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用荧光定量PCR方法检测转染细胞中外源基因的拷贝数
【目的】 探讨采用荧光定量PCR技术检测脑源性神经营养因 子(BDNF)基因转染细胞(PcDNA3.1(+)/BDNF/CHO)中BDNF的拷贝数。【方法】 分别以同等质 量的PcDNA3.1(+)/BDNF/CHO,PcDNA3.1(+)/CHO(空载体转染细胞)及CHO细胞的DNA为模板 ,在PE5700PCR仪上进行荧光定量PCR分析。每个样本共检测30次,结果采用q检验分析 。【结果】 PcDNA3.1(+)/BDNF/CHO细胞、PcDNA3.1(+)/CHO和CHO细胞株中BDNF的拷贝数 分别为95 164±12,31 622±10,31 622±11。q检验结果显示前者与后两者之间 有统计学意义,P<0.05,而后两者之间无统计学意义,即P>0.05。PcDNA 3.1(+)/ BDNF/CHO细胞株中BDNF的拷贝数是后二者的3倍,而后两者的拷贝数相同。【结论】 BDNF转 染细胞株中外源BDNF基因是以2个拷贝的比例整合到宿主细胞基因组中去的。
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核酸杂交检测HBV前C区变异
我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发区,大约有50%左右的人群受过HBV的感染.近年来发现,HBV感染后临床产生的不同疾病谱与病毒本身密切相关[1],因此, HBV前C区基因变异被广泛研究.整合在肝细胞染色体中的HBV-DNA拷贝数较少,并且常常出现基因片段的丢失,不易被常规方法检测出来.本文报道核酸杂交法检测HBV前C区基因变异的方法及结果.
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以线粒体 DNA 作为血管损伤生物标志物的研究进展
线粒体DNA ( mtDNA )拷贝数与很多人类疾病风险相关,比如糖尿病、癌症、神经退行性疾病、衰老、肾和肝脏疾病以及自身免疫疾病等。在多种人类病理条件下, mtDNA拷贝数降低可引起ATP生成降低并出现糖酵解增加,扰乱线粒体膜电位,引起线粒体功能失调[1-2]。因而mtDNA含量的变化可以灵敏地反映机体的病理或环境暴露的变化。近期将mtDNA作为多种疾病的生物标志物的研究改变了人们对mtDNA拷贝数的关注度。国内很多学者已经在临床疾病中对mtDNA拷贝数和疾病相关性进行了初步探讨,但各项研究的结果也引发了一些争论。本文对mtDNA拷贝数作为血管相关疾病的生物标志物的相关研究进行综述,指出其存在的问题并提供一些可能的解决方法。
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基因芯片在产前诊断中的应用进展
产前诊断是预防遗传病患儿出生的主要途径.产前诊断可靠、先进、科学的手段是DNA 水平的基因诊断.中期染色体核型分析是目前产前细胞遗传学检测的金标准,它可以检测5 ~ 10 兆碱基的染色体组非整倍性异常,包括缺失、重复以及其他染色体重排.基因芯片技术的灵敏度则比核型分析提高了100 倍,它可以检测千碱基对级的染色体缺失或重复,尤其对诊断微缺失或重复综合征,如DiGeorge 综合征优势较大[1].近期有研究[2]报道,核型分析可能导致由染色体拷贝数异常(copy number variation, CNVs)引起的疾病,因此基因芯片被推荐作为细胞遗传学异常检测的首选方法.此外基因芯片具有容量大、高自动化、大规模效应,这种技术逐渐被应用到产前诊断中.本文对目前基因芯片在产前诊断中的应用进展作一综述.
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慢性阻塞性肺疾病患者外周血白细胞线粒体DNA拷贝数变化及其与吸烟的关系
目的 探讨慢性阻塞性肺疾病患者外周血白细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数变化及其与吸烟的关系.方法 选择60例COPD患者为COPD组,45例健康人为对照组,提取两组外周血白细胞基因组DNA.比较两组间mtDNA拷贝数,以及COPD组中吸烟与不吸烟患者的mtDNA拷贝数.结果 COPD患者外周血白细胞mtDNA拷贝数低于对照组,吸烟者mtDNA拷贝数低于不吸烟者(均P<0.05).结论 COPD患者外周血白细胞mtDNA拷贝数的降低,其中吸烟者外周血白细胞mtDNA拷贝数更低.COPD的发生可能与外周血白细胞mtDNA拷贝数减少有关.
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炎症牙髓保存活髓后细菌拷贝数检测
目的:探讨牙髓炎活髓保存术清除髓腔细菌的效率.方法:选用成功建立牙髓炎模型的新西兰大白兔20只,每只兔采用自身对照的方法,随机将2颗下颌前牙分为实验组和对照组,实验组在兔牙颊面颈部钻两孔,置入制备好的小儿头皮针,使用抗生素液冲洗髓腔并引流;对照组使用碘仿糊剂处理炎症牙髓.术后1、3、5、7 d各处死5只,收集标本保存-20℃冰箱待测.结果:第3、5、7 d实验组细菌拷贝数少于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:实验性牙髓炎进行冲洗引流后能有效清除炎症牙髓中的细菌.
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血细胞线粒体DNA拷贝数变化与高原红细胞增多症易感性的关联研究
目的 探讨血细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数的变化与高原红细胞增多症易感性的关联性.方法 分别采集年龄、职业等相匹配的高原红细胞增多症患者37例及对照组42例的静脉血2 mL,提取总DNA,通过定量PCR法(染料法)检测白细胞的mtDNA相对拷贝数.结果 高原红细胞增多症患者中,mtDNA 拷贝数显著低于对照组 (P<0.05).通过线性回归分析显示,在对照组中,随血红蛋白浓度的增加mtDNA 拷贝数增加(P<0.05);然而在高原红细胞增多症病例组中,随着血红蛋白浓度的增加,mtDNA 拷贝数降低(P<0.05).结论 高原红细胞增多症患者中,mtDNA 拷贝数较低,可能作为该病的分子标记.
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中国北方汉族人群LPAKIV-2拷贝数变异与Lp(a)及冠心病的关系
目的 探讨中国北方汉族人群载脂蛋白(a)基因(LPA)KIV-2拷贝数变异与血清脂蛋白(a)[Lp(a)]及冠心病(C H D)的关系.方法 选择2016年10月至2018年3月在哈尔滨医科大学附属第四医院急诊内科和心内科就诊的275例患者,其中通过临床症状和影像学方法明确诊断为C H D的84例患者设为C H D组,冠状动脉狭窄程度<50% 的191例冠状动脉粥样硬化患者设为对照组,提取全血DNA后,用荧光定量PCR(qPCR)检测LPA KIV-2拷贝数,并检测所有患者的Lp(a)水平.结果 Lp(a)与拷贝数呈负相关关系(r=-0.33,P<0.01),并且在年龄分层下,每个年龄段下随着LPA KIV-2拷贝数增加,血清Lp(a)水平都随之降低(P<0.05).通过逐步Logistic回归分析,得出年龄、性别、LPA KIV-2拷贝数、Lp(a)、三酰甘油(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)对CHD有影响.结论 中国北方汉族人群LPA KIV-2拷贝数与Lp(a)水平呈负相关关系,血清Lp(a)水平和LPA KIV-2拷贝数为CHD发病的危险因素.
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在体外用人乳铁蛋白抑制丙型肝炎病毒感染研究初探
我们利用Vero、 HepG2两种细胞系同时来验证人乳铁蛋白的抗HCV作用并初步确定蛋白的作用对象—细胞还是病毒,以此为该蛋白用于抗HCV临床治疗提供理论依据。一、材料与方法 1.细胞和血清:HepG2细胞系(Dr. Schinazi馈赠),Vero细胞系(由湖北医科大学病毒研究所保存);细胞培养方法见文献[1]。阳性血清:7份HCV患者血清,混合后作为病毒接种物(测得HCV阳性混合血清的+RNA阳性,-RNA阴性;HCV RNA 拷贝数为5×104;HAV和HBV阴性)由湖北医科大学附属第一和第二医院传染科提供;阴性血清:2份(HCV和抗-HCV均为阴性)来自一健康体检者。
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脊髓性肌萎缩症的SMN1基因点突变分析
目的 通过运动神经元存活基因1(survival motor neuron gene 1,SMN1)点突变研究,对SMN1单拷贝缺失的疑似脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atroph,SMA)患儿给予基因诊断.探讨SMN1复合杂合突变患儿的临床表型.方法 按照国际SMA诊断标准对3例患者进行临床拟诊和随访分型.应用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术进行SMN1和SMN2基因的拷贝数定量分析.应用逆转录PCR和克隆测序技术进行SMN1点突变研究.通过核心家系成员拷贝数和点突变分析,明确突变在家系中的传递.结果 确定了2种SMN1基因点突变:p.Leu228X(1例)和p.Arg288Met(2例).其中错义突变p.Arg288Met为中国SMA中首次报道,无义突变p.Leu228X为中国大陆地区首次报道.携带p.Leu228X突变的患儿具有2个SMN2拷贝,为Ⅰ型SMA;而携带p.Arg288Met突变的2例患儿SMN2的拷贝数均为3,表型分别为Ⅰ型和Ⅱ型.结论 p.Leu228X和p.Arg288Met突变均遗传自父母,而非新发突变.两种突变导致了严重的Ⅰ型和较为严重的Ⅱ型SMA.3例SMA患儿发生SMN1基因杂合缺失同时伴有SMN1基因点突变,提示我国SMA存在复合杂合突变机制.对SMN1基因单拷贝缺失的疑似SMA患儿,进行点突变分析十分必要,能够为患儿的临床诊断、家庭的遗传咨询和产前诊断提供依据.
关键词: 脊髓性肌萎缩症 运动神经元存活基因1 点突变 拷贝数 -
七个非综合征型耳聋家系患者的mtDNA A1555G突变性质与特点
目的 探讨非综合征型耳聋家系患者mtDNA A1555G突变性质及其特点,探索临床表型多样性的分子遗传学基础.方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态和实时荧光-扩增阻碍突变系统-定量PCR(real time-amplification refractory mutation system-quantitative PCR,RT-ARMS-qPCR)检测7个非综合征型耳聋家系71个成员的mtDNA A1555G突变,并收集、分析其临床资料.结果 7个家系中所有受检的母系成员mtDNA A1555G突变均为阳性,突变性质含同质性和异质性两种;非母系成员及配偶该突变为阴性.7个家系mtDNA A1555G同质性突变的拷贝数与耳聋轻重程度相关(R=0.341,P=0.022);mtDNA A1555G异质性突变的拷贝数与耳聋轻重程度相关(R=0.85,P=0.015).结论 mtDNA A1555G突变可导致非综合征型耳聋和氨基糖甙类抗生素致聋,其突变性质含同质性和异质性两种,且含mtDNA A1555G位点的突变型与野生型的比例与耳聋的严重程度密切相关.
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微滴式数字PCR在脊肌萎缩症基因检测和产前诊断中的应用
目的:探索微滴式数字 PCR (droplet digital PCR,ddPCR)技术在脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)的致病基因SMN1第7外显子拷贝数的检测和产前诊断中的应用。方法应用ddPCR 技术和常规的多重连接依赖性探针扩增技术同时对56个 SMA 家系共138例样本(其中产前诊断样本17例)行 SMN1基因第7外显子拷贝数的检测,并对二者的结果进行比较。结果ddPCR 技术检测结果同多重连接依赖性探针扩增技术检测结果一致率为100%,其中SMN1第7外显子拷贝数为2的样本25例,拷贝数为1的样本84例,拷贝数为0的样本29例。结论ddPCR 技术对于 SMN1基因拷贝数的检测是准确、快速、经济的,可满足 SMA 临床基因检测和产前诊断的需求。
关键词: 微滴式数字PCR 多重连接依赖性探针扩增技术 SMN1基因 拷贝数 产前诊断 -
荧光定量PCR法用于转染CHO细胞中人凝血因子Ⅶ基因拷贝数检测的研究
目的 采用荧光定量PCR法检测转染后可分泌表达人凝血因子ⅦCHO细胞株CHO-FⅦ中FⅦ基因的拷贝数.方法 提取CHO-FⅦ和CHO-pcDNA3.1(空载体转染得到的细胞株)基因组DNA,分别以含有β-actin基因片段的质粒pMDT-actin和含有FⅦ全长cDNA序列的质粒pcDNA-FⅦ制作标准曲线,以CHO-FⅦ和CHO-pcDNA3.1的DNA为模板进行qPCR反应,计算出模板中细胞总数以及目的基因的拷贝数,得到每个细胞中目的基因的拷贝数,反应均在ABI Stepone Plus荧光定量PCR仪上进行.结果 经检测模板中的细胞数为24 421±7 414,FⅦ基因的拷贝数49 455±3 502,每个细胞含有2个FⅦ基因拷贝,空载体转染得到的细胞株中并没有检测到FⅦ基因的存在.结论 FⅦ基因是以2个拷贝的比例整合到宿主染色体上的.
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染色体微阵列技术在产前诊断中的应用
近年来,染色体微阵列技术(chromosomal microarray analysis,CMA,又称为基因芯片技术),由于具有容量大、高自动化、大规模效应而逐渐被应用到产前诊断中,为产前诊断提供了新的途径,其在对染色体拷贝数异常(copy number variation,CNVs)即染色体的数目异常、片段缺失和重复的检测方面比传统的染色体核型分析具有明显的优越性.1 CMA的特点及进展染色体微阵列技术(CMA),也叫分子核型分析技术(molecular karyotyping),代表所有以微阵列为技术基础的基因组拷贝数分析技术,包括基于比较基因组杂交的微阵列(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)和基于单核苷酸多态性的微阵列(single nucleotide polymorphism arrays,SNP arrays)o aCGH是先发展、也是目前仍然为广泛应用的微阵列技术.其次是SNP arrays技术,它在对人类基因组变异检测的基础上增加了单核苷酸多态性的信息数据.但以细菌人工染色体BAC(bacterial artificial chromosomes,BACs)为探针的aCGH的缺点之一是它无法对小于其探针长度即100~150 kb的CNVs进行检测,而且,它容易造成对CNVs片段长度的高估,例如CNV仅占BAC探针长度的50%,而检测时系统会误认为CNVs覆盖了BAC探针全长.
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EGFR和pS2蛋白在直肠癌中的表达及其临床意义
表皮生长因子受体EGFR)及其相关配体表皮生长因子和转化生长因子α(Transforming growth fector alpha, TGFa )是细胞信号传导系统的一部分。研究表明,EGFR基因的拷贝数增加或过度表达,均能促进正常细胞的增殖、转化与恶性肿瘤细胞的生长和转移。pS2蛋白作为一种雌激素调节蛋白,其表达不但受雌激素调节,同时也受EGF、TGFa等因子的影响。
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原癌基因 c-erbB-在乳腺癌中的表达
1 c-erbB-基因表达及定位c-erbB-基因位于细胞染色体上17q21位点,它编码分子量为18.5×104的跨膜糖蛋白(p185),正常细胞内含有两个拷贝数的HER/neu原癌基因,能帮助维持细胞的正常生长.HER2/neu基因扩增拷贝数超过2h,会导致细胞膜上c-erbB-蛋白受体过量,并预示原癌基因活动.c-erbB-蛋白具有酪氨酸激酶受体活性,是表皮生长因子(EFG)受体家族中的一个成员.蛋白过度表达与肿瘤生长及远处器官的转移有关.因此认为,c-erbB-蛋白可作为肿瘤免疫治疗的靶抗原[1,2].
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应用PCR-测序及SSCP技术分析mtDNA序列多态性
mtDNA以其拷贝数多、呈母系遗传、进化速度快等特点,为法医检案提供了一种有效的检测项目,特别是对微量、陈旧降解检材的DNA检验.应用PCR-自动测序和PCR-SSCP检测技术分析58例太原地区无关汉族个体mtDNA nt16081-16546区间(位于HV I)序列多态性,并对其进行统计学分析.
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广州地区汉族群体mtDNA HV I 区多态性
人类线粒体DNA(mtDNA)是一个闭合的、环状的双链DNA分子,大小为16569 bp,包含一个约1.1 kb长的非编码区(noncoding region).由于其具较高的复制错误率和较低的修复能力,mtDNA分子,特别是在非编码区具有较高的多态性.mtDNA分子具有母系遗传、高拷贝数(1000~10000个拷贝/细胞)[1]等特点,非编码区的两个高度变异的区域HVRI(hypervariable region I)和HVRⅡ(hypervari-able regionⅡ)已作为法医学个体识别非常有用的遗传标记,特别是对微量的、降解的、无法进行核DNA分型的生物样品,如毛干的DNA分型,人类遗骸的个人认定[2~4].
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法医常染色体STR分型
短串联重复序列(STR)是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列.它由2~6个碱基对构成核心序列,呈串联重复排列,其长度多态性主要由核心序列拷贝数目的变化而产生.一般认为,人类基因组平均每6~10kb就有1个STR基因座,为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源.与限制性片段长度多态性产生的DNA指纹相比,用聚合酶链反应技术(PCR)扩增STR基因座产生的DNA纹印具有更高的灵敏度.STR扩增片段较短(100~300bp),对于常见含部分降解DNA的陈旧斑痕,PCR扩增STR比DNA指纹分析更容易成功.
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聚合酶链反应技术在乙肝病毒DNA检测中的应用
PCR(Polymeras Chain Reation)即聚合酶链反应,于1985年就有报道,是一种模拟特异天然DNA复制过程的核酸扩增法.以DNA为模拟的特异靶序列,在引物介导下酶促扩增,可以从极少量基因组DNA合成百万拷贝数的某DNA片段.我们应用PCR测试法,对肝病患者及体检的青年工人血清中的乙肝病毒DNA进行有关血清分析及临床研究,获得了可靠数据和临床效果.