病毒学报杂志
Chinese Journal of Virology 병독학보
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cmv-3′LTR嵌合启动子对逆转录病毒载体MFG滴度及外源基因表达的影响
为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默,进一步提高逆转录病毒载体MFG介导的外源基因的表达水平,同时探讨逆转录病毒3′端长末端重复序列(long-terminal repeat,LTR)内U3区对病毒基因表达的影响,将逆转录病毒载体3′端LTR内的U3区用cmv核心增强子、启动子序列替代,同时去除了3个与逆转录病毒载体启动子甲基化有关的序列NCR、DR,并以egfp为报告基因,构建了MFG-egfp和MFG-egfp-cmv表达载体.结果显示:利用cmv启动子替代MFG载体3′端LTR的U3启动子序列,会显著降低MFG载体的病毒滴度及其介导的外源报告基因的表达.提示利用cmv启动子替代病毒载体的3′端LTR内的U3区,并不是提高MoMLV(moloney murine leukemi virus)逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略.结果也同时提示:在MoMLV逆转录病毒3′端LTR的U3区,可能存在与病毒RNA加工、成熟及稳定性有关的信号序列.
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一种携带人α1bIFN的单纯疱疹病毒载体的构建
为研究用单纯疱疹病毒作为表达细胞因子载体的生物重要性,构建了一种表达人α1b干扰素(IFN)的新型单纯疱疹病毒载体.基于一组含有完整单纯疱疹病毒全基因组的粘粒,α1b IFN表达盒插入到cosmid6上HSV1的UL2基因中,生成cos6-αIFN△UL2.通过将cos6-αIFN/△UL2与cosmid28、cosmid14、cosmid56和cosmid48共转染BHK-21细胞,同源重组产生重组病毒HSV1-αIFN/△UL2.在体外用标准VSV空斑抑制试验检测重组毒感染细胞上清α1b IFN的表达.证实HSV1-αIFN/△UL2感染的细胞中表达的人α1bIFN是有生物活性的.MOI＝10感染时,24h后产生2.8×104IU/ml.而对照病毒感染时,这些细胞并不分泌可以检测到的α1bIFN.鉴于HSV1载体的嗜神经性,该载体对于分析体内神经系统局部表达的IFN的抗病毒能力是有用的.
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去除致癌基因的EB病毒潜伏膜蛋白1的重组腺病毒的构建及其免疫效果
为进一步研究利用EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)进行免疫治疗的可行性,构建了含有去除致癌基因的EB病毒LMP1片段(LMP1△)的穿梭质粒pAdTrack-CMV-LMP1△,将它与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电转染的方法共同导入大肠杆菌BJ5183中,在宿主菌重组酶的介导下进行同源重组.通过抗性筛选,获得含有重组腺病毒基因的质粒;然后再通过脂质体将重组腺病毒质粒导入腺病毒包装细胞HEK293细胞中,在HEK293细胞E1蛋白的反式作用下,病毒被包装.将包装病毒的细胞裂解上清进行PCR鉴定证实,病毒DNA中含有目的基因的特异性片段.RT-PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录,免疫酶和Western blot的结果也显示,LMP1△蛋白在真核细胞得到表达.将扩增后的病毒感染HeLa细胞,测定病毒滴度为3.0×109PFU/ml.为初步探讨其免疫效果,采用肌肉注射和滴鼻的方式感染Balb/c纯系小鼠,免疫酶检测其特异性抗体,LDH法检测特异性CTL的杀伤作用,结果发现,两种免疫途径均可诱发小鼠针对LMP1的特异性体液免疫和细胞免疫,而且Ad5作为免疫对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应.
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冠状病毒是引起广州地区严重急性呼吸综合征(SARS)的主要病因
为查找引起广州地区流行的严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体,采集患者漱口液及尸解标本,用组织培养法接种人胚肺细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和鸡胚分离病毒,用间接免疫荧光法检测患者恢复期血清IgG抗体,确定分离的病原是SARS的主要病因,再用套式RT-PCR、免疫电镜法鉴定病原.结果用人胚肺、Hep-2细胞在75份漱口液和3例尸解组织中分离出13株病原体,经套式RT-PCR扩增出110bp的特异产物,经测序证实为冠状病毒.制备冠状病毒的抗原,检测30份SARS病人恢复期血,其中26份血清IgG抗体阳性.同时检测30份普通发热病人血清作对照,IgG抗体全部阴性.由此证明,经组织培养分离到的病原体是引起SARS的致病因子,用分子生物学方法测序后证实为冠状病毒.
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严重急性呼吸综合征(SARS)病人血清抗体水平的初步探讨
为了了解严重急性呼吸综合征(SARS)病人血清中的抗体产生规律,对56份病人血清和36份健康人血清,分别采用间接酶联免疫吸附试验(EIA)检测IgG抗体和捕获法检测IgM抗体.结果显示:56份病人血清中有48份IgG抗体阳性,7份IgM抗体阳性.
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流行性乙型脑炎病毒GSS株prM、E和NS1蛋白基因的克隆及在非复制型痘苗病毒中的表达
克隆流行性乙型脑炎(乙脑)病毒野毒(JEV)GSS株前膜蛋白信号序列、前膜蛋白(prM)、包膜蛋白(E)、非结构蛋白-1(NS1)和非结构蛋白NS2a的编码基因,并与非复制型痘苗病毒载体NTV进行同源重组,构建了乙脑病毒非复制型重组痘苗病毒疫苗株NTVA(E/L)JEV.通过PCR和Southern blot检测证明,在非复制型痘苗病毒中有乙脑病毒prM信号序列、prM、E、NS1和NS2a基因的插入:Western blot检测证明,重组病毒可以在细胞内成功地表达prM、E和NS1蛋白,并可将prM、E和NS1蛋白分泌到细胞培养上清中;免疫荧光检测证明,E和NS1蛋白主要分布在细胞膜上.电镜下可见分泌到细胞外的病毒样颗粒.
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严重急性呼吸综合征(SARS)患者不同组织中冠状病毒的分离和鉴定
严重急性呼吸综合征(SARS)自2002年11月在中国广东爆发后,已迅速蔓延成为全球性传染疾患.为了了解SARS冠状病毒的特征,对先前SARS冠状病毒PCR检测呈阳性的来自广东的3份尸检肺组织标本、2份尸检脾组织标本,来自北京的2份咽拭子标本和1份血清标本,利用10种不同的细胞系分离病毒.结果显示,上述标本在感染细胞后,分别可在293、Vero-E6、Vero、RD和HeLa细胞系中产生细胞病变(CPE).不同标本在上述细胞系中致CPE的能力不同,但CPE出现的时间和病变形态学特征无显著性差异.以恢复期SARS病人血清为抗体,用间接免疫荧光法对感染后细胞培养的检测,冠状病毒RT-PCR对感染后细胞RNA的检测,初步证明分离的病毒为冠状病毒.结果再次证明冠状病毒为SARS的病原,它具有较广泛的器官分布和细胞感染能力.血清中SARS冠状病毒的分离,高度提示在SARS发病过程中存在有病毒血症.
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戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体的鉴定
阻断实验发现,用戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白重组抗原制备的8株抗HEV单克隆抗体(mAb),分别识别3个构象表位和2个线性表位.用抗体捕获反转录PCR方法证实,其中识别2个构象表位的3个mAb可以直接捕获HEV颗粒,表明这2个表位位于HEV颗粒的外表面.识别这两个表位的mAb8C11和8H3均可中和HEV对恒河猴的致病性和感染性.mAb8C11缩短排毒时间的效应较明显,而mAb8H3延迟机体抗HEV抗体阳转时间的效应较明显.二者的中和效应具有较明显的协同作用.中和单抗8C11、8H3对戊肝不同感染时期的血清均有显著阻断作用,Fab片段的阻断作用与完整抗体类似,表明这两个mAb对应的中和表位是HEV体液免疫应答的优势表位.
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表达HIV多价抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫效果研究
为了构建适用于中国的HIV候选疫苗,利用痘苗病毒天坛株表达中国HIV-1主要流行毒株CN54的gagpolΔ和gp140TM基因.实验结果显示,重组痘苗病毒能正确表达Gag和gp140TM蛋白.获得的重组痘苗病毒与DNA疫苗、重组腺病毒联合免疫Balb/c小鼠,并检测不同免疫程序在小鼠中诱导的细胞和体液免疫.免疫实验表明,DNA疫苗初始免疫,重组腺病毒与重组痘苗病毒依次加强所诱导的CTL应答、T淋巴细胞增殖以及中和抗体均高于其他免疫方案.DNA疫苗与两种活载体疫苗的联合运用,在小动物模型中取得了较好的免疫效果,这将为艾滋病疫苗的研究增加新的免疫策略.
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EBV LMP1通过诱导c-myc表达活化端粒酶hTERT
利用原代人胚鼻咽上皮细胞和Tet-on-LMP1 HNE2等良好的细胞体系,采用报道基因法和Western blot法等,分别检测Epstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)诱导的c-myc反式激活活性和蛋白表达水平,从LMP1诱导细胞内c-myc表达的角度,探讨LMP1诱导端粒酶表达的分子机制.结果表明,LMP1促使细胞内c-myc反式激活活性增强,c-Myc蛋白表达量升高;导入反义LMP1表达质粒阻断LMP1表达后,c-myc反式激活活性下降.将端粒酶hTERT启动子上c-myc结合位点突变后,LMP1不能诱导端粒酶hTERT表达.因而认为,EB病毒LMP1通过诱导c-myc表达而活化端粒酶hTERT.
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猪瘟病毒p80基因NTPase/RNA解旋酶功能区在E.coli中的表达
采用PCR技术扩增出猪瘟病毒GXYL株和C株p80基因的NTPase/RNA解旋酶功能区(sGXNS3和sCNS3),将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-sGXNS3和pET-sCNS3.PCR、酶切和序列分析鉴定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确.1.0mmol/L IPTG诱导得到分子量为26kD的目的蛋白,Western blot检测表明,表达的目的蛋白能被CSFV阳性血清识别.
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乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达
拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达.实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2+S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞KM71,G418筛选多拷贝整合克隆,经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物.经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4.该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS-PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量高,表达产物单体分子量为31kD左右.用美国雅培公司AUZYME MONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg/100 OD600细胞.上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2+S基因在本系统中获得了分泌表达.同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外.以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中.
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犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用
根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物.在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180s,96℃30s,56℃30s,72℃80s,30个循环.联合PCR结果显示:CAV-1扩增片段大小为497bp,CAV-2为1 019bp,CPV为719bp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带.上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同.敏感性比较试验结果表明,联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感.将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA/HI试验.以上结果说明:CAV-1/CAV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2.5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒,因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值.
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EB病毒LMP1 CTAR1、CTAR2的表达促使人鼻咽癌细胞HNE2增殖
探讨EB病毒LMP1不同结构域在鼻咽癌中的致瘤作用,为阐明鼻咽癌分子发病机理,寻找治疗鼻咽癌的分子靶提供实验依据.以转染空白载体为对照,利用电穿孔转染方法,建立稳定表达LMP1不同突变体的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1(1～815)、HNE2-LMP1(1～231)、HNE2-LMP1△187～351,并以这些细胞系为材料,用MTT法检测增殖期活细胞,BrdU掺入法检测细胞增殖状况,比较各组细胞的软琼脂集落形成率和裸鼠成瘤能力,以观察LMP1不同的结构域对鼻咽癌细胞生长的影响.LMP1(1～231)和LMP1△187～351在体外明显促进HNE2细胞增殖,HNE2-LMP1(1～231)、HNE2-LMP1△187～351平均吸光度(A)比值、BrdU掺入率、软琼脂集落形成率均高于HNE2-pSG5与HNE2(P＜0.01),而HNE2-LMP1(1～187)与HNE2-pSG5、HNE2相比,这些指标无明显差别.HNE2-LMP1△187～351和HNE2-LMP1(1～231)的裸鼠成瘤潜伏期、倍增时间与平均瘤重明显高于HNE2-pSG5鼻咽癌细胞系,其差异有显著的统计学意义(P＜0.05).而HNE2-LMP1(1～187)、HNE2-pSG5和HNE2鼻咽癌细胞系在潜伏期、倍增时间与平均瘤重方面两两比较,差异无显著的统计学意义(P＞0.05).EB病毒LMP1 CTAR1和CTAR2对HNE2细胞生长有明显促进作用,提示EB病毒LMP1可能在鼻咽癌的发生发展中起着重要的作用.
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采用基因芯片检出一例丙型肝炎病毒3b基因亚型的报告
研究表明,感染HCV的严重性与所感染的HCV基因型有一定的关系,并且不同的HCV基因型对干扰素治疗有不同的影响.HCV的基因分型目前缺乏统一的分类和命名方法.Chan等对5′NCR进行基因树分析,将HCV分为1、2、3三个主要的基因型[1],随后通过对C、NS3、NS5区段的分析指出,每种基因型均由两到三种基因亚型组成,并将其命名为1a、1b、2a等[2,3].Simmonds等[4]分离出HCV的基因型4,并发展了Chan的命名方法[5].同时Houghton等[6]将1a和1b分别命名为基因型Ⅰ和Ⅱ;Enomoto等[7]将2a和2b命名为基因型Ⅲ; Cha等[8]将3命名为基因型Ⅳ,并将以前在南非发现的一组HCV命名为基因型V.Okamoto等[9]和Mori等[10]将基因型2分为基因型Ⅲ和Ⅳ,基因型3分为基因型Ⅴ和Ⅵ.为了避免混淆,本文中采用Chan和Simmonds的命名方法.HCV的基因分型方法主要包括基因组或基因组的部分序列测序分析,型特异性引物PCR扩增(type-specific primers PCR)[9],限制性内切酶长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)[4],线性探针法(line probe assay,LiPA)[7,11],以及Livache等[12]和Bidan等[13]采用的吡咯阵列传感器芯片的HCV基因分型方法.
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严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒刺突蛋白基因片段的表达及其初步应用
严重急性呼吸综合征(SARS)病毒为冠状病毒科.该病毒主要引起以破坏呼吸道肺上皮细胞为主的全身性疾病,引发免疫抑制和全身感染.同时,SARS病毒感染与全身血管病变有关.目前,在我国SARS感染后的免疫学诊断尚无完善的方法,细胞培养的抗原面临纯化困难和操作的危险性.我们利用基因重组的方法,表达了SARS冠状病毒S1蛋白的C端部分,此区域包含主要中和抗原位点[1].利用原核表达系统快速高效的特点,可以迅速表达重要的新病原活性蛋白,为进一步建立特异性诊断方法、疫苗动物试验、中和抗体诱导、基因工程疫苗的研制提供实验手段和依据.同时也为疫苗研究提供了新的战略思路.
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严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒抗体的检测及其临床意义
自2002年底出现的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)严重影响全球经济,危害着人民的健康.2003年4月16日,WHO确定一种新型冠状病毒为SARS的病因[1-3].随着对SARS病因的确认以及全球特别是中国的SARS疫情发展,困扰广大医学工作者的突出问题是SARS的防治,包括预防性疫苗的研制及SARS的病原学早期诊断.WHO相应地公布了SARS的实验室诊断标准[4].为明了SARS冠状病毒特异性抗体产生的规律及其临床意义,以进一步了解SARS病毒感染免疫的特点,采用中国军事医学科学院研制的SARS病毒IgG/IgM抗体检测试剂,对深圳东湖医院收治的SARS患者的系列血清进行了抗体检测,现将结果简报如下.
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严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒N蛋白基因的表达及其初步应用
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)的病原是SARS冠状病毒[1],该病毒引起以呼吸道肺上皮细胞损害为主的全身性疾病,引发免疫抑制而造成全身感染.同时,SARS病毒感染导致全身血管病变,是一种传染性很强的新病原.目前,在我国SARS感染后的免疫学诊断尚无完善的方法,细胞培养的抗原面临纯化困难和操作的危险性.我们利用基因重组的方法,在大肠杆菌中表达了SARS冠状病毒N蛋白全长基因,为进一步建立特异性诊断方法、基因工程疫苗的研制提供了备选实验材料.
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风疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白基因的表达分析
风疹病毒(rubella virus,RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员.通常RV感染症状较轻,表现为急性、轻型、病程短、自限性出疹性疾病.RV对公众健康的大威胁是它的致畸特性.妇女妊娠期,尤其是前3个月感染RV可导致新生儿产生一系列的器官畸形,称为先天性风疹综合征(CRS)[1].
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肠道病毒71型的研究进展
肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员,其感染主要引起患者手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD).通常情况下,EV71感染引起的HFMD在临床症状等方面与柯萨奇病毒A16(Coxsackie A16,CA16)引起的手足口病难以区别,但EV71感染除了引起HFMD以外,还能够引起无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)、脑干脑炎(brainstem encephalitis)和脊髓灰质炎样的麻痹(poliomyelitis-like paralysis)等多种与神经系统相关的疾病[1].自1974年首次报道[2]以来,EV71已在世界范围内引起十多次爆发与流行[3-6].近年来,EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势[7-9].根据病毒衣壳蛋白VP1核苷酸序列的差异,可将EV71分为A、B、C 3个基因型,其中,B型和C型又进一步分为B1、B2、B3、B4以及C1和C2亚型[10-12].
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基因芯片技术在病毒学研究中的应用现状
随着科学技术的迅猛发展,生命科学研究正由结构基因组时代逐渐转向功能基因组时代.到目前为止,已有600多株病毒、100多种细菌和真菌的全基因组被破译,人类和多种动植物基因组计划也相继完成.现有的大量的基因组信息为研究不同基因在生命过程中所扮演的角色提供了可能.但是由于传统的技术已不能适应处理如此巨大信息的需要,建立新型研究分析方法显得尤为迫切.被美国科学促进会列为1998年度自然科学领域十大进展之一的基因芯片技术正是在这种需求下得到了飞速发展.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 |
| 2003 | 01 02 03 04 |
| 2002 | 01 02 03 04 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
| 1999 | 04 |
