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线粒体DNA变异与肿瘤的相关性研究进展
肿瘤的发生发展是一个较为复杂的生物学过程,其中线粒体在肿瘤细胞代谢过程中扮演重要角色.线粒体DNA(mito?chondrial DNA,mtDNA)变异包括点突变、缺失、插入以及拷贝数变异等,这些变异可能参与肿瘤细胞的增殖、生长、侵袭和转移.本文就mtDNA突变、拷贝数改变、mtDNA与核基因(nuclear DNA,nDNA)的比值,以及mtDNA变异与肿瘤发生发展的相关性研究及临床进展进行综述,旨在为深入认识mtDNA变异与肿瘤发生发展的关系并为临床治疗提供更多的参考依据.
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单纯慢性乙型肝炎病毒感染者HBV DNA水平与临床
乙型肝炎病毒(HBV)感染慢性化主要是因为乙型肝炎病毒在体内持续复制引起.近年作者运用定量聚合酶链反应(PCR)方法测定不同类型慢性HBV感染患者的血清HBV DNA拷贝数,报告如下.
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荧光定量检测EB病毒感染标本的选择
EB病毒(EBV)是一种常见的人类疱疹病毒,其感染在小儿非常普遍,且有逐年增加的趋势,是传染性单核细胞增多症主要病原物,还是儿科多种疾病的致病因子,可以累及全身多个脏器,而且临床表现及临床症状具有多样性,疾病也具有多样化,易漏诊、误诊[1],检测手段主要有病毒分离、血清学试验、荧光定量PCR等方法,本文应用荧光定量PCR的方法同时检测患儿血液标本、咽拭子标本中的EBV-DNA,并将二者的检测结果相比较,报告如下.
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相对定量法检测nestin-GFP转基因小鼠外源基因整合拷贝数
目的 计算出转基因小鼠nestin-GFP的外源基因整合拷贝数,为研究该模型中外源基因遗传及表达的稳定性打下基础.方法 用荧光定量PCR的方法对F0代的2只小鼠基因组做检测.先根据已知拷贝数的GFP(green fluorescent protein)和GAPDH来制作标准曲线和方程,然后计算出基因组中二者所含拷贝数的比例来计算外源基因的拷贝数.结果 2只F0的外源基因拷贝数分别是3和4.结论 nestin-GFP转基因小鼠的外源基因整合拷贝数分别是3和4.
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游离线粒体DNA拷贝数与疾病的研究进展
线粒体作为真核细胞内的重要细胞器,除了维持细胞正常的生理功能外还参与细胞凋亡及死亡过程。游离DNA包括游离核 DNA(nDNA)和游离线粒体 DNA(mtDNA),与nDNA相比mtDNA有更多的拷贝数。另外,由于mtDNA缺乏有效的损伤修复系统,更容易造成复制转录水平及拷贝数的变化。 mtDNA性状和数量的改变与人类多种疾病密切相关。本研究就近年来mtDNA拷贝数与疾病的相关研究作简单综述。
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线粒体DNA拷贝数在胃癌术后复发病例中变化的意义
目的 探讨胃癌术后复发患者的线粒体DNA (mtDNA)拷贝数异常与临床病理指标的关系.方法 选取50例胃癌术后复发患者及50例初发胃癌患者肿瘤、癌旁组织及外周血标本,分别提取基因组DNA,进而计算出mtDNA拷贝数;然后与临床及病理指标相比较并进行统计学分析.结果 无论是复发胃癌组患者还是初发胃癌组患者,肿瘤组织内mtDNA拷贝数明显低于癌旁组织内mtDNA拷贝数(P<0.05),同时其外周血中mtDNA拷贝数明显低于正常健康人外周血中的mtDNA拷贝数(P<0.05),mtDNA拷贝数高低与胃癌患者肿瘤的分化程度及淋巴结转移率有统计学关联(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤浸润深度分期无统计学联系(P>0.05).结论 线粒体DNA拷贝数的降低与胃癌发生、发展及术后复发有统计学关联.
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亨廷顿舞蹈病一家系报道
1 临床资料
先证者(Ⅱ2)男性,63岁,因认知功能下降8年,四肢多动2年于2014年1月就诊本院。患者8年前出现记忆力下降,不能胜任工作,后逐渐加重,并出现计算力下降、理解力降低,反应迟钝。病程中有入睡困难、焦虑、暴躁易怒。2年前患者出现双手扭动,并逐渐加重,发展为四肢舞蹈样不自主扭动,并伴有饮水呛咳、吞咽困难。神经系统查体:意识清楚,言语流利,记忆力、计算力、定向力均减退,反应迟钝,软腭上抬无力,咽反射减退。四肢可见舞蹈样不自主运动。指鼻试验、跟膝胫试验欠稳准。全身感觉检查正常。四肢腱反射正常,病理反射未引出。简易智能精神状态检查量表(Mini-Mental state ex-amination,MMSE):10分(定向力6/10分,记忆力0/3分,注意力及计算力1/5分,回忆能力0/分,言语能力3/9分)。1年前行头部 CT 示脑萎缩。该家系4代14例中有3例出现明显的临床表现。先证者的父亲(Ⅰ2)约60余岁发病,肢体舞蹈样不自主运动明显,疾病后期不能下床行走,终因肺部感染死亡。先证者同父异母的妹妹(Ⅱ4)约30岁发病,出现四肢舞蹈样不自主动作,50岁死亡,病程20年。先证者的儿子(Ⅲ3),40岁,出现记忆力下降1年,无肢体扭动。家系系谱图见图1。经患者及家属同意,采集先证者和先证者儿子的外周抗凝血5 ml,进行 IT15基因检测,具体检测方法见参考文献[1]。检测结果为:①先证者(Ⅱ2)IT15基因检测显示 CAG 重复拷贝数为19/45,确诊为 HD;②先证者的儿子(Ⅲ3)IT15基因检测显示 CAG 重复拷贝数为19/22,未达到基因诊断标准,见图1。 -
乙型肝炎病毒准种研究的临床意义
乙型肝炎病毒(HBV)的感染引起的急性和慢性病毒性肝炎、肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)的治疗十分困难,主要是由于我们对于HBV的分子生物学特性以及HBV相关性肝脏疾病的发病机制的认识还存在许多问题和误区.我们都知道,不同患者血清中的HBV不同拷贝之间的核苷酸序列不同,并就此分成不同的血清型和基因型.但是,对于一个特定患者来说,血清中的HBV DNA拷贝数目巨大,不同拷贝之间的序列是否相同,是否对于临床疾病状态和临床抗病毒治疗产生影响,多年来我们相对忽视这一问题.HBV分子生物学研究的结果提示,我们必须重视每一例患者血清中HBV核苷酸序列的这种异质性,特别是HBV的准种特点.
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重复序列突变与神经退行性疾病
核苷酸重复序列普遍存在于真核生物基因组.在染色体上经常出现一些重复序列,如(CCG)n、(CCTG)n等.相比一般DNA序列,这些重复序列更不稳定.其拷贝数易增加或减少,导致重复序列扩展或缩减[1,2].重复序列在DNA复制、转录、修复等过程中易形成二级结构,这些结构导致重复序列的变异,进而导致人类神经退行性疾病.神经退行性疾病(neurodegenerative disease,NDDs)是一种以大脑和脊髓细胞神经元丧失的为特征的疾病.随着人口老龄化的发展,NDDs将超过癌症,成为继心血管疾病之后的第二大死亡原因.在神经退行性疾病中,有约40种是由重复序列的突变引起的.本文对重复序列不稳定的特征、机制及其与NNDs的相关性进行综述.
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array-CGH技术及其在肿瘤学中的应用和意义
人类肿瘤的发生和发展常与非随机性染色体异常(包括基因组缺失、获得、扩增和重排等)有关[1,2].比较基因组杂交(comparatlve genomlc hybridization,CGH)技术可以快速全面地分析肿瘤组织DNA拷贝数的变化,并在中期染色体上定位,对于肿瘤研究具有重要意义.但是,CGH至今未应用于临床,一个主要的障碍是使用中期染色体铺片作为杂交靶,其局限性为:⑴CGH的分辨率低,不能发现小于2Mb的DNA获得和缺失;⑵不能将DNA拷贝数变化与基因或基因标记物直接联系起来;⑶虽然可经计算机软件识别每条染色体,但仍需要经验丰富的人员进一步确定,这限制了CGH的自动化操作和高通量分析[3~5].为了克服CGH的局限性,人们发明了微阵列一比较基因组杂交(array-CGH,matrix-CGH)技术,将DNA克隆或cDNAs做成微阵列,代替中期染色体作为杂交靶,不仅使分辨率提高,甚至可以确定肿瘤相关基因并提供精确的定位[3,4,6~8].
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比较基因组杂交技术在大肠癌研究中的应用
比较基因组杂交(comparative genomic hybrid-ization CGH),是1992年Kallioniemi[1]等创建的一种将削减杂交和染体荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridizati,FISH)结合的方法,可用于检测两个(或多个)基因组间相对DNA拷贝数变化(如丢失、缺失、增加和扩增等),并将这些异常定位在染色体上,又称DNA拷贝数核(DNA copy-numberkaryotype)技术.
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PCB153对人肾上皮细胞中LINE-1表达及转座的影响
[目的]探究2,2',4,4',5,5'-六氯联苯(PCB153)对人肾上皮细胞系(293T)细胞中长散在重复序列-1(LINE-1)基因表达和转座的影响.[方法] 293T细胞每2d传代一次,传代后立即使用5μmol/L PCB153进行染毒.染毒后的细胞置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中继续培养,连续染毒10d.同时设置二甲基亚砜(DMSO)对照组.采用实时荧光定量PCR技术检测LINE-1开放阅读框1(ORF-1和开放阅读框2(ORF-2)基因的mRNA表达水平及拷贝数,LINE-1拷贝数增加反映其发生转座.Western blot检测LINE-1 ORF-1和ORF-2蛋白表达水平.[结果]与对照组比较,从第4天开始PCB153染毒组细胞中LINE-1 ORF-1 mRNA表达水平增加(P<0.05),从第6天开始PCB153染毒组细胞中LINE-1 ORF-2 mRNA表达水平增加(P<0.05).染毒第10天时,与对照组(LINE-1 ORF-1:2.74±0.51;LINE-1 ORF-2:0.57±0.10)相比,PCB153染毒组的LINE-1 ORF-1蛋白表达水平(4.39±0.85)和LINE-1 ORF-2蛋白表达水平(0.78±0.10)均明显增加(P<0.05).染毒第10天时,PCB153染毒组与对照组的LINE-1 ORF-1拷贝数分别为1.43±0.64和0.83±0.37,LINE-1 ORF-2拷贝数分别为1.11±0.52和0.81±0.12,差异均具有统计学意义(P<0.05).[结论] PCB153暴露可增加LINE-1的表达和拷贝数,诱导其转座.
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荧光定量聚合酶链反应检测HBV-DNA观察
乙型肝炎病毒(HBV)感染的实验诊断主要依据血清学标志(HBV-M)和HBV-DNA的检测.以往运用的普通PCR检测只能定性,其后处理过程易导致假阳性污染,且所用的染色剂溴乙锭是强致癌物.因此,普通PCR的应用和推广受到一定限制.我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(Fluorescence quantitative ,FQ-PCR)克服了常规PCR的不足[1],直接检测146份血清标本乙型肝炎病毒核酸的拷贝数,并同时与酶联免疫吸附试验(ELISA)进行对照,现将结果报道如下.
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脑脊液细菌16S rRNA荧光定量聚合酶链反应快速诊断儿童化脓性脑膜炎
临床确诊化脓性脑膜炎(化脑)主要依赖于脑脊液(CSF)细菌培养,但该法耗时较长,阳性率不高,而且确诊前常因有不正规的抗生素治疗使CSF改变更不典型等,给早期诊治带来一定的困难,难以适应临床需要.为快速、可靠地诊断化脑,我们对20例本院疑似化脑患儿进行CSF细菌DNA荧光定量测定,监测其CSF细菌DNA拷贝数、CT值,同期与CSF细菌培养的对照,效果较好,现报道如下.
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比较基因组杂交方法在头颈部鳞癌研究中的应用
摘要比较基因组杂交(CGH)是一种将消减杂交和荧光原位杂交(FISH)相结合的分子细胞遗传学技术,可在全部染色体区带上检测基因组间DNA拷贝数增减变化并定位.本文综述了CGH检测头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的研究结果及其应用.
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转基因番茄防龋疫苗中外源目的基因拷贝数的检测
目的:采用SYBR Green实时荧光定量PCR方法检测转基因番茄防龋疫苗中外源目的基因的拷贝数.方法:用本课题组前期构建的重组质粒pEAC 10、pEPC10作为标准品,SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因pacA-ctxB 、pacP-ctxB的转基因番茄植株总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数.结果:含pacA-ctxB转基因番茄植株外源目的基因的拷贝数为1.3,含pacP-ctxB转基因番茄植株外源目的基因的拷贝数为3.2.结论:构建的转基因番茄植株属低拷贝转基因植物,具有较好的稳定性.
关键词: 转基因番茄 实时荧光定量PCR SYBR Green 拷贝数 CT值 -
AmpliSenSOr-PCR定量检测血清乙型肝炎病毒
聚合酶链反应(PCR)技术应用于乙肝病毒的诊断具有特异性强、敏感度高、早期诊断等特点,但只能对HBV DNA做定性检测,且易产生交叉污染和假阳性等问题.我们应用AmpliSensor-PCR检测方法,杜绝了常规PCR所存在的缺点,直接由患者血清中检测HBV DNA的精确含量,探讨不同组别乙肝患者血清标志物的拷贝数在临床上的意义.
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四种小型猪内源性逆转录病毒基因研究
目的 检测四种小型猪在内源性逆转录病毒基因(PERV)拷贝数上的差异,试图找出不舍或含有较低拷贝数的个体或品种.方法 采用半定量PCR方法检测了我国四种小型猪内源性逆转录病毒基因的拷贝数.结果 贵州小型猪、五指山猪、西藏小型猪、巴马小型猪的PERV的拷贝数分别是34.12±16.96,29.38±13.83,28.71±14.11,27.12±14.43(F=0.614,P=0.609),EnvA的拷贝数分别是9.78±5.48,10.06±5.34,10.23±5.71,10.51±6.23(F=0.044,P=0.988),EnvB的拷贝数分别是24.14±11.26,20.72±8.36,18.35±8.50,17.60±8.65(F=1.512,P=0.221).尚不能认为四个猪种间PERV、EnvA、EnvB的拷贝数之间的差异具有统计学意义.结论 四种常用的小型猪内源病毒负载量较低,表明其用于异种器官移植研究的可行性.
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四重TaqMan实时荧光PCR检测α地中海贫血——SEA、-α3.7和-α4.2 缺失
目的 建立并评价一种基于珠蛋白基因拷贝数相对定量技术的α地中海贫血(α地贫)--SEA、-α3.7和-α4.2缺失基因型快速检测方法.方法 建立四重TaqMan实时荧光PCR体系结合2-△△Ct数据分析的方法,同时检测ψα、α2和α1基因相对拷贝数,快速诊断α地贫缺失基因型;以此方法检测28例已知α地贫缺失基因型标本和309例临床标本,并与gap-PCR平行对比检测,评价该方法的准确性与实用性.结果 建立的检测体系扩增效率均接近100%;28例已知基因型及309例临床标本的检测结果显示其准确性达到100%,且能有效消除微量或少量外源污染导致的假阴性和假阳性.结论 本研究建立的基于珠蛋白基因拷贝数相对定量技术的α地贫-SEA、-α3.7和-α4.2缺失基因型检测方法,操作简单快速,结果准确可靠,适合大规模人群筛查和常规分子诊断.
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临床基因诊断实验室的管理
一技术背景在基因诊断技术发展史中核酸分子杂交发展早,于1961年开始研究.经典的方法是Southern印迹法,主要用于DNA的检测;随后又发展出了Northern印迹法(检测RNA)和斑点杂交法等.它是直接对样品中靶序列的测定.杂交法灵敏度不够,据报道敏感的核酸探针仅能检出103~104拷贝的靶分子,而多数临床标本中靶分子量远低于此限.1980年代中期,以PCR技术为主的体外核酸扩增技术的发展,使低拷贝临床标本的检测成为可能.PCR能使样品中靶序列的拷贝数特异性地快速扩增105~107倍,将检测阈值降至1~10拷贝数,大大提高了杂交检测的灵敏度.