160六价铬诱导P53蛋白活化的机制

本研究探讨了Cr(Ⅵ)诱导P53活化的机制.培养人肺上皮细胞系A549并进行传代.取3×105A549细胞转入一个6孔平皿,于37℃下温孵24h,立即转染1μg报告质粒和1μg β-半乳糖苷酶(β-Gal)质粒,温孵过夜后冲洗,加入含10%FBS的F-12K培养基,再培养24h后加入5、10、20、50和100μmol/L的Cr(Ⅵ)溶液处理(未经处理的为对照),然后加入400μl报道溶解缓冲液,在4℃下抽提细胞2h;取80μl细胞溶解产物测量虫荧光素酶和β-Gal活性,结果以β-Gal标化的相对P53活性(与对照相比)来表示.另取经Cr处理后的A549细胞,抽提细胞经声处理断裂DNA和减少粘度,然后取20μl全细胞溶解产物加热、离心,进行蛋白印迹分析(Westernblot).取细胞溶解产物、20μlRecin/TNT(1:10)和10μg抗体在4℃下温孵过夜并离心,取上清进行Western blot反应.

1-08 反式BPDE诱发人支气管上皮细胞系P53基因突变

目的检测苯并(a)芘的代谢产物反式-BPDE诱发的人支气管上皮细胞系P53基因突变,探讨苯并(a)芘在人肺癌发生中的作用.方法用反式-BPDE处理人支气管上皮细胞系(16HBE),银染PCR-SSCP方法检测P53抑癌基因第5、6、7、8外显子的点突变情况.结果 20d后,经反式-BPDE处理的人支气管上皮细胞系与对照组相比,P53基因第8外显子出现异常泳动带.结论反式-BPDE可诱发人支气管上皮细胞系P53基因突变,可能是苯并(a)芘诱发肺癌的早期分子事件.

大鼠肺泡II型上皮细胞系RAE-1的建立及其生物学特性

建立肺泡II型细胞系为研究细胞恶性转化提供实验模型.采用Nycodenz密度梯度离心法分离了大鼠肺泡II型上皮细胞,原代培养大鼠肺泡II型上皮细胞并将SV40病毒的早期区大T基因转导入上皮细胞,建立了可在体外长期稳定传代的细胞系RAE-1.对此细胞系的生物学特性分析表明:细胞的基因组中整合了SV40T基因;染色体分析以非整倍体为主,众数染色体为44条;细胞不能在软琼脂上形成克隆;除了转化特性以外,RAE-1细胞仍保留了正常的上皮组织角蛋白Ck8、Ck18的表达.

地高辛抑制豚鼠心室肌细胞Na+,K+-ATP酶和人胚肾上皮细胞系HERG钾通道电流

强心苷类药对Na+,K+-ATP酶的作用在低浓度时为兴奋、在高浓度时呈抑制作用[1].应用膜片钳技术观察地高辛(Digoxin)对豚鼠心室肌细胞Na+,K+-ATP酶电流(Ip)的作用还未见报道.此外,由于很多药物的心脏不良反应是通过抑制人ether-a-go-go-related基因(HERG)编码的快速激活的延迟整流钾通道(Ikr)而引起QT间期延长和尖端扭转性室速(TdP)[2].本研究初步探讨地高辛对豚鼠心室肌细胞Ip电流和对人胚肾上皮细胞系(human embryonic kidney cell line,HEK-293)上HERG/Iκr钾通道的影响及地高辛治疗心功能不全和引起心脏毒性反应的机制.1材料与方法1.1动物、细胞系、质粒来源及地高辛配制:普通级豚鼠,8～12周龄,体质量250 ～ 300 g,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供[合格证号SCXK(鄂)2004-007].HEK-293细胞,中国科学院上海生科院细胞资源中心.编码Ikr的HERG基因的真核细胞表达载体pcgi-EGFPHERG(南京师范大学生命科学院张朝教授馈赠).地高辛(郑州大学药学院药物化学研究所提供)溶于二甲基亚砜中配制成10 mmol/L的母液.

双歧杆菌黏附素的提纯及鉴定

目的:双歧杆菌已广泛应用于益生菌及发酵乳的研制.由于双歧杆菌黏附于肠黏膜表面是其发挥作用的首要条件,开展对其黏附机制的研究有着重要意义.但目前有关双歧杆菌与肠黏膜上皮细胞的黏附机制所知不多,我们从青春型双歧杆菌中分离及纯化其黏附素.方法:黏附试验为检测青春型双歧杆菌与人肠上皮细胞系Lovo细胞间的黏附.收集双歧杆菌培养上清并用300 g/L硫酸铵沉淀,在4℃下8000r/min离心30min收集沉淀物.沉淀物溶解于0.01 mol/L pH7.4 PBS,加入至0.02 mol/LpH7.0 PBS平衡的Superdex 75柱中进行洗脱,速度为0.7mL/min,226 nm波长检测光密度ABS值.收集合并活性组分,冷冻干燥.干燥物溶解后加入至0.05 mol/L pH8.0PB平衡的Q-Sepharose FF柱中,先用同一缓冲液洗脱,然后分别用含0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L及1.0mol/L氯化钠的0.05 mol/L,PB进行阶段洗脱,速度为1.5 mL/min,检测各峰黏附活性,活性组分用SDS-PAGE进行分析.结果:使用硫酸铵沉淀对双歧杆菌黏附素进行了分离,沉淀物进一步经Superdex 75凝胶过滤和Q-SepharoseFF离子交换色谱纯化.结果黏附素不能结合与Q-Sepharose柱,经SDS-PAGE分析,证实纯化的黏附素成分基本单一,其M约为16ku.结论:双歧杆菌黏附素可能为一种M 16 ku的蛋白质,并且存在于培养液上清中.

人乳头状瘤病毒16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系的建立

人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是目前已知的三大DNA致癌病毒之一,具有嗜上皮寄生的特性,其中16型、18型是高危致癌型.许多学者利用HPV的这一致癌特性,相继建立了人口腔、食管、支气管、子宫颈等上皮的永生化细胞株[1-3],为研究这些部位的肿瘤提供了良好的体外模型.HPV也可能与喉癌的发生密切相关,但一直缺乏直接的证据[4,5].本实验应用含有HPV16 DNA的质粒转染正常人喉上皮细胞,试图建立永生化人喉上皮细胞系并确证HPV与喉癌的发生有无因果关系.

三氧化二砷抑制人晶状体上皮细胞系HLE-B3作用的研究

三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)是中药砒霜的有效成分,我国学者应用As2O3作为抗肿瘤药物临床治疗急性早幼粒细胞性白血病,取得了满意的疗效[1].

N-甲基卟啉辐射增敏效应的实验研究

N-甲基卟啉(N-CH3PPH2)是上世纪90年代的新产品,在理论上具有抗癌作用强及副作用小的特点,笔者通过第2代血卟啉衍生物(YHPD)与N-甲基卟啉对食管鳞癌上皮细胞系(Ec-109)辐射增敏作用的比较,探讨了N-甲基卟啉的辐射增敏作用.

8 PDX-1转染的肠上皮细胞在肾小囊中可分泌胰岛素(ADA 2001年会,23-OR)

PDX-1在胰腺发育早期具有重要的作用.近的研究表明PDX-1可使非β细胞表达β细胞特异性基因.日本的研究者将PDX-1基因平稳地转染至大鼠未分化肠上皮细胞系IEC-6后该细胞可表达不同的β细胞特异性基因,如胰岛淀粉样多肽(IAPP)、葡萄糖激酶及NKx6.1(这些在原代IEC-6细胞中却检测不到),却不能表达胰岛素.将PDX-1(+)IEC-6细胞形成的细胞聚集物移植入成年雄性SD大鼠的肾小囊.14 d后,免疫组化分析显示PDX-1(+)IEC-6细胞聚集物中有胰岛素分泌,而经过同样处理的PDX-1(-)IEC细胞聚集物却无此变化.体外应用betacellulin(BTC) 治疗也获得相似的结果,而应用胰岛素样生长因子-1、转化生长因子-α则未发现该结果.进一步证实了BTC可促β细胞分化,同时肠上皮细胞可作为糖尿病基因/细胞治疗的工具,也阐明了胰腺发育过程中转录因子的不同作用.

幽门螺杆菌致癌性的体外研究进展

1994年幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)被WHO的国际癌症研究机构(IARC)确定为Ⅰ类致癌因子,但至今Hp的确切致癌机制仍不是很清楚.大多体外研究结果显示在慢性胃炎-萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-胃癌这样一个漫长的过程中,Hp可能作用于胃癌发生的早期阶段.Hp可通过许多途径导致上皮细胞发生一系列损伤改变,胃癌的发生与基因的损伤、突变、细胞内信号传导的改变及细胞增殖/凋亡的失平衡等有关.本文收集近年来利用幽门螺杆菌与体外胃上皮细胞系共同培养研究Hp对胃上皮细胞的致癌作用的相关论文,从Hp对共培养胃细胞粘附、增殖、细胞周期、凋亡、基因改变等方面机制研究的新进展进行综述.

幽门螺杆菌空泡毒素诱导人胃上皮细胞系发生凋亡

幽门螺杆菌对胃上皮细胞系SGC-7901细胞生长的影响

研究证明，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是引起慢性B型胃炎的病因，是消化性溃疡的重要致病因子，且与胃癌发生有关[1]。关于HP引起胃黏膜病变的确切机制，尚未完全明了。为了认识活体条件下Hp的发病机制，本研究用体外细胞培养技术，观察了HP活菌对胃上皮细胞系生长与增殖的影响。

EB病毒介导的鼻咽上皮细胞永生化早期阶段的生物学观察

目的:鼻咽癌是我国南方地区高发的恶性肿瘤之一,长期以来,对鼻咽癌发病分子机制未能彻底阐明,关键问题之一是缺乏一个良好的体外多阶段细胞模型.虽然利用EB病毒已建立了数个灵长类上皮细胞系,但是,EB病毒转化的人鼻咽上皮永生化细胞系尚为空白.目前认为,上皮细胞永生化呈多阶段,即上皮细胞增殖--逃避老化期(Senescence)--逃避危机期(Crisis)--进入永生化(Immortalization),其中,逃避Senescence可能是上皮细胞永生化的初阶段.方法:借助EB病毒和TPA的体外协同作用,采用相差显微摄影、间接免疫荧光、Senescence相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、细胞生长曲线及群体倍增时间等检测方法,我们对12例EB病毒感染的原代人胚鼻咽上皮细胞生长过程进行了观察.结果:EB病毒感染的原代鼻咽上皮细胞表达EB病毒瘤基因产物LMP1,并随着培养时间的延长,对SA-β-Gal表达呈现从弱到强再到弱的趋势.在原代培养后期,SA-β-Gal表达阳性率降低,提示EB病毒促使部分鼻咽上皮细胞逃离了Senescence、进入永生化早期阶段.作进一步的生物学观察表明,处于该阶段的鼻咽上皮细胞具有部分转化特征,表现为细胞形态学发生改变,从原来扁平而紧密的镶嵌状排列,逐渐变成立体感增强,细胞体积变小,分裂相增多.原代培养后期可观察到明显的转化灶,细胞生长活跃,与正常培养的鼻咽上皮细胞呈现的老化形成明显的对照.经传代后,细胞呈岛状重叠生长,提示永生化早期阶段的鼻咽上皮细胞具有去接触抑制生长的特性.细胞生长曲线检测进一步表明,其群体倍增时间降低,提示EB病毒促使永生化早期阶段的鼻咽上皮细胞进一步生长.结论:EB病毒促使体外培养的鼻咽上皮细胞通过Senescence时期、进入永生化早期阶段,并初步具有体外转化特征,为进一步阐明上皮细胞永生化分子机制及建立人鼻咽上皮细胞永生化模型提供实验依据.

大气污染细颗粒中有机成分苯并芘直接引起人Ⅱ型肺上皮细胞慢性炎症

目的和方法：本课题着重研究高污染北京地区冬季是否增加患慢性阻塞性肺病（ COPD）患者对PM2．5暴露引起肺泡慢性炎症反应的易感性及其机制。同时通过大流量采样器连续收集北京地区冬季PM2．5的组分进行组分分析，分析表明有机物苯并芘（ BaP）是其重要的组分之一。因此进一步通过离体培养人Ⅱ型肺上皮细胞系A549细胞的实验观察BaP是否直接引起A549细胞慢性炎症或放大由内毒素（ LPS；低剂量，1μmol／L）引起的慢性炎症及其机制。结果：20例COPD患者呼出气冷凝液的亚硝酸盐水平、血清炎性趋化因子白细胞介素8（ IL－8）水平均升高，与这些病人前3～4天暴露于室外PM2．5浓度水平升高呈正相关。而培养的A549细胞实验表明，给予BaP（1、2、4和8μmol／L，24 h）呈剂量依赖方式直接刺激诱导型一氧化氮合酶（ iNOS）蛋白表达明显增加。结论：PM2．5暴露可能通过其有机成分BaP直接引起人Ⅱ型肺上皮细胞慢性炎症，其分子机制还需进一步研究。

白细胞介素15在生殖领域的研究进展

白细胞介素15(IL-15)属于Tn1相关性细胞因子,它首先由GRABSTEIN等[1]在1994年从无血清培养基培养的猴肾上皮细胞系CV-1/EBVA的培养上清液中纯化而得,是一种能维持CTLL-2细胞系增殖的可溶性细胞因子.它具有广泛的生物学作用:刺激CTLL和PHA激活外周血B细胞增殖;刺激鼠抗原特异性T细胞(包括Th和Tc)的增殖[1];对人外周血T细胞具有化学趋化性[2];增强抗人IgM抗体或佛波酯活化B细胞的增殖反应,并诱导这些B细胞产生IgM,IgG和IgA[3];促进NK细胞增殖[4-5]等.近年来研究表明,IL-15在多种免疫性疾病中发挥作用,但在生殖领域的作用还未十分明了,本文综述了IL-15的分子生物学特性及在生殖领域的研究进展.

蛋白酶激活受体2激动剂诱导肺上皮细胞分泌IL-8

目的探讨蛋白酶激活受体(PAR)-2激动剂对人上皮细胞白细胞介素-8(IL-8)分泌的影响.方法人肺上皮细胞系A549细胞分别接种于12孔培养板各孔内,并分别用不同浓度的PAR-2激动剂,反PAR-2激动剂进行刺激.刺激时间为2h、8h和16h.用ELISA方法检测上清液中IL-8的分泌水平.结果经过16h的培养,PAR-2激动剂SLIGKV和tc-LIGRLO均可引起浓度相关性IL-8的释放增加,tc-LIGRLO引起的大IL-8释放量达基础分泌量的6倍.反PAR-2激动剂对IL-8释放的影响较小.时间相关曲线表明,PAR-2激动剂的作用从2h开始,16h达高峰.结论 PAR-2激动剂是高效的人肺上皮细胞IL-8的促分泌剂.其拮抗剂有可能具有抑制呼吸道炎症的作用.

蛋白酶激活受体1介导人肺上皮细胞分泌MCP-1

目的探讨蛋白酶激活受体1(protease-activated receptors1,PAR1)激动肽和凝血酶对人肺上皮细胞单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)分泌的影响.方法人肺上皮细胞系A549细胞分别接种于12孔培养板各孔内,并分别用不同浓度的PAR1激动肽SFLLR和反PAR1激动肽RLLFS以及不同浓度的凝血酶和/或凝血酶抑制剂水蛭素进行刺激,刺激时间为2、16 h.用ELISA方法检测上清液中的MCP-1水平.结果经过16 h的培养,PAR1激动剂SFLLR可引起浓度相关性MCP-1的释放增加,增加到300μmol/L时诱导MCP-1的释放量比基础分泌量增加了近12倍,反PAR1激动剂RLLFS不能引起MCP-1的释放增加.凝血酶也可引起浓度相关性MCP-1释放,凝血酶在浓度3 000 U/L时就可引起MCP-1释放量增加,10 000 U/L时诱导MCP-1的释放量达高峰,为基础分泌量的5倍.凝血酶抑制剂水蛭素可以抑制凝血酶对MCP-1的释放作用.时间相关曲线表明,从2 h起即可引起PAR1介导的MCP-1释放增加,16 h达高峰.结论PAR1激动肽和凝血酶可促进人肺上皮细胞分泌MCP-1,PAR1拮抗剂和凝血酶抑制剂可能具有抗炎作用.

卵巢癌分子基因学研究现状

卵巢癌在妇女生殖道癌瘤中,死亡率高.约60%～70%的患者在得到诊断时已属晚期,严重危害妇女的生命.卵巢癌多系卵巢上皮细胞恶变发展而来.导致细胞恶变的生物学机制尚不明确.随着肿瘤分子生物学遗传学技术的迅猛发展,研究者们已逐步认识到卵巢癌的发生,同其他肿瘤一样,是多步骤、多基因现象的结果.癌基因的激活及抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础.因此,卵巢癌的分子基因学研究对科学工作者来说将是一个重要挑战.本文就与卵巢癌相关的癌基因、抑癌基因的分子基因学研究现状作一综述.1 卵巢癌癌基因1.1 erbBl基因 c-erbBl/EGF基因编码一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的生长因子受体.c-erbBl/EGF受体在54%的卵巢癌中表达,它的存在与无病生存期长有关.EGF受体的过度表达仅占卵巢癌的9%至17%[1].有报道表明EGF受体存在自发重组,常见的是在EGF受体275-1075核苷酸序列发生缺失形成的Ⅲ型EGF受体变异(EGFRvⅢ).用特异的抗体检测发现73%的卵巢癌存在这种突变基因,这些肿瘤多是分级高、分期晚的卵巢上皮性肿瘤.8个卵巢癌细胞系中5个表达EGFRvⅢ,而在卵巢正常组织和卵巢上皮细胞系中无表达.EGF受体的这种变异在肿瘤癌变中的作用尚不明确,由于受体变异和肿瘤发生有关系,抗EGFRvⅢ受体的基因治疗将帮助我们治疗卵巢癌[2].

人正常泌尿系上皮细胞系作为组织工程化尿道种子细胞的可行性研究

目的:研究人正常泌尿系上皮细胞系(SV-HUC-1)在传代20代之后的性质变化,探讨将其作为组织工程化尿道研究种子细胞的可行性.方法:对于SV-HUC-1传代20代的细胞进行形态观察,应用RT-PCR法和间接免疫荧光法检测细胞标志蛋白表达.应用Cell TrackerTMBlue CMF2HC,进行活细胞示踪研究.结果:对于第20代SV-HUC-1细胞,应用倒置相差显微镜观察生长到其形态正常.应用RT-PCR法和间接免疫荧光法均检测到第20代SV-HUC-1细胞中Vimentin和CK-18的mRNA表达.应用研究活细胞示踪研究,在第20代SV-HUC-1细胞中加入活细胞示踪剂Cell TrackerTMBlue CMF2HC后,发现SV-HUC-1细胞生长良好.结论:SV-HUC-1细胞能够正常生长传代20代,形态正常,能够表达泌尿系上皮细胞的标志蛋白,并能以活细胞的方式进行示踪和观察.SV-HUC-1细胞系是适合作为尿道组织工程实验用的种子细胞.

蛋白酶激活受体2激动剂诱导上皮细胞分泌MCP-1

目的:探讨蛋白酶激活受体(PAR)-2激动剂对人上皮细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)分泌的影响.方法:人肺上皮细胞系A549细胞分别接种于12孔培养板各孔内,并分别用不同浓度的PAR-2激动剂,反PAR-2激动剂进行刺激.刺激时间为2,8和16 h.用ELISA方法检测上清液中的MCP-1水平.结果:经过16 h的培养,PAR-2激动剂SLIGKV和tc-LIGRLO均可引起浓度相关性MCP-1释放增加,tc-LIGRLO引起的大MCP-1释放量达基础分泌量的13倍.反PAR-2激动剂对MCP-1释放的影响较小.时间相关曲线表明,PAR-2激动剂的作用从2 h开始,16 h达高峰.结论:PAR-2激动剂是高效的人肺上皮细胞MCP-1的促分泌剂.其拮抗剂有可能具有抑制呼吸道炎症的作用.