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3种丙型肝炎病毒结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建鉴定及表达
目的:构建能表达HCV不同结构基因(C、C+E1、C+E1+E2)的腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达HCV 不同结构蛋白的腺病毒载体做准备.方法:用分别含有Bgl Ⅱ及 Hind Ⅲ酶切位点的HCV不同片段结构基因上、下游引物,以含有HCV H 株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV 3种不同结构基因片段,基因片段回收后,分别以Bgl Ⅱ及 Hind Ⅲ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAd.CMVLink.1中CMV启动子下游Bgl Ⅱ与 Hind Ⅲ位点之间,获得3种重组腺病毒穿梭质粒pAd.HCV-C、 pAd.HCVCE1和 pAd.HCV-S(C+E1+E2).通过Bgl Ⅱ/Hind Ⅲ双酶切、聚合酶链反应(PCR)及插入片段序列测定对质粒进行了三重鉴定,以抗HCV C单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法及Western Blot检测了3种穿梭质粒在HepG2细胞中的瞬时表达.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,3种穿梭质粒的插入片段分别为HCV C、C+E1和C+E1+E2区基因片段,免疫荧光及Western Blot法检测表明其可以在HepG2细胞中瞬时表达.结论:构建的3种腺病毒穿梭质粒分别可以表达HCV 不同段的结构基因,为包装表达HCV不同结构基因的腺病毒载体奠定了基础.
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骨髓增生异常综合征RIZl基因启动子甲基化状态研究
视网膜母细胞瘤蛋白结合锌指结构基因(RIZ)是功能性筛选可与视网膜母细胞瘤(Rb)结合的蛋白质时分离而出[1].小同转录起始位点,可表达RIZ1及其替代蛋白RIZ2,RIZ1包含重要功能区域PR结构域,具有肿瘤抑制作用[2].RIZ1基因属于核组蛋白甲基转移酶超家族,可增加组蛋白H3第9位赖氨酸甲基化而增强基凶表达[3];RIZ1的基因产物可以与Rb DNA结合,抑制其转录,其编码的RIZ1蛋白与Rb蛋白结合,参与Rb途径,通过磷酸化Rb蛋白调节细胞周期,发挥抑癌作用[4];诱导癌细胞停滞于G2/M期和(或)诱导细胞凋亡,从而抑制癌细胞增殖.
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吉林省流行麻疹野病毒的核蛋白基因特征
麻疹是由副粘病毒科麻疹病毒属的麻疹病毒引起的急性传染病[1,2].研究发现,在麻疹病毒的6个结构基因中,除了血凝素蛋白(H)以外,核蛋白(N)的基因变化较大,其中N蛋白序列的羧基端450个核苷酸的区域属于高变区.为此,我们对麻疹病毒的核蛋白基因的分子生物学进行研究,为预测和控制麻疹的发生提供科学依据.
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COX-2在肿瘤组织的表达及其化学预防靶点的意义
环氧合酶(Cyclooxygenase,COX)是催化前列腺素生物合成的限速酶,能将花生四稀酸(AA)转化为前列腺素G2和H2.COX有两种形式,即COX-1和COX-2,它们在氨基酸序列上有60%的同源性,具有相同的酶活性.然而,尽管它们催化相同的反应,但具有不同的生物学功能[1～3].COX-1是哺乳类动物的结构基因,被称为看家基因,它参与胃粘膜的保护作用,调节肾血流,控制血小板聚集.而COX-2mRNA及蛋白质在正常组织几乎检测不到,但可被炎症前和丝裂原包括细胞因子、内毒素、白细胞介素和佛波酯所诱导[4～8],近年来发现COX-2在不同的肿瘤组织有高表达.本文综述了COX-2在不同肿瘤组织表达及其作为肿瘤化学预防靶点的意义.
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反复呼吸道感染患儿血浆甘露糖结合凝集素水平及其结构基因单核苷酸多态性分析
目的 研究儿童甘露糖结合凝集素(MBL)结构基因外显子1区单核苷酸多态性(SNPs)、血浆MBL水平与反复呼吸道感染(RRTI)的关系.方法 观察浙江大学医学院附属儿童医院2004-01-2005-10收治的反复呼吸道感染患儿60例,2005-05-2005-08入托体检儿童105名,其血浆MBL质量浓度的检测采用ELISA法,MBL基因SNPs分析采用序列特异性引物PCR法和序列分析法,统计分析采用SPSS软件11.0版.遗传学分析采用SHEsis软件.结果 105名健康儿童血浆MBL质量浓度范围为3～6025 ng/mL,中位数1065ng/mL;60例RRTI患儿MBL质量浓度范围为1～3633 ng/mL,中位数822ng/mL;RRTI组中低血浆MBL的个体所占比例明显高于健康组(x2=4.05,P＜0.050).健康组和RRTI组结构基因密码子54即+230位点的变异频率分别为0.167和0.283,两组该位点的等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡,RRTI组的变异频率显著高于健康组(x2=6.285,P=0.012);密码子52(+223位点)和57(+239位点)无突变,即无C和D型突变体发现.A/A、A/B和B/B型外显子表达的血浆MBL水平依次显著下降(x2=80.028,P≈0.000).结论 中国汉族人中MBL结构基因C和D型外显子罕见,而54号密码子的变异与小儿反复呼吸道感染之间可能存在相关关系.
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北方汉族人MBL EXON Ⅰ 52位基因频率调查
甘露糖结合凝集素(Mannan Binding Lectin,MBL)是一种由肝脏合成和分泌的急性时相蛋白,是Ca2+依赖性凝集素中胶凝素成员之一,可与甘露糖残基结合,参与细胞表面识别,广泛存在于人的肝脏和血液中,是天然免疫的重要组成部分,MBL基因多态性影响MBL水平,MBl的功能及基因结构和感染性疾病的关系近年来倍受关注[1,2].以往的群体研究已发现MBL存在3种结构基因的变异型D,B,C.其突变位点均位于外显子1,分别为52(CGT→TGT),54(GGC→GAC)及57(GGA→GAA)位密码子,并导致氨基酸的改变,影响了亚单位的空间结构和寡聚体的形成,从而形成无功能的蛋白.这样的蛋白大约95%被降解,所以具有变异型MBL的个体,其血清MBL水平低下,导致调理功能缺陷[3,4].本研究采用已建立MBL EXON Ⅰ 52位密码子突变检测的方法,即序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)[5],用该方法测定健康汉族人MBL基因EXON Ⅰ 52位密码子点突变的情况,为深入探索MBL基因突变引起调理吞噬缺损的机制和MBL分子的结构-功能关系及MBL在临床中的治疗应用奠定基础.
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蒙古族与回族人群MBL结构基因型及其与血浆蛋白浓度的关系
目的:分析内蒙古自治区蒙古族人群和宁夏回族自治区回族人群血浆甘露聚糖结合凝集素(MBL)的结构基因型,并探讨其与血浆蛋白浓度的关系.方法:用ELISA法检测血浆MBL浓度,用序列分析法分析MBL基因外显子1 区52、54和57密码子的单核苷酸多态性;统计分析采用SPSS软件11.0版,遗传学分析采用SHEsis软件.结果:79例蒙古族人和69例回族人血浆MBL浓度中位数分别为1 686和1 909 ng/ml,两组间无显著性差异(Z=0.63,P=0.4).蒙古族人群外显子1 A/A型、A/B型和B/B型分别占62.0%、35.4%和2.5%,而回族人群A/A型、A/B型和B/B型分别占58.0%、30.4%和11.6%,蒙古族和回族人群+230位点变异频率分别为0.203和0.268,两者变异频率无显著性差异(χ2=1.772,P=0.183).所有样本无C或D型外显子发现.A/A型外显子的血浆MBL浓度显著高于A/B型,后者又显著高于B/B型(χ2=86.526,P<0.01).结论:蒙古族和回族人群MBL基因只有A/A,A/B 和B/B 3种外显子基因型,A/A型结构基因MBL浓度显著高于A/B型,又显著高于B/B型.
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遗传性疾病基因诊断技术及进展
人类基因组计划(HGP)的工作框架图已经完成,不久将完成全部图谱.结构基因组学研究目标的顺利进展标志着以揭示基因组功能及调控机制为目标的功能基因组学和以揭示人类基因与疾病的关联的疾病基因组学的研究已成为HGP的新一轮计划.使已知的基因序列用于疾病的诊断和治疗是目前国内外许多实验室正在努力探索的课题,疾病的基因诊断有可能发展成21世纪临床医学的一个重要分支.1遗传性疾病中常见的分子缺陷遗传性疾病的产生是由于1个(或数个)基因发生异常导致了这些基因所载有的遗传信息受到改变,继而使蛋白质合成受影响.遗传性疾病中常见的分子缺陷主要包括点突变、片段性突变和基因表达异常.
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基因和人类基因组计划
基因(gene)是在生物进化中形成的含特定生物遗传信息的DNA分子片段和占一定位置的遗传单位,着力弄清基因何时何地具有活性,以及识别和确定基因所编码的蛋白质的特性是当前基因研究的方向.单基因虽只控制一种多肽的合成,因是构成许多蛋白质的亚基,故能影响不同部位、不同组织和不同器官的功能,即基因多效性.所以单基因病也可有很复杂的临床表现.基因的异质性是指几个不同基因,可分别作用于同一器官,产生相同的效应.基因由结构基因和调控基因所组成,能转录为mRNA,进一步翻译为多肽链.构成各种结构蛋白、酶和激素等的基因是结构基因.另外还有不能转录或只能转录而不翻译的核酸序列为调控基因,如各种重复序列、卫星、rRNA、tRNA等.在DNA链上,从蛋白质合成起始的密码子到终止密码子为止的连续序列称为开放阅读框架(open reading frame,ORP).在高等生物(原核生物未发现)基因信息常是裂解为许多DNA序列片段,称为外显子(exron),其中被不传递信息的片段所分割,称为内含子(intron ) .
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血红素氧合酶1的结构和基因调控的研究进展
血红素氧合酶 1(HO-1)为诱导型,生理状态下,在网状内皮细胞系统和骨髓表达,在肝脏、脾脏中以高浓度存在,而又以脾脏组织活动高,约为肝脏的10倍.可以被多种物质或刺激因素诱导表达,如热休克、缺血、辐射、低氧、高氧、重金属盐等.HO-1基因内含有HSE元件,是一种热休克蛋白,又称HSP32.目前研究证实HO系统有三种同工酶:HO-1、HO-2和HO-3.HO-2为结构型,除了化学诱生剂肾上腺皮质激素有诱导作用外,一般处于稳定状态不能被其他因素诱导,主要分布在脑组织、睾丸组织中,由CO发挥神经递质的功能,也与精子的产生和成熟有关.
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扩展青霉碱性脂肪酶结构基因的克隆与原核表达
目的 克隆并原核表达扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)结构基因.方法 提取扩展青霉总RNA,经RT-PCR扩增PEL结构基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a-PEL,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量,包涵体蛋白经变性、复性后,采用NaOH滴定法测定其酶活性.结果 经RT-PCR扩增获得约780 bp的PEL结构基因;所构建的重组表达质粒pET-28a-PEL经酶切及PCR鉴定正确;目的蛋白的相对分子质量约为28 000,以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;发酵液及复性的包涵体蛋白酶活性可达12.44 U/ml.结论 已成功克隆并原核表达了PEL结构基因,为获得碱性脂肪酶高产基因工程菌株奠定了基础.
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我国黄热疫苗株病毒结构基因片段遗传特征的分析
目的 分析中国使用的黄热疫苗株病毒结构基因片段的遗传特征.方法 从我国使用的黄热疫苗病毒中提取RNA,对病毒结构基因片段进行扩增及测序,将测序结果与GenBank中黄热病毒Asibi株及黄热病毒疫苗株17D-204和17DD相应的核苷酸序列进行比较.结果 中国黄热疫苗株在基因分子水平上具有17D疫苗株的基本减毒特征,与17DD株不同,与17D-204株更为相近.结论 中国黄热疫苗株源自17D-204株,是安全有效的减毒株,且具有自身特有的遗传特征.
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麻疹减毒活疫苗S191生产用毒株的遗传稳定性
目的 分析麻疹减毒活疫苗S191生产用毒株病毒结构基因的遗传稳定性.方法 将北京天坛生物制品股份有限公司(天坛生物)用于麻疹疫苗生产的S191株25代病毒(S191-BJ25)传至29代(S191-BJ29),上海生物制品研究所保存的S191株24代病毒(S191-SH24)传至33代(S191-SH33).从S191株传代病毒中提取RNA,对病毒结构基因片段N、M、F,H进行扩增及测序.将测序结果与GenBank中1994年收录的S191株麻疹病毒的相应序列进行比较分析.结果 S191-BJ25传代病毒N、M、F、H 4个基因的总突变率为0.02%,S191-SH2A传代病毒为0.15%;与1994年的S191疫苗株相比,S191-BJ25传代病毒N、M、F、H 4个基因的总突变率为0.3%,S191-SH24传代病毒为0.4%.结论 目前天坛生物使用的麻疹疫苗S191株生产用三级种子库具有可靠的遗传稳定性,从主代种子到疫苗的传代过程中,N、M、F、H结构基因表现出稳定的分子遗传特征.目前使用的S191毒株的4个结构基因较1994年以前的疫苗株发生了变化.但目前没有证据表明这些变化对免疫原性产生不利影响.
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创伤弧菌溶细胞素细胞毒性机制的研究进展
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌,存在于海水及海产品中.该菌主要引起原发性败血症和严重的创口感染.原发性败血症病人多发生低血容量性休克伴多脏器功能衰竭,病死率高.创伤弧菌感染的致病机制至今尚未完全阐明.动物实验发现该菌的毒力可能包含诸多因素,如胞外溶细胞素(VVC)、金属蛋白酶(弹性蛋白分解酶)、荚膜多糖(CPS)等.VVC是由结构基因vvhA编码的一种相对分子质量(Mr)为50 851的细胞外蛋白质,是一种能使细胞形成孔道的细胞毒素和溶血毒素,是创伤弧菌向胞外释放的唯一细胞毒素,由大多数致病菌株产生,具水溶性,对热不稳定,能溶解哺乳动物红细胞及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,具有血管渗透因子活性.经VVC注射的实验鼠可出现与创伤弧菌败血症病人同样的临床和病理表现,毫克以下水平即可对实验鼠致死.VVC在创伤弧菌感染致病机制中的确切地位尚有争议,但因其具有穿孔特性而颇受人们关注.目前对VVC的细胞毒性机制已有广泛研究和报道,但其确切机制尚未完全明了.本文将近年来国外有关研究的情况作一综述.
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海马结构基因表达差异及其功能分析
海马结构(hippocampal formation)的主要组成是海马和齿状回(dentate gyrus,DG),它们与大脑皮质和皮质下中枢有广泛的纤维联系,参与形成学习记忆.海马皮质从海马沟至脑室回依次为分子层、锥体层和多形层;齿状回皮质也分3层:分子层、颗粒细胞层和多形层,其神经细胞发出的纤维不超出海马结构范围.海马内锥体细胞规则排列,故结构比较一致.尽管如此,依据细胞形态、不同皮质区发育差异以及纤维排列不同,海马皮质亦能分为4个沿其长轴分布的不同亚区,即CA1、CA2、CA3、CA4区,且研究表明各亚区在基因表达方面也存在显著差别.
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甲状腺激素调节幼年大鼠海马Goα及Gsα基因表达的研究
甲状腺激素(TH)可直接或间接调控多种脑结构基因的表达[1],但TH和脑功能相关基因,尤其信号蛋白编码基因的调节关系,至今仍研究较少.
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人脑肿瘤端粒酶活性的研究
端粒是真核染色体末端的特殊结构,人端粒由6个碱基重复序列(TTAGGG)和结合蛋白组成 [1].端粒有重要的生物学功能,能够稳定染色体,防止其末端融合;保护染色体结构基因;调节正常细胞生长[2].
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用杆状病毒双穿梭载体表达系统表达HCV结构基因及HCV病毒样颗粒装配的初步观察
利用长RT-PCR技术,一次性克隆出HCV的结构基因C、E1、E2及部分5'UTR,经测序,验证了其正确性.将克隆基因插入杆状病毒双穿梭载体系统的转移载体,经转座并转染sf9细胞,得到重组病毒Bmhce,经SDS-PAGE和ELISA测定,表明HCV结构基因在重组病毒感染的sf9细胞中表达;另外,电镜观察发现在重组病毒感染的sf9细胞质的空泡(vesicle)中有HCV样颗粒的存在,说明HCV结构基因表达产物在sf9细胞中组装出病毒样颗粒.
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用连续长片段RT-PCR扩增HCV结构基因
目的与方法:使用连续长片段RT-PCR,扩增HCV的结构基因.结果:利用连续长片段RT-PCR技术,结合热启动和两段PCR一次扩增出长2.3kb的HCV结构基因和部分调控序列,并用测量分子质量和限制性酶切的方法进行了鉴定.结论:利用长片段RT-PCR可一次扩增出C、E1、E2基因和部分5'-NTR.
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HCV结构基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-S的构建、鉴定及表达
目的:构建能表达HCV结构基因(C+E1+E2)的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCV结构基因的腺病毒载体做准备. 方法:用分别含有Bgl Ⅱ及Hind Ⅲ酶切位点的HCV结构基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV结构基因片段,基因片段回收后,以Bgl Ⅱ及Hind Ⅲ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link.1中CMV启动子下游Bgl Ⅱ与Hind Ⅲ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-S.通过Bgl Ⅱ/Hind Ⅲ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定.以抗HCV C单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-S在人肝癌细胞7721中的瞬时表达. 结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd.HCV-S插入片段为HCV C+E1+E2区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达. 结论:构建的质粒pAd.HCV-S可以表达HCV结构基因,为包装表达HCV结构基因的腺病毒载体奠定了基础.
