍的发病机制,并探讨内源性组胺对此类记忆障碍的作用.方法:大鼠隔日腹腔注射亚惊厥剂量(35 mg/kg)的戊四唑,直至完全点燃.采用穿梭箱被动回避试验测定大鼠的记忆能力.化学荧光法测定脑内组胺含量.大鼠脑病理切片采用HE染色,在光学显微镜下计数海马完整神经元.结果:大鼠戊四唑点燃后记忆能力明显下降,表现为穿梭箱内被动回避反应潜时缩短,而腹腔内注射组胺前体物质组氨酸则阻断了被动回避反应潜时的缩短.戊四唑点燃后大鼠海马、丘脑和下丘脑组胺含量明显下降,同时点燃使海马CA1区和CA3区完整神经元数目分别减少至对照组的72.7%和78.9%.结论:戊四唑点燃癫痫可导致大鼠记忆能力下降,可能与癫痫造成的组胺能神经活性降低和海马神经元丢失有关.
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含RGD肽CP9修饰的聚乙烯亚胺复合物的理化特性及其转基因功能的研究
目的:构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽CP9修饰的聚乙烯亚胺(PEI),观察其理化特性和转基因功能.方法:通过琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸酯(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)]propionate,SPDP)将CP9偶联到PEI上,合成新型转基因载体CP9-PEI.用1H-NMR和FT-IR验证CP9的偶联;用凝胶电泳阻滞实验、电镜和粒径检测,观察CP9-PEI浓缩质粒DNA的能力以及浓缩质粒DNA后形成的转染颗粒形态和粒径;通过CP9-PEI在人肝癌细胞株HepG2中的转染实验来验证CP9对PEI的转染效率的影响;通过游离CP9肽的竞争抑制实验验证CP9-PEI的整合素靶向功能.结果:CP9成功偶联到PEI上;CP9-PEI能有效浓缩质粒DNA,形成的转染颗粒形态为圆形或类圆形,在N/P比为10时,粒径约为200nm.CP9-PEI的转染效率是PEI的2倍,游离CP9肽能抑制CP9-PEI的转染效率.结论:修饰了CP9的PEI能有效增加转染效率,具有整合素的靶向能力,是一种具有应用前景的转基因载体.
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IFN-γ与HIV-1gp120融合蛋白的表达及其免疫调节作用
目的:研究gamma干扰素(IFN-γ)对人类免疫缺陷病毒(HIV-1)gP120蛋白免疫小鼠后效果的调节作用.方法:利用分子生物学技术,构建表达中国流行株HIV-1gP120 N端片段基因的原核质粒pet44b-gp120,及共表达HIV-jgp120 N端片段基因与IFN-γ基因的原核质粒pet44b-gp 120/IFN-γ,在E.coli BL21(DE3)细胞中进行低温诱导蛋白表达,然后经纯化后免疫BALB/c小鼠.实验设皮下注射gP120/IFN-γ组、gP120组和PBS三组,以检测HIV-1gp120诱导的T细胞增殖能力,CTL杀伤作用以及Th1型细胞因子(IL-2,IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-4,IL-10)的表达情况.结果:通过PAGE和Western blot检测,证实上述两种蛋白在DE3细胞中得到表达.免疫学实验表明,针对HIV-1gp120的特异性T淋巴细胞增殖作用、特异性CTL杀伤作用,以及Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ表达在三组之间均有显著性差异(P＜0.05),gP120/IFN-γ组高于gp120组,gP120组高于PBS组(P＜0.05).反映体液免疫反应的Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达在三组之间没有显著性差异(P＞0.05).结论:协同应用IFN-γ基因可明显加强HIV-1gp120基因的细胞免疫反应.
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白细胞介素-1家族基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究
目的:探讨白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)家族基因多态性与子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)的相关性.方法:用聚合酶链式反应技术(PCR)及限制性片断长度多态性(RFLP),对138例EMs患者及100例对照者的IL-1β基因-511和+3953位点及IL-1RA基因进行分析.结果:EMs组IL-1β-511位点的基因型(C/C、C/T、T/T)频率和等位基因(C、T)频率,IL-1β+3953位点基因型(C/C、C/T)及等位基因(C、T)频率与对照组比较,差异均无显著性(P＞0.05).IL-1RA基因型A1/A1、A1/A2、A1/A4、A2/A2频率在EMs组和对照组分别为84.1%、12.3%、2.9%、0.7%和95%、4%、1%、0%,两组比较P=0.042;A1、A2、A4等位基因频率在两组间分别为91.7%、6.9%、1.4%和97.5%、2%、0.5%,两者比较均具有显著性差异(P=0.019).A1/A2基因型个体患EMs的危险性是野生型A1/A1纯合子的3.48倍(95%CI:1.13～10.69),携带A2等位基因者患EMs的危险性是携带A1等位基因的3.66倍(95%CI:1.23～10.94).结论:IL-1β-511及+3953位点的基因多态性与中国浙江籍汉族EMs患者的遗传易感性无关联,而IL-IRA基因的A2型等位基因可能是EMs的易感因素之一.
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浙江省学龄前儿童血铅水平的历史对照研究
目的:了解浙江省学龄前儿童1997年与2003年6年前后血铅水平状况.方法:2003年采用整群抽样的方法对本省学龄前儿童进行血铅水平调查,并与1997年比较.采用石墨炉无火焰原子吸收光谱法测定血铅浓度.结果:2003年2 013名学前儿童的血铅平均值为(0.34±0.13)μmol/L,与1997年(0.35±0.26)μmol/L相似(P＞0.05);2003年血铅浓度≥0.483μmol/L的儿童共274人,铅中毒发生率为13.61%,低于1997年的调查结果(血铅浓度≥0.483μmol/L的儿童共448人,铅中毒发生率为23.84%).2003年杭州市、上虞市、舟山市、常山县铅中毒发生率分别为7.69%、15.37%、10.87%、20.15%,经统计学分析各地区间有显著性差异(P＜0.01).与1997年结果比较杭州和上虞两市儿童铅中毒发生率明显下降(P＜0.01);舟山无显著性差异;而常山县儿童的血铅水平有明显增高(P＜0.01).4～6岁儿童血铅水平仍高于其他年龄组儿童.结论:浙江省学前儿童铅中毒率明显下降,但铅负荷状况仍不容乐观,特别是边远山区和海岛的铅污染问题应引起有关部门的重视.
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枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响
目的:研究枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表型及功能成熟的影响.方法:小鼠骨髓细胞用GM-CSF和IL-4培养5 d,然后用免疫磁珠法纯化DC细胞,实验组加入枸杞多糖(100μg/ml),空白对照组加等量RPMI1640,阳性对照组加LPS(100ng/ml),3组分别同时作用48 h.流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力,ELISA检测产生的细胞因子IL-12,混合淋巴细胞反应检测细胞提呈抗原的能力.结果:用枸杞多糖刺激的小鼠骨髓DC表达I-A/I-E、CD11c和分泌IL-12能力比空白对照组增加,吞噬FITC-dextran的能力下降,并可促进同种异基因T细胞的增殖.结论:枸杞多糖可以促进体外培养的小鼠骨髓DC的成熟,促进DC诱导的免疫应答启动.
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短干扰RNA特异性抑制哺乳动物β淀粉样前体蛋白裂解酶基因表达
目的:探讨β淀粉样前体蛋白裂解酶(p-site APP cleaving enzyme,BACE)的短干扰RNA(shorr interfering RNAs,siRNA)是否能抑制BACE在哺乳动物细胞中的表达,为阿尔茨海默病(AD)的治疗提供新的手段.方法:采用PCR分别扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、U6启动子和靶向BACE的特异性小干扰RNA(siBACE),随后将相应的序列片段克隆入真核表达载体pLXSN,通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE进行鉴定;制备稳定高表达BACE基因的神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株,用荧光显微镜和免疫组织化学的方法观察siRNA对BACE表达的影响.结果:成功构建了靶向BACE的短干扰RNA的逆转录病毒载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE,并能特异性地抑制BACE在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株中的表达.结论:成功构建了针对BACE的短干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE,并能有效抑制哺乳动物BACE基因的表达,为利用RNA干扰技术作为治疗AD的新方法提供了重要的实验基础.
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微透析探针在体透析时间对氨基酸回收率的影响
目的:探讨在体透析不同时间后微透析探针的氨基酸体外回收率的变化.方法:采用微透析系统对使用前后的探针进行氨基酸标准液的体外透析,氨基酸标准液和探针透析液则用柱前衍生法配合高效液相色谱荧光检测器进行检测.结果:用再生纤维素膜制作的微透析探针在使用不同时间之后,天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)体外回收率不完全相同(Asp:F=19.669,P=0.000;Glu:F=103.955,P=0.000;GABA:F=3.454,P=0.040);牛磺酸(Tau)无显著性差异(F=2.001,P=0.152).在使用6 h后,Asp、Glu、Tau和GABA的回收率剩余百分率(RRP)分别为64.34%、67.36%、103.11%和98.23%,其中Asp、Glu有显著性下降(Asp:P＜0.01,Glu:P＜0.05).在使用12 h后,Asp、Glu、Tau和GABA的RRP分别为43.44%、24.42%、77.45%和67.36%,Asp、Glu和GABA有显著性下降(Asp:P＜0.001,Glu:P＜0.001,GABA:P＜0.05).在使用24 h后,Asp、Glu、GABA的RRP分别为36.26%、12.24%、89.48%和71.35%,Asp、Glu和GABA有显著性下降(Asp:P＜0.0001,Glu:P＜0.0001,GABA:P＜0.05).结论:在体透析可引起氨基酸回收率的下降,透析时间越长,回收率下降越大.故在进行脑微透析实验时,探针的在体使用时间不宜过长;为了提高所得数据的可靠性,应对探针的回收率进行适当校正.
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人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化
目的:研究具有生物学活性的人防御素2(HBD2)多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术.方法:PCR扩增不合前导序列的HBD2成熟肽的编码框全长的cDNA片段(smHBD2-cDNA),利用BglⅡ和BamH Ⅰ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD2-cDNA的克隆载体,利用Ncol Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶构建融合表达载体pET32-nsmHBD2-cDNA,在大肠杆菌中BL21(DE3)中诱导表达含HBD2的融合蛋白,SDS-PAGE分析产量.可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD2多肽.采用液体培养法,测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性.结果:构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD2-cDNA表达载体,1、2和4倍smHBD2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52%、48%和31%;而8倍HBD2-cDNA几乎不合可溶蛋白,目标蛋白以包含体形式表达,集中在不可溶部分.重组HBD2对E.coli K12 D31有较强的抑制作用,在终浓度约为0.4至0.5μg/ml时,90%细胞的生长被抑制.结论:采用融合表达、多拷贝串联表达方式,可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用,也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性;适当的多拷贝串联基因可以提高HBD2的产量,但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量,且易形成不溶蛋白;在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD2多肽的原核高效表达.
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重组β-防御素2在脓毒症所致大鼠急性肺损伤发生发展中的作用
目的:探讨重组β-防御素2(BD2)对脓毒症所致大鼠急性肺损伤的保护作用以及对预后的改善.方法:SD大鼠36只随机分为对照组及实验组,每组各18只,分别予以气管滴注对照腺病毒载体(Ad-V,107PFU/m1)及可表达大鼠β-防御素2(rBD2)的腺病毒载体(Ad rBD2,107PFU/m1)各100μl.48 h后行盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型;复制此模型后36h处死大鼠(n=12,实验组、对照组各6只),行腹腔灌洗液细菌计数、肺组织常规病理切片观察以及大鼠生存率分析(n=24,Ad-V组、Ad-rBD2组各12只).结果:与对照组(Ad-V组)比较,实验组(Ad-rBD2组)肺组织损伤程度减轻,生存率明显提高(P＜0.05),腹腔灌洗液细菌计数无明显差别.结论:在体内表达的重组β-防御素2可明显改善脓毒症所致的急性肺损伤的肺部病变及其预后.
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β-防御素2基因腺病毒表达载体的构建与真核表达
目的:探讨重组腺病毒载体在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽--β-防御素2的可行性.方法:采用RT-PCR方法扩增得到大鼠β-防御素2(rBD2)基因片段,定向插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,重组质粒pShuttle-CMV-rBD2转化E.coli BJ5183-AD-1后,与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1发生同源重组,重组质粒pAdEasy-rBD2转染293细胞进行腺病毒表达载体的包装.将包装成功的腺病毒感染COS-7细胞,并建立SD大鼠腺病毒感染模型,进行β-防御素2多肽的体外和体内表达,采用Western blot与免疫组化方法检测其表达.结果:重组腺病毒表达载体构建成功,包含大鼠β-防御素2基因,滴度达到109PFU/ml,Western blot与免疫组化方法分别检测到β-防御素2在SD大鼠体外、体内的表达.结论:重组腺病毒载体能在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽--β-防御素2.
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重组β-防御素2多肽对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡的影响
目的:观察重组β-防御素2多肽预处理对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡的影响.方法:SPF级SD大鼠48只随机分成对照组和防御素组,采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症模型,防御素组在CLP前48h经气管插管气道滴注107PFU重组腺病毒(含有β-防御素2编码基因),而对照组则同法给予对照腺病毒(不含β-防御素2编码基因).分别于CLP后0、12、36和72 h处死大鼠,取肺组织,采用透射电镜,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,采用电镜、苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理变化.结果:TUNEL检测显示,对照组大鼠CLP后12、36和72 h肺组织细胞凋亡指数显著增加(P＜0.01);与对照组相比,防御素组CLP后相应时间点肺组织细胞凋亡指数显著降低(P＜0.05).HE染色可见,两组大鼠CLP后12、36和72 h肺泡及肺泡间质充血、水肿,炎症细胞渗出,肺泡腔不同程度狭窄.与对照组相比较,防御素组相应时间点肺组织内炎症细胞渗出减少,间质水肿减轻.结论:重组β-防御素2多肽预处理能抑制脓毒症肺组织的细胞凋亡,对急性肺损伤(ALI)具有保护作用.
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白细胞介素-10对人外周血白细胞β-防御素2基因诱导性表达的影响
目的:探讨炎症抑制因子白细胞介素-10(白介素-10)在β-防御素2(hBD-2)基因诱导性表达中的作用.方法:22例健康人被纳入本研究中,以终浓度0 ng/ml的LPS、100ng/ml的LPS、10ng/ml的IL-10、100ng/ml的LPS+10 ng/ml的IL-10加入900μl人外周血中,于37℃刺激培养6 h后,提取外周血白细胞总RNA,用实时定量RT-PCR的方法测定外周血白细胞hBD 2mRNA的表达水平.结果:0 ng/ml的LPS或10 ng/ml的IL-10刺激6 h的白细胞中未检测到hBD-2 mRNA,100 ng/m1的LPS刺激6 h后hBD-2mRNA的表达水平为166.9±35.14,而IL-10与LPS共同刺激6 h后hBD-2 mRNA的表达水平为30.40±9.18.IL-10使hBD-2mRNA的诱导性表达水平明显降低(P＜0.05).结论:人外周血白细胞中hBD-2基因呈现诱导性表达,IL-10能下调hBD-2的诱导性表达.
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银屑病发病机制的研究进展
银屑病发病机制的研究因转基因小鼠的应用近取得了较大的进展.K14-VEGF(血管内皮生长因子)转基因鼠皮肤血管增生及其炎症、异常的表皮增生和分化与人银屑病相似.单核苷酸多态性(SNPs)研究发现,VEGF基因+405C/C基因型和+405C等位基因频率显著增高,个体血管遗传组成可能决定银屑病的易感性.K5.STAT3C(信号传导与转录活化因子3)小鼠自发产生银屑病损害的全部特征,STAT3在活化的角质形成细胞和免疫细胞之间提供了重要的联接,二者相互依赖参与银屑病的发病.另外,表皮Jun蛋白缺失也可导致银屑病和银屑病性关节炎.这些进展为进一步阐明银屑病的发病机制和研究新的治疗方法提供了实验依据.
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脑内肥大细胞在多发性硬化和Wernicke脑病中的作用
肥大细胞作为机体固有免疫系统的一种多功能效应细胞,它在免疫反应等病理和生理过程中的作用已研究得较深入,但是,对于它在中枢神经系统疾病中的作用了解得仍较少.近年研究发现,肥大细胞是多发性硬化以及Wernicke脑病发生、发展过程中的重要因素.多发性硬化是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特征的慢性疾病,而Wernicke脑病是与物质代谢紊乱有关的疾病.肥大细胞可能通过其释放的介质,促进神经损伤,加快病程并加重病情.深入研究肥大细胞与这两种疾病的内在关系,并进一步研发针对疾病过程中肥大细胞的药物,将为它们的诊治提供新的方向.
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生物可分解吻合环在肠吻合中的应用
目的:比较在肠吻合术中生物可分解吻合环(biofragmentable anastomosis ring,BAR)与常规手工缝合以及线形吻合器应用的方法和效果,评价BAR在肠吻合手术中应用的意义.方法:将2000年1月至2005年11月收治的498例肠吻合术病例,分为BAR组186例,手工缝合组177例,线形吻合器组135例.分别记录手术时间、术后肠道功能恢复时间以及吻合相关的并发症.术后随访观察吻合口炎症、狭窄发生情况.结果:BAR组手术时间(102±16)min;手工缝合组(121±15)min;线形吻合器组(105±18)min.3组间差异显著(P＜0.05),BAR组和线形吻合器组手术时间明显少于手工缝合组.BAR组发生吻合口漏1例;手工缝合组发生1例;线形吻合器组未发生;通过保守治疗均治愈.BAR组发生梗阻1例,线形吻合器组发生1例,两者通过保守治疗均治愈;手工缝合组发生2例,1例保守治疗无效需要手术.以上3组之间差异无显著性.未发生其他与吻合有关的并发症.术后肛门排气时间:BAR组(67.2±4.6)h;手工缝合组(70.2±5.8)h,线形吻合器组(63.2±6.2)h,以上3组之间差异无显著性(P＞0.05).肠镜随访436例,观察术后吻合口炎症发生率:BAR组3.0%(5/164),手工缝合组47.8%(76/159),线形吻合器组7.1%(8/113),3组间差异显著(P＜0.05),BAR组和线形吻合器组吻合口炎症发生率明显少于手工缝合组.结论:生物可分解吻合环是一种快速、安全、有效的无线肠道吻合方法,减少了手工缝合引起吻合口炎症的发生,可作为传统手工缝合和线形吻合器等同选择的方法.
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经胸超声指引下经导管关闭儿童膜周部室间隔缺损
目的:探讨儿童膜周部室间隔缺损(ventricular septal defects,VSD)经导管介入治疗的安全性和临床疗效.方法:2002年9月至2005年12月,共89例膜周部室间隔缺损患儿接受了经导管介入治疗.男47例,女42例;平均年龄(6.4±3.9)岁(1～18岁),体重(22±11)kg(9～78 kg).其中l例合并动脉导管未闭,6例为外科术后VSD残余瘘(3例为法洛四联症术后VSD残余瘘,3例为VSD术后残余瘘).经胸超声心动图(transthoracic echocardiography,TTE)提示,VSD的平均直径(4.3±1.5)mm(2～8.5 mm).所有患儿在X线透视及经胸超声监测下通过建立股动静脉轨道,经右心系统释放封堵器,并分别于术后1、3、6、12个月进行超声心动图、心电图、X线片随访评价.结果:85例患儿封堵器置入成功,技术成功率为95.5%.无死亡病例.术后即刻超声及造影显示,微量残余分流12例,9例微量残余分流于术后24h复查超声时消失,3例微量残余分流于术后6个月复查超声时消失.1例发生严重心律失常致抽搐,2例发生溶血,2例完全性左束支传导阻滞,1例左前分支传导阻滞,3例不完全性右束支传导阻滞.经激素治疗3～7d后均恢复正常.患儿接受了平均9个月的随访(1～36个月),随访中无封堵器移位,无瓣膜损伤等并发症.结论:经导管介入方法关闭儿童膜周部室间隔缺损具有较高的安全性,近期效果良好.经胸超声心动图在指引小儿VSD介入封堵中可避免全身麻醉和气管插管,缩短手术时间,是完全可行和安全的.
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β-防御素2研究进展
防御素是一类分子量约为4.0～5.0 kMr、含有6个半胱氨酸残基、三对二硫键的阳离子多肽.防御素不仅通过直接杀菌作用抵御入侵机体的病原微生物,还在介导获得性免疫反应、调节机体的免疫炎症反应和创伤修复过程中起着重要作用.β-防御素2是人体中第一个被发现的可诱导性防御素,因此,β-防御素2的基因表达调控、生物学活性、与皮肤/肺部疾病发生发展相关性等方面的研究较为深入.采用重组DNA技术从原核表达体系、真核表达体系中获取具有生物学活性的β-防御素2多肽,并研究其在呼吸道细菌感染、脓毒症所致肺损伤/肺功能障碍发生发展中的保护作用,将有助于阐明β-防御素2在免疫相关疾病中的作用,有助于阐述肺损伤/呼吸功能障碍发生发展的机制与防治.
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支架辅助的经皮腔内血管成型术治疗颅内段椎动脉狭窄二例
颅内椎基底动脉狭窄的预后很差,有很高的死亡率和致残率[1].回顾性的研究数据提示,即使在使用抗凝或者抗血小板药物的情况下,症状性的颅内段椎动脉和基底动脉狭窄患者的年卒中发生率分别是7.8%和10.7%[2],因此,颅内椎基底动脉狭窄必须得到积极治疗.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
