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上皮间质转化在肿瘤中的分子机制研究
上皮间质转化(EMT)在早期的胚胎发育及后期的组织形态发生和器官形成过程中起着关键的作用,与肿瘤细胞的局部浸润和远处转移密切相关[1,2].肿瘤EMT发生重要的标志就是E-钙黏着蛋白(E-cadherin, E-cad)的表达下调或沉默,被认为是上皮细胞获得侵袭/转移能力的先决条件.
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莫诺苷对大鼠脑缺血再灌注皮层Wnt信号通路转录因子表达的影响
目的研究莫诺苷对脑缺血再灌注7 d患侧皮层Wnt信号通路相关转录因子神经发生素2(Ngn2)、Pax6、Tbr2表达的影响。方法健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组，模型组，莫诺苷小、中、大剂量组，每组3只。线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞模型，造模后3 h予莫诺苷30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃。Western blotting法分析术后7 d皮层Ngn2、Pax6、Tbr2的表达。结果与假手术组相比，模型组皮层Ngn2表达升高(P<0.05)；与模型组相比，莫诺苷中、高剂量组Ngn2表达明显升高(P<0.01)。模型组皮层Pax6的表达与假手术组无显著性差异，莫诺苷中、高剂量组Pax6表达升高(P<0.05)。各组间Tbr2的表达无显著性差异。结论莫诺苷能增加脑缺血再灌注后皮层Ngn2、Pax6的表达，提示有促进神经发生的作用。
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诱导多能干细胞在脊髓与周围神经疾病中的研究进展与前景
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)技术是于细胞领域的一门新兴技术,是通过向体细胞中导入特定转录因子,从而诱导体细胞重编程获得未分化的多能细胞的技术,通过这种技术获得的多能细胞有与胚胎干细胞类似的性能和多向分化能力.该技术在2008年被Science杂志评为十大科学突破之首[1].
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Nkx2.2和 Nkx6.1在宫内发育迟缓新生大鼠胰腺中的表达及临床意义研究
目的观察宫内发育迟缓新生大鼠胰腺中Nkx2.2和Nkx6.1的表达。方法研究时间为2012年6月至2014年12月。清洁级Wistar 大鼠，低蛋白饮食法建立宫内发育迟缓（IUGR）模型，摘取胰腺组织，称重，应用免疫组织化学法检测新生大鼠胰腺组织中Nkx2.2和Nkx6.1的表达。结果 IUGR 组新生大鼠胰腺组织重量显著低于对照组（P<0.05）。与对照组相比，IUGR 组胰腺表现为组织松散，胰岛面积减少，胰腺中Nkx6.1的表达明显低于对照组（P<0.05）。IUGR 组 Nkx2.2的表达面积低于对照组，光密度值略低于正常组，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论 IUGR 组Nkx6.1表达影响胰腺的发育，这可能是导致IUGR 大鼠成年期易罹患糖尿病的原因之一，对其进行深入研究将为新生儿胰腺功能发育障碍及先天性糖尿病的分子机制研究提供新的理论依据，并为开发新生儿胰腺功能发育障碍及先天性糖尿病的靶向药物提供了潜在的临床靶标。
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外源性 Nkx2.5、GATA4促进大鼠骨髓间充质干细胞的心肌分化
目的：：心脏早期转录因子Nkx2.5、GATA4转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨Nkx2.5、GATA4对大鼠BMSCs向心肌细胞分化的作用和影响。方法：全骨髓法分离、纯化、扩增培养SD大鼠BM-SCs,流式细胞术联合检测第三代细胞表面分子,CD90+/CD29+/CD45-细胞达95%以上。采用阳离子转染试剂LipofectamineTM2000将pEGFP-N1-Nkx2.5、pVP22-GATA4/myc-His质粒转染BMSCs。结果：转染4周后,Western blotting、免疫细胞化学结果表明,与空质粒组、空白对照组相比,Nkx2.5、GATA4显著提高转染组大鼠心肌细胞肌钙蛋白T(cardiac troponin T, cTnT)、连接蛋白43(connexin43, Cx43)的表达。免疫细胞化学结果显示Nkx2.5转染组、GATA4转染组中部分细胞呈cTnT、Cx43阳性,cTnT阳性细胞的胞质中可见棕黄色丝网状及颗粒样结构,Cx43阳性细胞的细胞质中可见棕褐色颗粒。透射电镜观察各组细胞超微结构变化,转染组大鼠心肌细胞的细胞质内出现大量平行排列的肌丝样结构,细胞侧面或细胞末端可见较多缝隙连接。结论：外源性Nkx2.5、GATA4能够促进BMSCs向心肌细胞分化。
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神经病理性疼痛诱导小鼠脊髓CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)表达上调
目的:观察神经病理性疼痛小鼠脊髓中C/EBPα的表达,探讨其对疼痛行为的影响.方法:小鼠腰5脊神经结扎(L5spinal nerve ligation,SNL)诱导神经病理性疼痛.在不同时间点取L5节段脊髓,通过实时定量PCR,Western blot和免疫荧光的方法,检测SNL术后脊髓中C/EBPα的表达变化;免疫荧光双标方法检测C/EBPα分别与神经元标志物NeuN、星形胶质细胞标志物GFAP,以及与小胶质细胞标志物CD11b的共定位情况;鞘内注射氯化锂观察对疼痛行为的影响.结果:SNL诱导小鼠脊髓内C/EBPα长时间表达上调;C/EBPα主要分布在脊髓神经元中,少量分布于星形胶质细胞,且大部分定位在细胞核.鞘内注射氯化锂缓解了神经病理性疼痛.结论:外周神经损伤诱导C/EBPα在脊髓背角神经元中表达.靶向抑制脊髓C/EBPα缓解神经病理性疼痛.
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缺氧诱导因子及其研究进展
缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)是20世纪90年代初,在研究低氧诱导的红细胞生成素(erythropoietin,EPO)基因表达时,从细胞核提取物中发现的参与氧稳态失衡调节的一个核心调节因子.HIF-1在哺乳动物和人体内广泛存在,是低氧活化的转录因子,直接或间接调节着血管生成、细胞增殖与凋亡、能量调节等众多通路.本文就HIF的结构、转录激活系统及其在红系生成、铁代谢稳态、固有免疫以及脂质代谢等方面的研究进展作一综述.
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CD39与调节性T细胞的研究进展
调节性T细胞(CD4+Treg)作为独立功能的T细胞群无可置疑,它具有抑制自身反应性T细胞的功能,是参与维持外周耐受的重要细胞群.大量报道证实转录因子Foxp3可作为CD4+Treg细胞的特异性分子标记,但其定位于细胞内限制了其在CD4+Treg细胞研究中的应用[1].CD4+Treg细胞的免疫抑制机制尚不十分明确,以往公认的机制主要有三种:细胞-细胞直接接触抑制、抑制性细胞因子的分泌、白细胞介素-2的清除[2].新近发现CD4+Treg细胞的胞外三磷酸核苷双磷酸水解酶CD39调控ATP产生的腺苷具有免疫抑制功能,腺苷通过与细胞表面腺苷1型嘌呤G蛋白偶联受体结合而发挥免疫抑制效应[3].CD39于1982年由Rowe等发现,在EB病毒感染的B淋巴细胞表面存在一种特殊的分子标记物,之后被命名为CD39[4].CD39是钙镁依赖的细胞外HTP双磷酸酶,能将ATP和ADP水解为单磷酸腺苷,目前研究发现CD39在抑制炎症反应、抵抗血小板聚集、免疫反应、细胞增殖等过程中发挥重要作用.在小鼠调节性T细胞上,CD39几乎表达在所有Foxp3+的调节性T细胞,而在人类,CD39主要表达在具有记忆活化的调节性T细胞中.
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KLF5转录因子对于人类癌症的重要作用及影响
KLF5，又称为BTEB2［1］和IKLF，属于KLF家族。 KLF5在不同组织不同层次中有着广泛的表达。作为一个基本的转录因子，KLF5调控很多重要靶基因如 cyclinD1，细胞周期蛋白 B， PDGFA以及FGF-BP。 KLF5在细胞周期调控，细胞凋亡，迁移和分化中具有必不可少的作用。大量证据表明，遗传变异的SP／KLF（ Kruppel样因子）转录因子参与各种人类疾病的发展，包括癌症和心血管疾病。 KLF家族几个成员，如KLF2，KLF4，KLF5， KLF6，KLF8，已证实在各种癌症中发挥着至关重要的作用。近年来，对于 KLF5的研究已经有了显著发展。本文主要阐述KLF5与人类癌症的关系，并提出今后的研究方向。
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生长分化因子-15基因多态性的研究进展
生长分化因子-15(GDF-15)的基因定位于染色体19p12·13.1,由两个外显子组成,被一个长约1800个碱基对的内含子分隔开来….外显子I由309个碱基对组成,其5'一端非翻译区有71个碱基对.外显子Ⅱ由647个碱基对组成,其3'-端的非翻译区有244个碱基对.GDF-15基因的启动子区域包含两个p53和Egrl的结合位点,这是两种在GDF·15诱导表达过程中起关键作用的转录蛋白ⅢJ,也是与心血管疾病密切相关的转录调节蛋白"".GDF.15基凶的5'端有转录因子AP.1的潜在结合位点….因此推测p53、Egrl和AP.1可能是诱导GDF-15表达的上游分子,各种细胞损伤因素通过激活p53、EKrl或AP-l来诱导细胞高表达GDF·15.GDF.15基因很可能是一个在应激条件下被诱导表达的可调控基冈,在体内发挥抗炎症、促进肿瘤细胞凋亡和抑制生长的作用,执行广泛的保护功能.
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第二心脏发育区在心脏发育中的研究进展
先天性心脏病（ congenital heart disease ，CHD）是指胎儿时期心血管系统发育异常对心功能产生了实际或潜在影响的先天畸形，CHD是常见的出生缺陷之一，在活产婴儿中的发病率约为0.6％～0.8％［1］。第二心脏发育区（second heart field，SHF）前体细胞在心脏螺旋成型过程中加入线性心管，参与心脏的右心室和心脏流出道的形成。该细胞异常发育将导致CHD形成。本文就近年来发现参与调节SHF心脏前体细胞发育的信号通路和转录因子作一系统综述。
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PEA3转录因子在卵巢癌发生中作用的研究进展
卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,常见的病理类型为上皮性卵巢癌.卵巢癌起病隐匿,早期症状不明显,大约75%卵巢癌患者就诊时已属晚期(Ⅲ、Ⅳ期)[1].因此多数卵巢癌患者错过了佳治疗时间,导致晚期卵巢癌的5年生存率偏低,大约为30%[2].近年来,以铂类联合紫杉醇化疗对约80%卵巢癌患者有明显的临床疗效,但其中50%～80%在初治1～2年后复发,并且复发后对化疗药物出现耐药性,卵巢癌的5年生存率并无根本改善.关于卵巢癌病因和发展的研究机制还尚未明确.肿瘤的局部浸润和远处转移是癌症患者死亡的主要原因,这两个过程是肿瘤细胞与细胞外基质相互作用的结果,其中基质金属蛋白酶(MMPs)[3],尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA)[4]和血管生成因子(VEGF)[5]起主要作用.有研究表明,在卵巢癌中细胞外信号通过激活多瘤促活化因子(polyoma enhancer activator 3,PEA3),从而导致肿瘤的浸润和转移[6].现就PEA3转录因子在卵巢癌发生中研究进展作一综述.
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缺氧诱导因子与肝癌关系的研究进展
缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是一种广泛存在于人及哺乳动物体内的转录因子，可以上调包括血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMPs）、糖酵解酶、促红细胞生成素（EPO）等百余种靶基因的表达，是细胞在缺氧应答反应中重要的调节因子之一，同时与肿瘤，尤其是实体瘤关系密切，可能是肿瘤发生、发展、化疗耐药和侵袭转移的关键因子。目前发现的缺氧诱导因子成员有HIF-1[1]、HIF-2[2]、HIF-3[3]三种。三者在结构和表达调控上有相似之处，且在肝癌中都存在表达异常，但肝癌的关系不并不相同。本文综合目前国内外的文献报道，对三者同肝癌的关系作一综述。
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系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中 Toll 样受体9和Foxp3的表达及二者相关性
目的：检测系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞中转录因子Toll样受体9（TLR9）和Foxp3在的表达，并探讨其意义以及二者的相关性，明确TLR9和Foxp3在SLE中的作用和意义。方法选择泰安市中心医院和山东大学齐鲁医院2012年10月至2014年6月门诊或住院SLE活动性患者33例、SLE非活动性患者30例，查体中心健康查体者23例作为正常对照，运用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测正常对照组和SLE患者外周血单个核细胞中Foxp3和TLR9 mRNA的表达水平。结果活动性SLE患者外周血单个核细胞中TLR9 mRNA的表达水平明显高于SLE非活动性患者和正常对照（P＜0.05），非活动性SLE患者TLR9 mRNA的表达水平高于正常对照（P＜0.05）。TLR9 mRNA水平与SLE疾病活动指数（SLEDAI）呈正相关（r=0.702，P＜0.05）。活动性SLE患者外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA的表达水平明显低于SLE非活动性患者和正常对照（P＜0.05），非活动性SLE患者Foxp3 mRNA的表达水平低于正常对照（P＜0.05）。Foxp3 mRNA水平与SLEDAI呈负相关（r=－0.681，P＜0.05）。在SLE患者外周血单个核细胞中TLR9和Foxp3的表达呈负相关。结论 SLE患者TLR9的表达与疾病活动性呈正相关，而Foxp3的表达与疾病活动性呈负相关。TLR9和Foxp3之间可能存在相互调节的作用，共同导致SLE的发生和发展。
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胃癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞55例分析
临床上,胃癌是我国常见的腹部恶性肿瘤,已有不少研究显示,恶性肿瘤的发生发展与肿瘤患者的免疫功能密切相关.检测胃癌患者的免疫功能状态,对于探讨胃癌的发病机制(如免疫逃逸)和寻求新的治疗方案具有重要的临床价值.目前认为,T淋巴细胞在肿瘤患者的免疫系统中发挥着重要的作用,而CD4+辅助性T细胞是其中尤为重要的组成部分,包括以下4种类型的免疫细胞:Th1、Th2、Th17和调节性T细胞.近年来,发挥免疫耐受和免疫抑制功能的CD4 +CD25 +Foxp3+调节性T细胞群(regulatory T cells,Tregs)成为了肿瘤学者的热门对象[1-4],其中Foxp3是转录因子P亚家族的成员,其表达情况与CD4+CD25+Tregs发育和功能状态的关系十分密切[5].
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X-连锁迟发性脊柱骨骺发育不良家系TRAPPC2基因突变分析
目的 探讨使用PCR为基础的毛细管电泳法对1个中国X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(X-SEDT)家系进行基因突变分析和携带者筛查的可行性.方法 收集X-SEDT家系6名成员外周血样本,PCR扩增TRAPPC2基因第3、4、5和6外显子及侧翼DNA序列,采用琼脂糖电泳检测、荧光标记片段毛细管电泳分离方法进行片段分析,同时进行PCR产物直接毛细管电泳测序,检测TRAPPC2基因突变情况；使用荧光标记片段法进行携带者筛查,DNA直接测序对筛查结果进行验证.结果 先证者和先证者母亲分别携带TRAPPC2基因c.262_266delGACAT(D88del；I89fX12)缺失突变和杂合缺失突变,该突变在中国群体中为首次报道,先证者2个姐妹筛查结果显示,先证者大妹妹携带c.262_266delGACAT缺失杂合突变,先证者小妹妹未携带此突变.结论 TRAPPC2基因c.262_266delGACAT突变是该X-SEDT家系的致病原因,对TRAPPC2基因的微小缺失型突变,采用PCR结合毛细管电泳法进行DNA测序和片段分析可用于X-SEDT分子诊断和携带者筛查.
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早幼粒细胞白血病蛋白在髓系白血病细胞中的表达及对细胞增殖的影响
目的 探讨早幼粒细胞白血病(promyelocyte leukemia,PML)蛋白在髓系白血病中的表达及其对人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞增殖的影响.方法 采用实时荧光定量PCR技术检测了30例慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者及24名健康对照者外周血单个核细胞中PML mRNA水平的差异.构建PML的真核表达载体,转染K562细胞后筛选出稳定表达PML的细胞株,以稳定表达空载体的细胞为对照.四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞术分别检测PML过表达对细胞增殖和细胞周期的影响,并进一步用反转录-PCR(RT-PCR)和蛋白质印迹技术(Westernblot)检测增殖相关因子c-myc和p27kip1(p27) mRNA水平以及蛋白表达水平的改变.后检测了CML患者及健康对照者外周血单个核细胞中c-myc和p27 mRNA水平的差异.结果 CML患者外周血单个核细胞中PML mRNA表达水平(△Ct=9.02±0.74)明显低于健康对照组(△Ct =7.91 ±0.34),差异有统计学意义(t =5.07,P＜0.001).PML过表达能明显抑制K562细胞增殖,引起细胞周期G0/G1期阻滞.PML稳定表达的K562细胞中,c-myc的mRNA和蛋白表达水平降低,p27的mRNA和蛋白表达水平升高.CML患者外周血单个核细胞中c-myc的mRNA表达水平(△Ct =7.13 ±0.43)显著高于健康对照组(△Ct =9.35 ±0.82),差异有统计学意义(t=6.78,P＜0.001),而p27的mRNA表达水平(△Ct =4.56±0.58)则显著低于健康对照组(△Ct=3.29±0.92),差异有统计学意义(t=2.93,P＜0.01).结论 PML在CML患者中低表达,PML可能通过调节c-myc和p27的表达从而抑制白血病细胞的增殖.
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MALDI-TOF MS技术快速区分携带rmpA2毒力基因的高毒力肺炎克雷伯菌
目的 评价基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术快速区分携带rmpA2毒力基因的高毒力肺炎克雷伯菌的能力.方法 对浙江大学医学院附属第二医院和河南省人民医院的57株肺炎克雷伯菌,PCR扩增rmpA2毒力基因和荚膜血清型基因,多位点序列分型方法(MLST)进行分型,拉丝试验进行高黏液表型测定.MALDI-TOF MS对肺炎克雷伯菌进行鉴定并对峰图进行二维分析和算法统计,包括采用支持向量机算法(SVM),遗传算法(GA),监督使神经网络算法(SNN)和快速分类算法(QC)进行数据分析并建立相应模型,得到分型区分的特征峰.结果 57株肺炎克雷伯菌中有28株携带rmpA2毒力基因,MLST均为ST11型,其中拉丝试验阳性有5株;29株不携带rmpA2毒力基因,主要ST型为ST11(n=23),还包括ST15(n=3),ST1、ST76和ST473各一株.质谱将肺炎克雷伯菌较清晰地划分成两个区域,ClinProTools软件可准确区分84.2%(48/57)的菌株.ClinProTools软件四种算法结果基本相似,SVM特异性和灵敏度高,分别为93.23%和100%.采用ClinProTools对质谱峰进行统计显示,得到区分rmpA2基因阳性组和阴性组的2个特征峰分别为7168.9和7280.76,在峰强度上存在一定的差异.结论 MALDI-TOF MS快速区分携带rmpA2毒力基因的高毒力肺炎克雷伯菌方法灵敏度和特异性都在90%以上,得到两个特征峰在峰强度上存在一定差异,需进一步验证.
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X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良家系的基因诊断
目的 探讨一个X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)家系发病的分子机制,建立基因诊断方法 .方法 采用身高测量、影像学检查殚及家系分析进行临床诊断.收集相关家系成员的外周血标本.提取基因组DNA后,采用PCR-SSCP和DNA测序分析家系中先证者、携带者和健康人SEDL基因的第3～6外显子.利用微卫星位点DXS16进行连锁分析.结果 PCR-SSCP检测到先证者第4外显子有异常泳动带;第4外显子的序列分析表明3例先证者均存在C.218C＞T突变,导致氨基酸序列S73L改变,3例携带者均存在该核苷酸位点的杂合突变,健康人未见突变;先证者的第3、5和6外显子核酸序列未见突变.序列分析证实家系中3名未婚女性Ⅲ10、Ⅳ6和Ⅳ7为致病基因携带者.结论 C.218C＞T突变是导致该家系发病的分子机制,可采用第4外显子序列分析对该家系进行基因诊断和产前基因诊断.
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利用DNA结合活性检测核转录因子C/EBPβ方法的建立
目的利用C/EBPβ具有DNA结合活性的特点,建立检测核转录因子C/EBPβ的方法.方法研究特异的寡核苷酸序列,建立分子探针标记、拟合补偿曲线并研究DNA分子与转录因子特异结合的相关实验参数.结果γ-32P-ATP为20 pmol, C/EBPβ寡核苷酸浓度为4 pmol 时,分子探针活性高,掺和效果好;活性变化回归拟合呈线性关系,r2=0.975;应用此研究体系参数可检测到0.5 μg的核转录因子DNA结合活性,C/EBPβ条带和未结合寡核苷酸分子探针的游离带清晰、特异.结论此方法特异性好,可用于鉴定特定基因调控序列中是否存在C/EBPβ结合位点或细胞核蛋白中是否存在C/EBPβ以及C/EBPβ对特定转录过程的调控作用.
