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三七总皂苷对缺氧再给氧血管内皮细胞损伤保护效果研究
目的 探讨发生缺氧再给氧损伤( H/R)对人脐静脉内皮细胞株(ECV304)的功能影响并探讨三七总皂苷抗血管内皮细胞H/R损伤的作用效果和作用机制.方法 体外培养的ECV304,将之分为7个研究组,分别为代号A-G的对照组、H/R组、PDTC组、维拉帕米组、不同浓度(0.781mg/L,1.563mg/L,3.125mg/L)的三七总皂苷组;培养1h后通过观察细胞内Ca2+浓度,一氧化氮(NO)和前列环素(PGI2)的含量,超氧化物歧化酶( SOD)、丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量,细胞间黏附分子ICAM-1的表达、核因子kB(NF-kB)的活性等,来确定H/R对ECV304的离子转运功能、细胞分泌功能、氧自由基清除功能、黏附功能及细胞活力的影响,并通过三七总皂苷组与PDTC组、维拉帕米组进行比较,观察三七总皂苷抗血管内皮细胞H/R损伤的作用效果和作用机制.结果 H/R可激活ECV304,使细胞氧自由基清除功能明显降低,NF-κB及ICAM-1的表达明显升高,细胞肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮(NO)及前列环素(PGI2)含量、细胞活力明显降低,[Ca2+]i明显升高;tPNS能有效改善细胞氧自由基清除功能,降低NF-kB、ICAM-1活性,改善肌浆网Ca2+-ATP酶活性,减轻细胞内钙超载,减轻H/R损伤,且高浓度tPNS效果优于维拉帕米、PDTC.结论 三七总皂苷能有效降低NF- κB活性及ICAM-1表达,减轻细胞内钙超载,减轻血管内皮细胞缺氧再给氧损伤;高浓度三七总皂苷与钙拮抗剂维拉帕米、抗氧化剂吡咯烷二硫氨基甲酸脂相比作用较强,效果更好.
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羟基红花黄色素A上调低氧状态下血管内皮细胞中缺氧诱导因子-1α的表达
羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)是从菊科植物红花中提取的查尔酮类化合物.本实验观察HSYA对低氧状态(1%O2)下人脐静脉内皮细胞株(Eahy926)增殖的促进作用及其调节Eahy 926细胞中林希氏基因(von Hippel-Lindau gene,VHL),抑癌基因p53(tumor suppressor gene p53,p53)和降解缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1aα)的作用.采用MTT法测定低氧状态下HSYA(100、10和1 μmol·L-1)对Eahy926细胞增殖率的影响.免疫组织化学方法测定VHL与p53蛋白表达数量和定位.RT-PCR方法检测细胞中VHL、p53和HIF-1α的转录水平.Western blotting方法检测VHL、p53和HIF-1α的蛋白表达.与低氧模型对照组相比,HSYA(100 μmol·L-1)促使细胞增殖率升高,HIF-1α转录和蛋白表达水平显著增强,呈时间依赖性.给药8 h后,VHL与p53的蛋白表达和转录水平均明显降低.HSYA诱导HIF-1α表达增加并提高低氧状态下细胞增殖率的作用.可能通过抑制VHL和p53两种HIF-1α的降解调节因子实现.
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蓝莓花青素对由H2O2诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用
目的 通过建立人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氧化应激损伤细胞模型,探讨蓝莓花青素是否能够对H2O2引起的细胞损伤具有保护作用.方法 采用过氧化氢(H2O2)创建ECV304氧化应激损伤细胞模型,实验分为正常对照组、H2O2组、蓝莓花青素低、中、高剂药物组,药物组中加入蓝莓花青素培养2h后,再加入H2O2继续培养6h,采用MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期变化情况及细胞凋亡率.结果 细胞活力与H2O2浓度及其作用的时间呈相关性下降趋势,在一定浓度范围内蓝莓花青素对细胞具有保护作用.结论 蓝莓花青素对由H2O2引起的氧化应激损伤具有一定保护作用.
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淫羊藿苷在体内外对血管生成的抑制作用
目的 观察淫羊藿苷(ICA)对血管生成的影响.方法 采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测ICA对CAM血管生成的影响,MTr法检测ICA对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长的影响,流式细胞术分析ICA对HUVEC周期的影响,聚碳酸酯膜小室趋化运动模型检测ICA对HUVEC细胞运动能力的影响.结果 ICA能明显抑制CAM血管生成;抑制HUVEC生长,其抑制效果与剂量和作用时间相关;ICA作用下HUVEC细胞可出现周期阻滞,180 μg/mlICA处理HUVEC 6 h对细胞迁移抑制率为78.0％.结论 ICA能抑制血管生成,但其体内抑血管生成作用还有待于进一步证实.
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体外γ干扰素对脐静脉内皮细胞ECV-304的作用
血管生成存在于正常生理过程,如排卵,受精卵的着床等,也存在于损伤修复和肿瘤的发生、发展过程.血管生成是通过内皮细胞的分裂增殖而完成,各种参与血管生成因子的终作用位点是血管内皮细胞.γ干扰素(IFN-γ)是Th1细胞免疫细胞因子,同时可下调血管生成,但确切机制不清楚[1,2].本研究在体外观察IFN-γ对人脐静脉内皮细胞株细胞生长的影响,旨在探讨IFN-γ下调血管生成的可能机制.
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低氧对血管内皮细胞肾上腺髓质素基因转录的影响
为研究低氧条件对肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)基因表达的影响,本文观察了低氧引起血管内皮细胞ADM基因转录的变化,并探讨ADM在缺血缺氧性疾病机制中的作用.1 材料和方法(1)HUVEC细胞的培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC(美国芝加哥大学Pritzker医学院Gewertz BL教授惠赠),用含20%小牛血清的M199培养基置于37℃,5%CO2培养箱内贴壁生长,待长满培养瓶培养面后用PBS冲洗2次,加入0.25%胰蛋白酶消化、传代.
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ECV304细胞株用于体外血管新生的实验研究
血管新生与肿瘤的生长、组织损伤修复等病理生理过程密切相关而备受关注.体外血管新生模型有助于研究某种因素对血管形成的影响而成为常用的研究手段.体外血管新生研究中,由于原代培养的人脐静脉内皮细胞增殖活性低、传代次数少,因而多采用细胞株作为内皮材料.ECV304细胞是自发转化的人脐静脉内皮细胞株,但是Ⅷ因子相关抗原为阴性,因此部分学者对ECV304的应用产生质疑[1,2].本研究采用ECV304细胞构建体外血管新生二维、三维模型,对其可行性进行探讨.
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何首乌提取物对人脐静脉内皮细胞株ECV-304的VCAM-1、ICAM-1表达的影响
内皮细胞是血液与血管壁之间的结构和功能屏障,内皮细胞受损是动脉粥样硬化(AS)形成的始发因素,粘附分子在内皮细胞受损过程中起了重要作用,因此如何控制内皮细胞粘附分子的表达在防止AS发生中是至关重要的.中药何首乌临床证实其提取物对生物体多种代谢活性具有积极的影响作用[1～4],但对内皮细胞粘附分子的表达是否有影响,还未见文献报道.本文用何首乌提取物作用内皮细胞后检测血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的变化,阐明何首乌对内皮细胞粘附分子的表达是否有作用,为临床上用中药防治AS提供理论依据.
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养心汤含药血清对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型Smad4mRNA表达的影响
目的:观察养心汤含药血清对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型Smad4 mRNA表达的影响,从分子生物学水平探讨其可能的作用机制.方法:采用H2O2体外诱导人脐静脉内皮细胞损伤的方法,建立人脐静脉内皮细胞损伤模型.实验分为空白组、模型组、养心汤含药血清组,应用Affymetrix人基因组U133+2.0芯片筛选出Smad4基因,采用实时定量PCR的方法观察养心汤含药血清对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞损伤模型Smad4 mRNA表达的影响.结果:养心汤的含药血清可以下调过氧化氢氧化损伤内皮细胞Smad4 mRNA表达.结论:养心汤下调过氧化氢氧化损伤内皮细胞Smad4 mRNA的表达可能是其保护内皮细胞损伤,防治冠心病不稳定型心绞痛的主要机制之一.
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LPS对人脐静脉内皮细胞的F-actin和VE-cadherin细胞定位和结构的影响
目 的:应用免疫荧光技术,通过观察人脐静脉内皮细胞株ECV304的F-actin和VE-ca dherin的细胞定位和结构变化,从形态学的角度阐述LPS对内皮细胞的直接作用.方法:将EVC304细胞以1×108/L接种在微孔小皿上,培养至单层铺满皿底开始实验.对VE-cadherin的观察分为正常组、VE-cadherin一抗阴性对照组和LPS l00、200、300、400、500 μg/L刺激组 .LPS各组先用不同浓度的LPS直接刺激细胞30 min,PBS洗3次,2%多聚甲醛固定20 min, 加一抗(Goatpolyclonal l∶100)4℃2 h,而后加VE-cadherin荧光二抗(Rabbit-Anti-Goat-FITC l∶200)4℃ 1 h,PBS洗3次共10 min(避光);对F-actin观察组,先用2%的多聚甲醛、0. 5 %TritonX-100混合PBS液固定和膜打孔20 min、洗涤,罗丹明-鬼笔环肽(2×103 U/ L)染色40 min,P BS洗3次,后用NikonTE300荧光倒置显微镜镜检,Kodak 200胶卷照相.结果:[ HTSS〗1.VE-cadherin的变化:正常组可见内皮细胞间紧密连接处染色轮廓清晰,可见膜内侧有较弱的染色, 胞浆无染色;低浓度的LPS(100、200 μg/L)对VE-cadherln的细胞分布没有明显影响;300 、400、500 μg/L LPS组可看到细胞间紧密连接处染色明显减少,部分视野细胞回缩,有明显的细胞间隙形成,膜内侧有较强的染色;一抗阴性对照组没有染色.2.F-actin的变化:正常组F-actin主要分布在细胞的周边,分布均匀、排列整齐,细胞间连接紧密,没有间隙形成;低浓度的LPS(100、200 μg/L)对F-actin的分布及重组没有明显影响;高浓度的LPS(3 00、400、500 μg/L)刺激后,内皮细胞周边的F-actin基本消失,出现明显的应力纤维(变粗、变短、紊乱,排列呈明显的极向分布),可见伪足,并伴随细胞间缝隙形成.讨论: LPS(脂多糖)是内毒素的活性成分,作用于细胞的机制很复杂,此前众多学者对LPS作用于细胞的信号转导通路做了大量的研究,但是对于LPS直接对内皮细胞刺激的情况下,真正从形态学的角度着手的很少.本实验从形态学入手,结果表明,LPS在体外高浓度的(大于300 μg/L) 直接刺激下,引起骨架蛋白的重组和细胞内的重新分布,具体表现为F-actin排列紊乱,可见伪足,进而细胞间隙形成:VE-cadherin染色部分缺失是细胞间隙形成的直接证据.结论 :高浓度的LPS(大于300 μg/L)通过某种途径直接作用于内皮细胞,可影响F-actin和VE-c adherin的重组和细胞内分布.
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蛋白激酶C在调节血管内皮细胞通透性中的作用
蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一种钙或/和磷脂依赖性蛋白磷酸化酶,广泛存在于人体的各种组织细胞中.它能被细胞外生物活性因素(生长因素、神经递质、细胞因子等)激活,完成靶细胞蛋白的磷酸化,通过蛋白磷酸化后生物活性的改变而完成细胞外源性信号的应答,构成细胞内重要的信号转导系统.许多实验证明蛋白激酶C的激活在血管内皮细胞屏障功能和血管通透性的变化调节中起着重要的作用.本实验从组织、细胞和分子水平对PKC在血管通透性调节中的作用进行了系统的研究.目的和方法:1.采用游离灌注的猪冠状微静脉模型,在严格控制生理环境的条件下,通过荧光倒置显微镜,利用荧光比率测定技术,测定了游离猪冠状微静脉的通透性,并观察蛋白激酶C的激活与抑制对微静脉通透性的影响.2.培养单层脐静脉内皮细胞株ECV-304,用同位素标记和液体闪烁计数法检测细胞浆和细胞膜的PKC活性,观察PKC在热损伤刺激后激活和移位的情况.3.应用免疫荧光技术,观察PKC激活和热损伤刺激对人脐静脉内皮细胞株ECV304的F-actin 的细胞定位和结构变化的影响,从形态学的角度证明PKC对内皮细胞的作用.结果:1.利用PKC的特异性激动剂佛波酯醇(PMA)激活PKC可显著增加血管通透性约至300%.PKC 的特异选择性抑制剂bisindolylmaleimide(BIM)阻断了PMA增加通透性的作用;在单纯PMA 刺激下,Pa值是对照组的290.94%±78.13%(n=7, 血管平均口径D=63.86±3.14 μm), 而在BIM的影响下, PMA只使Pa值升高到对照的139.97%±20.82%(n=7, D=43.25±3 .08 μm).2.用PKC特异性激动剂PMA和热损伤刺激都可以导致ECV-304细胞浆中的PKC的激活和向胞膜移位.未受刺激的ECV-304细胞,胞浆中的PKC活性是43.47 fmol*mg-1*min-1 .明显高于胞膜的 23.12 fmol*mg-1*min-1,提示此时PKC主要位于胞浆.用佛波脂醇(PMA) 刺激可引起胞膜中P KC活性迅速增高,高达48.43 fmol*mg-1*min-1,相应胞浆中的PKC活性则明显下降.用PKC的特异性抑制肽PKC(19-36)可以阻止这种变化.3.PKC激动剂PMA和热损伤作用可使原来主要分布于细胞周边的F-actin激活呈极向排列,形成应力纤维,并在包膜部位形成板状突起.细胞间出现明显缝隙.用PKC的抑制肽PKC(19 -36)可以抑制上述变化.结论:结果提示,蛋白激酶C的激活和移位可以通过直接或间接地作用于内皮细胞骨架蛋白 ,导致内皮细胞骨架重排,引起血管通透性的升高.热损伤刺激可引起PKC的激活和细胞骨架的重排,提示PKC激活在热损伤介导的内皮细胞功能变化中起重要的信号转导的作用.
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人真核表达质粒载体pcDNA3/HA-moesin的构建及其在内皮细胞中的表达
目的:构建人膜突蛋白(moesin)的真核表达质粒pcDNA3/HA-moesin,并检测其在内皮细胞中的表达.方法:采用RT-PCR法从人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)中克隆得到moesin cDNA全长序列,经双酶切后连接到真核表达载体pcDNA/HA中,挑选出的阳性克隆经双酶切和测序鉴定后,经脂质体转染法转入HUVECs中,采用Realtime PCR及Western blot等方法检测目的基因mRNA及蛋白的表达.结果:pcDNA3/HA-moesin质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因moesin的序列完全正确,真核表达质粒构建成功.Realtime PCR检测显示,转染pcDNA3/HA-moesin组的moesin mRNA表达水平明显高于未转染组和转染pcDNA3/HA空载体组,后2组间无明显差异.Western blot结果显示转染pcDNA3/HA-moesin组有HA-moesin蛋白表达,而未转染组和转染pcDNA3/HA空载体组未检测到HA-moesin表达.结论:成功构建pcDNA3/HA-moesin真核表达载体,在体外转染HUVECs后可使moesin mRNA表达增加,并成功表达HA-moesin,为进一步鉴定内皮细胞中晚期糖基化终产物(AGEs)引起的moesin的磷酸化位点奠定了实验基础.
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两种中药多糖诱导人内皮细胞表达造血生长因子的实验研究
血管内皮细胞(EC)是造血诱导微环境的重要组成成分.文献报道EC能分泌多种造血生长因子来调控造血.人参与当归是祖国传统医学的"补气"和"补血"要药,人参多糖(G PS)和当归多糖(APS)为其主要药物成分之一.近10年来我们课题组对APS以及G PS促进血细胞生成的调控机理进行了系统的研究,我们既往研究证明:APS对造血干/ 祖细胞增殖分化有显著刺激作用,GPS也可促进人粒单系造血祖细胞的增殖和分化,但其现代生物学机理尚不甚清楚.本研究采用造血生长因子生物活性检测与免疫细胞化学等技术 ,探讨APS和GPS诱导人内皮细胞表达GM-CSF、IL-3、IL-6与促进人造血祖细胞增殖分化的相互关系.材料与方法:(1)GPS:重庆中药研究所分离、提取、纯化,纯度＞90%;APS:兰州医学院血液病研究所惠赠,纯度＞85%.(2)人脐静脉内皮细胞株(Ecv304).(3)EC培养上清液的制备:分别制备对照组(不加任何刺激物,常规培养)、IL-1、GPS与APS体外诱导组(IL-1:100u/ml ,GPS:50μg/ml,APS:200μg/ml)的Ecv304细胞培养上清液 .(4)造血生长因子活性检测:以每种植5×104个骨髓有核细胞所生成的CFU-M ix、CFU-GM集落数评价各种Ecv304细胞培养上清液中造血生长因子的活性. (5)SP免疫细胞化学检测经IL-1、GPS和APS诱导和对照组Ecv304细胞的G M-CSF、IL-3、IL-6蛋白表达.实验结果表明:(1)经IL-1或GPS、A PS诱导制备的Ecv304细胞培养上清液能显著促进CFU-Mix、CFU-GM的增殖,其集落产率与对照组相比有显著的统计学意义(CFU-Mix:GPS组:52. 89±9.67,APS组:54.33±10.39,IL-1组:61.13±9.2 6,对照组:36.24±10.74;CFU-GM:GPS组:40.36±8.92 ,APS组:44.17±9.53,IL-1组:43.37±8.56,对照组:30 .78±11.45).(2)免疫细胞化学检测显示正常静止状态下EC胞浆内有棕黄色的 GM-CSF、IL-3、IL-6蛋白表达的阳性颗粒,但表达阳性率及强度均很低,经过IL-1或GPS、APS诱导后Ecv304细胞的GM-CSF、IL-3、IL- 6蛋白表达阳性细胞率和表达强度均明显提高.结果表明:经GPS、APS或IL-1诱导制备的内皮细胞培养上清液对CFU-GM和CFU-Mix的增殖分化有明显促进作用 ,提示其中造血生长因子(HGF)含量或活性有所增加.我们推测GPS和APS对内皮细胞表达HGF具有明显的刺激作用.现代研究认为:HGF与造血细胞膜上相应的HGF 受体结合,启动调控信号向核内转导,引起核内某些基因转录增强或其他基因转录抑制,终表现出蛋白合成改变,而导致细胞行为等变化.可见研究HGF的蛋白表达及调控能深入阐明造血调控的分子生物学机理.HGF生物学活性检测仅反映了内皮细胞条件培养液所含 HGF的生物学活性,HGF有其多效性和丰富性的特点,为进一步阐明GPS和APS能诱导和影响哪些HGF表达,本研究采用免疫细胞化学SP法对内皮细胞的GM-CSF、 IL-3和IL-6蛋白表达进行检测,结果表明:IL-1或GPS、APS诱导后内皮细胞的GM-CSF、IL-3和IL-6蛋白表达阳性率和强度积分值均显著高于对照组 ,这与生物学活性检测的结果相吻合.我们研究结果提示:GPS和APS调控造血的机理之一是上调造血微环境中的内皮细胞分泌造血调控因子来调节血细胞的生成.这或许是人参和当归"补气""补血"的现代生物学机理之一.
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AngⅡ对ECV304细胞增殖作用的相关基因表达谱研究
目的:探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对ECV304细胞增殖作用的相关基因表达谱.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞株(ECV304),实验分AngⅡ处理组、NAC干预组和正常对照组.采用改良MTT法、Fenton反应和硝酸酶还原法分别观察不同浓度AngⅡ在4h、12h和24h时对ECV304细胞的增殖率和细胞产生ROS(·OH和NO)的量.应用基因芯片技术和光镜分别检测0.0625和1μmol/LAngⅡ作用12h时ECV304细胞增殖作用的相关基因表达谱和细胞形态学变化.
